一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法

摘要

本发明涉及一种中国被毛孢原生质体制备与再生方法，所述方法是通过以氯化钾溶液为渗透压稳定剂，以商品酶Driselase from Basidiomycetes sp，Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和Yatalase作为复合酶进行酶解，能够制备得到含量高的中国被毛孢原生质体并成功再生，同时通过优化再生培养基实现原生质体再生时间的缩短，且操作简单，便于推广实施，具有较好应用前景。

权利要求

1.一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法，所述方法包括：（1）菌丝的培养与纯化：取中国被毛孢菌丝体，接种于种子培养基中，于11 26 ℃、60~ ~

200 rpm转速下培养15 30天，再转接于发酵培养基中，于11 26℃、60 200 rpm转速下培养3~ ~ ~

12天，在离心机6000 10000 rpm下用0.4 1.0 mol/L 氯化钾溶液洗涤菌丝2 3次，收集得~ ~ ~ ~

到纯化后的菌丝体；

（2）原生质体的制备：向步骤（1）所得中国被毛孢菌丝体中加入复合酶液，于16 30 ℃、~

80 150 rpm下酶解0.5 3 h，过滤菌丝收集原生质体，在离心机3000 5000 rpm下用0.6 1.0 ~ ~ ~ ~

mol/L 氯化钾溶液洗涤原生质体2 3次，将原生质体重悬于0.6 1.0 mol/L 氯化钾溶液中；

~ ~

所述复合酶液为以0.6 mol/L 氯化钾溶液作为渗透压缓冲液，配制的Driselase from Basidiomycetes sp., Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和Yatalase分别为

1500 U/L，15000 U/L和8000 U/L的混合溶液；

（3）原生质体的再生：将步骤（2）得到的原生质体涂布于再生培养基中，添加湿棉球于

13 30℃下培养15 30天，得到再生中国被毛孢；所述再生培养基组成如下：蚕蛹粉15 g/L，~ ~

麸皮15 g/L，玉米粉10 g/L，葡萄糖15 g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10 g/L，糊精5 g/L，琼脂15 g/L，甘露醇0.6mol/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，无水硫酸镁0.1 g/L，溶剂为水。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中种子培养基组成如下：蚕蛹粉10~

30 g/L，麸皮10 25 g/L，玉米粉10 25 g/L，葡萄糖10 30 g/L，酵母粉3 10 g/L，糊精3 10 ~ ~ ~ ~ ~

g/L，蛋白胨5 20 g/L，磷酸二氢钾0.05 2 g/L，无水硫酸镁0.05 2 g/L，溶剂为水。

~ ~ ~

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中发酵培养基组成如下：葡萄糖10~

30 g/L，酵母粉3 10 g/L，糊精3 10 g/L，蛋白胨5 20 g/L，磷酸二氢钾0.05 2 g/L，无水硫~ ~ ~ ~

酸镁0.05 2 g/L，溶剂为水。

~

说明书

一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法。(二)背景技术

[0002] 冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)简称虫草，是子囊菌门(Ascomycota)，核菌纲(Pyrenomycetes)，麦角菌目(Clavicipitales)，麦角菌科
(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps)的一种真菌。虫草菌通过侵染鳞翅目蝙蝠蛾科昆
虫的幼虫，以其体内的有机物质作为营养和能量的来源进行寄生生活，经过不断生长发育
和分化后，最终菌丝体扭结并形成伸出寄主外壳的子座，与幼虫尸体形成复合体，从而构成
了冬虫夏草。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降
血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。

[0003] 冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。经过多年争论，2005年10月，中国菌物学会在北京召开了《冬虫夏草及其无
性型研讨会》，确定中国被毛孢(Hirsutella sinensis)为冬虫夏草唯一无性型菌种。中国
被毛孢人工发酵培养得到的菌丝经药理学和毒理学等研究，均证明与天然虫草化学组成、
药理作用基本一致，可替代天然虫草生产虫草制品，以弥补自然资源的短缺。

[0004] 现今中国被毛孢已经可以成功培育，但产量不高，其中一个制约因素是中国被毛孢生长条件苛刻，是一种生长缓慢周期长的低温菌，极大的限制了人工培育的发展。因此，
对中国被毛孢进行内部研究和改造势在必行，而构建一套完整高效的中国被毛孢原生质体
制备与再生体系不仅可以为菌株诱变筛选和原生质体融合的实现提供条件，还可以为中国
被毛孢转化体系的构建和组学的进一步研究提供基础。

[0005] 现有的技术中没有一整套完整高效的原生质体制备与再生体系，难以满足后续研究的需求。
(三)发明内容

[0006] 本发明目的是针对现有技术的不足，提供一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法。

[0007] 本发明采用的技术方案是：

[0008] 一种中国被毛孢原生质体的制备及再生方法，所述方法包括：

[0009] (1)菌丝的培养与纯化：取中国被毛孢菌丝体，接种于种子培养基中，于11～26℃、60～200rpm转速下培养15～30天，再转接于发酵培养基中，于11～26℃、60～200rpm转速下
培养3～12天，在离心机6000～10000rpm下用0.4～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤菌丝2～3次，
收集得到纯化后的菌丝体；

[0010] (2)原生质体的制备：向步骤(1)所得中国被毛孢菌丝体中加入复合酶液，于16～30℃、80～150rpm下酶解0.5～3h，过滤菌丝收集原生质体，在离心机3000～5000rpm下用
0.6～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤原生质体2～3次，将原生质体重悬于0.6～1.0mol/L氯化钾
溶液中；所述复合酶液为以0.4～1.0mol/L氯化钾溶液作为渗透压缓冲液，配制的
Driselase from Basidiomycetes sp.,Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和
Yatalase分别为1000～2000U/L，5000～20000U/L和3000～10000U/L的混合溶液；

[0011] 其中Driselast from Basidiomycetes sp.为崩溃酶，是含有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、昆布多糖酶和木聚糖酶的混合商品酶，其酶解原理主要通过酶解细胞壁中的支
撑骨架来释放细胞壁内的碳水化合物，从而实现细胞壁的裂解。Yatalase中含有几丁质酶、
壳二聚糖和溶解酶，其主要通过酶解细胞壁中的N‑乙酰胞壁酸和N‑乙酰氨基葡糖之间的β‑
1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽从而达到裂解细胞壁的目的。Lysing 
enzyme from Trichoderma Harzianum为溶壁酶，其中含有β‑葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶
和几丁质酶，通过全面酶解细胞壁中的各个成分来实现真菌细胞壁的裂解，这几种商品酶
近年来广泛用于真菌细胞壁的裂解。

[0012] (3)原生质体的再生：将步骤(2)得到的原生质体涂布于再生培养基中，添加湿棉球于13～30℃下培养15～30天，得到再生中国被毛孢。

[0013] 渗透压稳定剂是维持新生原生质体形态和活性的重要载质，同时作为酶解液的溶剂影响着酶活力，本发明选用氯化钾溶液为渗透压稳定剂，可较好地维持酶解出的原生质
体的完整性和活力。

[0014] 步骤(1)中种子培养基可为常规适用于中国被毛孢的种子培养基，优选组成如下：

[0015] 步骤(1)中发酵培养基可为常规适用于中国被毛孢的发酵培养基，优选组成如下：葡萄糖10～30g/L，酵母粉3～10g/L，糊精3～10g/L，蛋白胨5～20g/L，磷酸二氢钾0.05～
2g/L，无水硫酸镁0.05～2g/L，溶剂为水。发酵培养基更优选组成为：葡萄糖15g/L，酵母粉
5g/L，糊精5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，无水硫酸镁0.1g/L，余量为水。

[0016] 步骤(2)中复合酶液优选为以0.6mol/L氯化钾溶液作为渗透压缓冲液，配制的Driselase from Basidiomycetes sp.,Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和
Yatalase分别为1500U/L，15000U/L和8000U/L的混合溶液。

[0017] 步骤(3)中再生培养基组成如下：蚕蛹粉10～30g/L，麸皮10～25g/L，玉米粉10～25g/L，葡萄糖10～30g/L，酵母粉3～10g/L，蛋白胨5～20g/L，糊精3～10g/L，琼脂5～20g/
L，甘露醇0.5～1mol/L，磷酸二氢钾0.05～2g/L，无水硫酸镁0.05～2g/L，溶剂为水。再生培
养基更优选组成为：蚕蛹粉15g/L，麸皮15g/L，玉米粉10g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉5g/L，糊
精5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15g/L，甘露醇0.6mol/L，磷酸二氢钾0.2g/L，无水硫酸镁0.1/
Lg，余量为水。

[0018] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种中国被毛孢原生质体的制备与再生方法，通过以氯化钾溶液为渗透压稳定剂，以商品酶Driselase from Basidiomycetes 
sp.，Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和Yatalase作为复合酶进行酶解，能
够制备得到含量高的中国被毛孢原生质体并成功再生，同时通过优化再生培养基实现原生
质体再生时间的缩短，且操作简单，便于推广实施，具有较好应用前景。
(四)附图说明

[0019] 图1为实施例制备的中国被毛孢原生质体镜检图；

[0020] 图2为实施例制备的中国被毛孢原生质体再生图；

[0021] 图3为酶解时间对中国被毛孢原生质体制备的影响；

[0022] 图4为酶解温度对中国被毛孢原生质体制备的影响；

[0023] 图5为不同再生培养基对原生质体再生率及再生时间的影响；

[0024] 图6不同培养基所含渗稳剂对原生质体再生率及再生时间的影响；

[0025] 图7不同最初涂布密度对原生质体再生率及再生时间的影响(五)具体实施方式

[0026] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0027] 实施例1：

[0028] (1)菌丝的培养与纯化

[0029] 取中国被毛孢菌丝体ZJB18002(来自浙江工业大学生物工程研究所，已在CN109082382A中披露)，接种于种子培养基中，于11～26℃，60～200rpm转速下培养15～30
天，转接于发酵培养基中，11～26℃，60～200rpm转速下培养3～12天，在离心机6000～
10000rpm下用0.4～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤菌丝2～3次，收集得到纯化后的菌丝体；所述
的种子培养基组成为每升培养基含蚕蛹粉10～30g，麸皮10～25g，玉米粉10～25g，葡萄糖
10～30g，酵母粉3～10g，糊精3～10g，蛋白胨5～20g，磷酸二氢钾0.05～2g，无水硫酸镁
0.05～2g。所述的发酵培养基组成为每升培养基含葡萄糖10～30g，酵母粉3～10g，糊精3～
10g，蛋白胨5～20g，磷酸二氢钾0.05～2g，无水硫酸镁0.05～2g，余量为水。

[0030] (2)原生质体的制备

[0031] 向步骤a得到的中国被毛孢菌丝体中加入复合酶液(1～5mL/g菌丝体)，于水浴摇床中16～30℃，80～150rpm下酶解0.5～3h，用擦镜纸过滤菌丝收集原生质体，在离心机
3000～5000rpm下用0.6～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤原生质体2～3次，将原生质体重悬于
0.6～1.0mol/L氯化钾溶液中；所述复合酶液为以0.4～1.0mol/L氯化钾溶液作为渗透压缓
冲液，配制的Driselase from Basidiomycetes sp.(Sigma‑Aldrich，美国，200u/g),
Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum(Sigma‑Aldrich，美国，20000u/g)和
Yatalase(Takara，日本，10000u/g)终浓度分别为1000～2000U/L，5000～20000U/L和3000
～10000U/L的混合液体。

[0032] c、原生质体的再生

[0033] 将步骤b得到的原生质体涂布于再生培养基中，添加湿棉球于13～30℃下培养15～30天，得到再生中国被毛孢。所述再生培养基组成为每升培养基含蚕蛹粉10～30g，麸皮
10～25g，玉米粉10～25g，葡萄糖10～30g，酵母粉3～10g，蛋白胨5～20g，糊精3～10g，琼脂
5～20g，甘露醇0.5～1mol，磷酸二氢钾0.05～2g，无水硫酸镁0.05～2g。

[0034] 渗透压稳定剂是维持新生原生质体形态和活性的重要载质，同时作为酶解液的溶剂影响着酶活力。为了维持酶解出的原生质体的完整性和活力，发明人进行了如下所示的
筛选实验：

[0035] (一)渗透压稳定剂种类及浓度的选择

[0036] 具体操作步骤如下：

[0037] a、菌丝的培养与纯化

[0038] 取中国被毛孢菌丝体，接种于种子培养基中(每升培养基含蚕蛹粉15g，麸皮15g，玉米粉10g，葡萄糖15g，酵母粉5g，糊精5g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾0.2g，无水硫酸镁0.1g，
余量为水)，于16℃，150rpm转速下培养21天，转接于发酵培养基中(每升培养基含葡萄糖
15g，酵母粉5g，糊精5g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾0.2g，无水硫酸镁0.1g，余量为水)，16℃，
150rpm转速下培养7天，在离心机8000rpm下用0.6mol/L氯化钾溶液洗涤菌丝3次，收集得到
纯化后的菌丝体。

[0039] b、原生质体的制备

[0040] 向步骤a得到的中国被毛孢菌丝体中加入复合酶液，每1g湿菌体中加入4mL,于水浴摇床中18℃，120rpm下酶解0.5h，用擦镜纸过滤菌丝收集原生质体，在离心机4000rpm下
用0.6mol/L氯化钾溶液洗涤原生质体3次，将原生质体重悬于0.6mol/L氯化钾溶液中；所述
复合酶液为以0.6mol/L氯化钾溶液作为渗透压缓冲液，配制的Driselase from 
Basidiomycetes sp.,Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和Yatalase终浓度
分别为1500U/L，15000U/L和8000U/L的混合液体。

[0041] c、原生质体的再生

[0042] 将步骤b得到的原生质体涂布于再生培养基中(含蚕蛹粉15g，麸皮15g，玉米粉10g，葡萄糖15g，酵母粉5g，糊精5g，蛋白胨10g，琼脂15g，甘露醇0.6mol，磷酸二氢钾0.2g，
无水硫酸镁0.1g，余量为水)，添加湿棉球于16℃下培养22天，得到再生中国被毛孢。

[0043] 渗透压稳定剂不仅能够维持原生质体的形态，还能作为复合酶的溶剂从而影响酶的活性。因此发明人分别采用氯化钾、硫酸镁、甘露醇和山梨醇作为渗透压稳定剂，并对其
浓度进行了筛选，得到如下表1所示的实验结果。

[0044] 表1：不同渗透压稳定剂对中国被毛孢原生质体得率的影响

[0045]

[0046] 由筛选实验1可看出，采用的0.6mol/L氯化钾作为渗透压稳定剂进行原生质体制备与配制酶解液时，中国被毛孢原生质体得率最高。

[0047] 由于不同菌种间的特性及细胞壁复杂结构的不同，每一种真菌从菌丝中获得原生质体的条件和难度也是不同的。现有研究发现真菌细胞壁的主要成分是多糖，另有少量的
蛋白质和脂类，而虫草类真菌则以几丁质为主。酶解真菌细胞壁的酶种类繁多，每种酶对中
国被毛孢细胞壁的酶解效率也不一致，现有虫草类真菌制备原生质体直接使用商品酶进行
酶解。为了更快更完全的溶解中国被毛孢的细胞壁，发明人进行了如下所示的筛选实验：

[0048] (二)商品酶种类的筛选

[0049] 酶是原生质体制备最为关键的因素，其种类浓度直接影响了原生质体是否能被制备出。因此发明人分别采用了三种近几年常被用来酶解真菌的商品酶，对其组合和浓度进
行了筛选。混合商品酶的组成及浓度和中国被毛孢原生质体的制备率如下表2所示。

[0050] 表2：不同复合酶酶解得到的中国被毛孢原生质体

[0051]

[0052]

[0053] 由筛选实验2可看出，三种商品酶均可以制备出中国被毛孢原生质体，且Yatalase对中国被毛孢细胞壁的酶解效率最高，所有包含Yatalase的组合显示了相对较高的原生质
体得率。由筛选实验可知，当采用终浓度为1500U/L的Driselase from Basidiomycetes 
sp.，终浓度为15000U/L的Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和终浓度为
8000U/L的Yatalase组合为复合酶时，中国被毛孢原生质体得率最高。

[0054] (三)酶解条件的筛选

[0055] 为了制备得到高含量的中国被毛孢原生质体，需要筛选合适的酶解时间和温度，发明人进行了如下实验：

[0056] 将洗涤过滤后的中国被毛孢菌丝体加入复合酶液(0.6mol/L氯化钾溶液作为渗透压稳定剂，Driselase from Basidiomycetes sp.,Lysing Enzyme from Trichoderma 
harizianum和Yatalase终浓度分别为1500U/L，15000U/L和8000U/L)，于不同条件下(见图
3，图4)在水浴摇床中120rpm下酶解。

[0057] 由筛选实验可看出，当酶解时间为18℃，酶解0.5h时，中国被毛孢原生质体得率最高。

[0058] 经过实验筛选，发明人对Driselast from Basidiomycetes sp，Yatalase和Lysing enzyme from Trichoderma Harzianum三种商品酶进行不同的组合并优化了其浓
度、酶解温度和时间，来筛选制备中国被毛孢原生质体的适宜组合。

[0059] 原生质体再生是检验所制备出的原生质体活力的唯一标准，同时也是承载中国被毛孢诱变和内部改造的最终形态。再生过程是原生质体逐渐再生出细胞壁的过程，选择合
适的再生培养基，不仅可以提高原生质体的再生率，还可以有效的缩短其再生时间。发明人
进行了如下筛选实验：

[0060] (四)再生培养基的筛选

[0061] 为了提高原生质体的再生率并缩短再生时间，需要筛选合适的再生培养基，发明人进行了如下实验。

[0062] 将按以上优选步骤制备出的原生质体涂布于不同的再生培养基上(表3)，并对再生培养基中渗透压稳定剂的种类进行了优化，同时检测了不同涂布浓度对再生率的影响，
记录不同再生培养基上原生质体的再生率和所用的再生时间，结果如下图5，图6，图7。

[0063] 表3：不同再生培养基含量表

[0064]

[0065] 由筛选实验可看出，以0.5×104/mL的涂布密度在含0.6M甘露醇作为渗透压稳定剂的再生培养基④时，中国被毛孢原生质体再生率最高且再生时长最短。

[0066] 实施例2：采用本发明方法制备与再生中国被毛孢原生质体

[0067] 具体操作步骤如下：

[0068] a、菌丝的培养与纯化

[0069] 取中国被毛孢菌丝体，接种于种子培养基中，于16℃，150rpm转速下培养21天，转接于发酵培养基中，16℃，150rpm转速下培养7天，在离心机8000rpm下用0.6mol/L氯化钾溶
液洗涤菌丝3次，收集得到纯化后的菌丝体。所述种子培养基组成为：每升培养基含蚕蛹粉
15g，麸皮15g，玉米粉10g，葡萄糖15g，酵母粉5g，糊精5g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾0.2g，无水
硫酸镁0.1g，余量为水。所述发酵培养基组成为：每升培养基含葡萄糖15g，酵母粉5g，糊精
5g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾0.2g，无水硫酸镁0.1g，余量为水。

[0070] b、原生质体的制备

[0071] 向步骤a得到的中国被毛孢菌丝体中加入复合酶液，每1g湿菌体中加入4mL，于水浴摇床中18℃，120rpm下酶解0.5h，用擦镜纸过滤菌丝收集原生质体，在离心机4000rpm下
用0.6mol/L氯化钾溶液洗涤原生质体3次，将原生质体重悬于0.6mol/L氯化钾溶液中；所述
复合酶液为以0.6mol/L氯化钾溶液作为渗透压缓冲液，配制的Driselase from 
Basidiomycetes sp.,Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和Yatalase终浓度
分别为1500U/L，15000U/L和8000U/L的混合液体。

[0072] c、原生质体的再生

[0073] 将步骤b得到的原生质体涂布于再生培养基中，添加湿棉球于16℃下培养22天，得到再生中国被毛孢。所述再生培养基组成为：每升培养基含蚕蛹粉15g，麸皮15g，玉米粉
10g，葡萄糖15g，酵母粉5g，糊精5g，蛋白胨10g，琼脂15g，甘露醇0.6mol，磷酸二氢钾0.2g，
无水硫酸镁0.1g，余量为水。

[0074] 实施例中的中国被毛孢原生质体得率为2.73×107/g湿菌体。原生质体再生率为12.41％，再生时间为22d。

[0075] 采用显微镜放，200倍观察实施例所得原生质体，得到图1所示的实验结果。

[0076] 再生22d后得到已成熟的再生单菌落，如图2所示的实验结果。

[0077] 由实施例可知，本发明以0.6mol/L氯化钾溶液为渗透压稳定剂，以Driselase from Basidiomycetes sp.,Lysing Enzyme from Trichoderma harizianum和Yatalase终
浓度分别为1500U/L，15000U/L和8000U/L配制的混合酶液，在18℃下酶解0.5h，能够制备得
到含量最高的中国被毛孢原生质体。制备得到的原生质体大小为5.82±1.53μm，浓度为
7 4
2.73×10/g湿菌体，制备出的原生质体以0.5×10/mL的涂布密度在含0.6M甘露醇作为渗
透压稳定剂的再生培养基④时，中国被毛孢原生质体再生率最高为12.41％且再生时长最
短为22d。说明采用本发明方法能制备得到高含量的中国被毛孢原生质体，且筛选出原生质
体再生的最优条件和合适的再生培养条件。