应用花生AhGSNOR基因提高植物耐铝性的方法

摘要

本发明公开了一种应用花生AhGSNOR基因提高植物耐铝性的方法，所述AhGSNOR基因具有的多核苷酸序列包含：(a)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；(b)编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。将所述AhGSNOR基因通过转基因技术转化至烟草植株，发现其对铝胁迫的耐受性显著提高，表明该基因对植物抵御铝胁迫起积极作用。本发明对于利用基因工程技术提高作物抗铝能力、创制植物耐铝种质具有重要意义。

权利要求

1.花生AhGSNOR基因提高植物耐铝性的应用，所述AhGSNOR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述AhGSNOR基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述植物为花生或烟草，并通过提高花生内源AhGSNOR基因表达量来实现，或在烟草中过表达外源AhGSNOR基因来实现。

2.一种应用权利要求1中所述花生AhGSNOR基因提高植物耐铝性的方法，其特征在于，通过提高花生内源AhGSNOR基因表达量来实现，或在除花生外的其它植物中过表达外源AhGSNOR基因来实现。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述过表达外源AhGSNOR基因是指将所述AhGSNOR基因利用植物表达载体，经过农杆菌介导或者基因枪的方法转化至受体植物中进行表达。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述AhGSNOR基因通过植物表达载体导入受体植物细胞、组织或器官。

5.根据权利要求2的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：a、获取阳性克隆，所述阳性克隆含有AhGSNOR基因的DNA片段；

b、通过所述阳性克隆构建AhGSNOR基因过表达载体；

c、将AhGSNOR基因过表达载体转化至农杆菌；

d、利用所得的农杆菌将AhGSNOR基因导入到目标植株，并筛选出稳定表达转基因的植株。

6.根据权利要求5的方法，其特征在于，最后培育得到遗传稳定的转基因植株。

说明书

应用花生AhGSNOR基因提高植物耐铝性的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体地说，本发明涉及应用花生AhGSNOR基因提高植物耐铝性的方法。

背景技术

[0002] 铝是地壳中最丰富的金属，其化学形态依赖于pH，在酸性土壤(pH＜4.5)中，Al3+是3+
铝主要的可溶和有毒形式。因此，酸性土壤对植物生长的不利影响与Al 的毒性密切相关。
3+
可溶性Al 可抑制根系生长，影响植物吸收水分和养分的能力，限制植物的生长和生产力。
近年来，围绕植物解铝毒机制、植物对铝毒的内外适应机制已开展了大量研究，然而，有限
的基因功能研究限制了对植物耐铝机制的理解和耐铝种质的应用。利用育种手段对植物进
行基因工程改造，创制和培育耐铝种质已成为农业科学研究的重要目标。

[0003] 有相关的研究表明，铝对植物的毒害与一氧化氮(Nitric oxide，NO)稳态平衡有关，而GSNOR(S‑nitrosoglutathione reductase，S‑亚硝基谷胱甘肽还原酶)在调节NO稳态
平衡中起重要作用，参与植物多种生理过程。已发现过表达GSNOR能够提高番茄的耐盐碱能
力，提高盐碱胁迫中的ROS(Reactive oxygen species，活性氧)清除效率(Gong B，Wen D，
Wang X，et al.S‑nitrosoglutathione reductase‑modulated redox signaling 
controls sodic alkaline stress responses in Solanum lycopersicum L[J].Plant 
and Cell Physiology，2015，56(4)：790‑802.)。相反地，GSNOR表达受抑则引起番茄植株抗
氧化能力减弱，并导致ROS爆发和PCD(程序性细胞死亡，programmed cell death)发生。另
有研究发现拟南芥GSNOR突变植株(atgsnor1‑3)表现出早花、根伸长受抑、子叶变小等表型
(Lee U，Wie C，Fernandez BO，et al.Modulation of nitrosative stress by S‑
nitrosoglutathione reductase is critical for thermotolerance and plant growth 
in Arabidopsis[J].The Plant Cell，2008，20(3)：786‑802.)。然而，目前尚未发现该基因
应用于提高花生、烟草等经济作物的耐铝性。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是解决至少上述缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

[0005] 本发明的另一个目的是提供一种花生AhGSNOR基因作为提高植物耐铝性的应用。

[0006] 本发明的另一个目的是提供一种应用花生AhGSNOR基因作为提高植物耐铝性的应用的方法。

[0007] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供一种花生AhGSNOR基因作为提高植物耐铝性的应用，所述AhGSNOR基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

[0008] 进一步，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列是AhGSNOR基因的编码序列。

[0009] 进一步，所述AhGSNOR基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0010] 进一步，所述植物为花生或烟草。

[0011] 一种应用花生AhGSNOR基因提高植物耐铝性的方法，其中，通过提高花生内源AhGSNOR基因表达量来实现，或在其它植物中过表达外源AhGSNOR基因来实现。

[0012] 进一步，所述过表达外源AhGSNOR基因是指将所述AhGSNOR基因利用植物表达载体，经过农杆菌介导或者基因枪的方法转化至受体植物中进行表达。

[0013] 进一步，所述AhGSNOR基因通过植物表达载体导入受体植物细胞、组织或器官。

[0014] 进一步，所述方法具体包括以下步骤：

[0015] a、获取阳性克隆，所述阳性克隆含有AhGSNOR基因的DNA片段；

[0016] b、通过所述阳性克隆构建AhGSNOR基因过表达载体；

[0017] c、将AhGSNOR基因过表达载体转化至农杆菌；

[0018] d、利用所得的农杆菌将AhGSNOR基因导入到目标植株，并筛选出稳定表达转基因的植株。

[0019] 进一步，最后培育得到遗传稳定的转基因植株。

[0020] 进一步，所述植物表达载体通过组成型启动子驱动所述AhGSNOR基因的表达。

[0021] 进一步，所述组成型启动子是35S启动子。

[0022] 或者说，所述方法包括以下步骤：

[0023] a、AhGSNOR基因的DNA片段获取；

[0024] b、AhGSNOR过表达载体的构建；

[0025] c、农杆菌介导的遗传转化；

[0026] d、稳定表达转基因植株的筛选。

[0027] 进一步，培育抗铝性增强的转基因植株。

[0028] 进一步，还包括对所述的转基因植株进行铝胁迫处理，对植物抗铝性进行评价。

[0029] 本发明至少包括以下有益效果：

[0030] 本发明的来源于花生的AhGSNOR基因，通过采用基因工程方法，将花生AhGSNOR基因导入花生或烟草等植物中，使烟草或花生等植物对铝胁迫的耐性显著提高。

[0031] 本发明AhGSNOR基因在植物耐铝性方面具有正调控作用，这为培育耐铝种质尤其是花生种质提供了新的思路。

[0032] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

[0033] 图1为实施例2的表达载体pBI121‑AhGSNOR的构建示意图；

[0034] 图2为实施例4中铝胁迫下野生型植株和本发明的转基因植株根系GSNOR活性的比较；

[0035] 图3为实施例4中铝胁迫下野生型植株和本发明的转基因植株根相对生长率的比较；

[0036] 图4为实施例4中铝胁迫下野生型植株和本发明的转基因植株根系细胞死亡率的比较；

[0037] 图5为实施例4中铝胁迫下野生型植株和本发明的转基因植株根系SOD活性的比较；

[0038] 图6为实施例4中铝胁迫下野生型植株和本发明的转基因植株根系POD活性的比较；

[0039] 图7为实施例4中铝胁迫下野生型植株和本发明的转基因植株根系CAT活性的比较；

[0040] 图8为实施例4中铝胁迫下野生型植株和本发明的转基因植株根系MDA含量的比较。

具体实施方式

[0041] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

[0042] 实施例1

[0043] AhGSNOR基因的DNA片段获取。具体步骤如下：取0.2g花生根尖，采用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA。利用RevertAid TM first Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo 
Scientific)将RNA反转录为cDNA。根据所述花生AhGSNOR基因序列(SEQ ID NO：1)，设计扩
增出该序列的含酶切位点的上游引物(5＇‑CTCGAGATGGCAACTCAAGGTCAAGT‑3＇，其中，下划线
为Xho I位点)和下游引物(5＇GTCGACTGCATCTGTTGAAAGAACAC‑3＇，其中，下划线为Sal I位
点)，以花生cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s，58℃
退火30s，72℃延伸90s，35个循环。使用DNA纯化回收试剂盒(天根)对PCR产物进行胶回收，
将回收产物连接至pMD19‑T载体连接，筛选阳性克隆并测序，获得所需DNA片段(序列如SEQ 
ID NO：1所示)。将阳性克隆命名为pMD‑AhGSNOR。

[0044] 实施例2

[0045] 构建AhGSNOR基因的过表达载体。具体步骤如下：提取实施例1中的pMD‑AhGSNOR阳性克隆质粒和pBI121‑EGFP载体质粒(该载体可通过公开市售的商业渠道获得)，用限制性
内切酶XhoI和Sal I分别进行双酶切，使用DNA纯化回收试剂盒(天根)回收酶切后的片段。
用DNA连接试剂盒(Takara)对酶切后的片段进行连接，连接反应体系为pMD‑AhGSNOR胶回收
产物4μL、pBI121‑EGFP胶回收产物1μL，反应条件为16℃连接3h。将连接后的产物转化至
DH5a感受态细胞，使用100mg/L卡那霉素对单菌落进行抗性筛选，对获得的阳性克隆进行测
序验证。将测序正确的阳性克隆命名为pBI121‑AhGSNOR(载体构建示意图如图1所示)。提取
pBI121‑AhGSNOR质粒，转化至农杆菌菌株EHA105。

[0046] 实施例3

[0047] 通过农杆菌介导的遗传转化体系将AhGSNOR基因导入烟草植株。具体步骤如下：

[0048] (1)烟草无菌苗的培养：将烟草种子用75％乙醇浸泡1min后，转入0.1％升汞中浸泡5min，用无菌水冲洗3‑5次。用无菌镊子将灭菌好的种子接种至MS基本培养基上，置于26
℃培养箱中进行培养。

[0049] (2)叶盘的获取：由种子诱导的无菌苗长至叶片宽度为1‑1.5cm时，将叶片切下并划伤叶背，接种至含1.0mg/L 6‑BA和0.2mg/L NAA的固体培养基中，暗下培养2d。

[0050] (3)侵染：吸取2mL实施例2中的含有pBI121‑AhGSNOR的农杆菌EHA105接种于100mL含25mg/L利福平、25mg/L链霉素和100mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，28℃，200rpm下过
夜培养。将菌液转移至灭菌离心管中，12000rpm，4℃下离心10min，弃上清。用含2.5％蔗糖
的MS液体培养基重悬菌体。将暗培养2d后的叶片置于侵染液中，28℃，200rpm下振荡10min
后，将叶片夹至无菌滤纸上。待叶片表面菌液吸干，将叶片接种于含1.0mg/L 6‑BA和0.2mg/
L NAA的培养基中，置于26℃培养箱暗下共培养2d。

[0051] (4)抑菌培养及抗性筛选：共培养结束后，用无菌水冲洗叶片3‑5次。将叶片接种于含1.0mg/L 6‑BA、0.2mg/L NAA和100mg/L特美汀的抑菌培养基中，诱导分化出现丛生芽。将
分化出丛生芽的叶片转接至含含1.0mg/L6‑BA、0.2mg/L NAA、100mg/L特美汀和100mg/L卡
那霉素的抗性培养基中，筛选具有抗性的丛生芽。

[0052] (5)生根诱导及炼苗移栽：将生长至2‑3cm且叶片较绿的单芽，接种于含0.5mg/L NAA和100mg/L特美汀的1/2MS固体培养基，诱导无菌苗生根。当苗高4‑5cm时，开盖炼苗3d，
移栽于含混合基质(育苗土∶珍珠岩∶河沙＝1∶1∶1)的营养杯中进行培养。

[0053] 实施例4

[0054] 转基因烟草的鉴定及烟草T1代的耐铝性分析。具体步骤如下：

[0055] (1)转基因烟草的鉴定：取实施例3培养得到的烟草抗性苗叶片0.2g，用CTAB法提取DNA。使用AhGSNOR基因特异性引物(上游引物：5′‑ATGGCAACTCAAGGTCAAGT‑3＇，下游引物：
5′‑TGCATCTGTTGAAAGAACAC‑3＇)进行PCR检测，获取转基因烟草植株。

[0056] (2)烟草T1代的获取及遗传稳定性检测：当转基因烟草苗高约10cm时，移栽至温室中进行常规培养。将收获的转基因T0代种子播种于含100mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上，
同时将野生型烟草种子播种在无抗生素的1/2MS培养基上。当幼苗长出第二片真叶时，挑选
叶片颜色正常的幼苗，种植于含混合基质(育苗土∶珍珠岩∶河沙＝1∶1∶1)的育苗穴盘中。待
苗长出6‑7片叶时，剪取转基因植株及野生型植株的根系，使用RNA提取试剂盒(康为世纪)
提取总RNA，用HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒(康为世纪)反转录成cDNA。使用AhGSNOR
基因特异性引物(上游引物：5′‑ATGGCAACTCAAGGTCAAGT‑3＇，下游引物：5′‑
TGCATCTGTTGAAAGAACAC‑3＇)对RNA进行PCR检测，发现转基因烟草均能检测得到与目的基因
大小相符的扩增条带，而野生型烟草未检测出目的条带，表明AhGSNOR基因在转基因烟草T1
代中得到稳定遗传。

[0057] (3)转基因烟草的耐铝性分析：当T1代转基因植株或野生型烟草植株长出6‑7片叶时，选取生长均一的植株，洗净根系，于不同的铝处理浓度(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、
200μmol/L)下胁迫处理24h。取根系用于GSNOR活性、相对生长率、细胞死亡率、抗氧化酶活
性和MDA含量测定。发现无铝胁迫或铝胁迫条件下，过表达植株根系GSNOR活性显著高于野
生型植株(附图2)，过表达AhGSNOR能缓解铝胁迫对烟草根伸长的抑制(附图3)，减少铝胁迫
引起的根系细胞死亡(附图4)。铝胁迫条件下，过表达植株和野生型植株根系SOD活性无显
著差异(附图5)，但过表达植株在较高浓度铝处理浓度下的根系POD和CAT活性较野生型植
株高(附图6和附图7)。过表达AhGSNOR有利于烟草植株抵御由铝胁迫引起的抗氧化胁迫，缓
解根系膜脂过氧化(附图8)。以上结果表明过表达AhGSNOR有利于提高植物耐铝性。

[0058] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地
实现另外的修改。