一种光辅助青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法转让专利
申请号 : CN202010236518.0
文献号 : CN111345317B
文献日 : 2021-09-10
发明人 : 胥传来 , 高锐 , 匡华 , 徐丽广 , 孙茂忠 , 刘丽强 , 吴小玲 , 宋珊珊 , 胡拥明 , 郝昌龙
申请人 : 江南大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇的制备方法，其特征在于步骤如下：（1）氮气氛围保护下，在12mL超纯水的体系中，依次加入0.16 mmol的一水合醋酸铜Cu(CH3COO)2·H2O，0.2 mmol的氢氧化钠NaOH，0.16 mmol的柠檬酸钠NaCit，0.2 mmol的硼氢化钠NaBH4，0.16 mmol的青霉胺Pen，95℃下回流搅拌5h；
（2）步骤（1）的反应液在氮气保护下缓慢降到室温后，继续加入不少于0.04 mmol的青霉胺搅拌反应过夜；
（3）纯化纳米团簇：加入6倍以上体积的异丙醇溶液，10000rpm以上离心不少于15min，获得的沉淀在65℃下0.07‑0.1 MPa真空烘箱干燥后，加等体积的水重悬，制得青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇，备用。
2.一种光辅助青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于：利用青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇和烟草花叶病毒衣壳蛋白剪切位点的特异性亲和，在光的辐射下特异性水解天冬酰氨和脯氨酸之间的酰氨键，实现对烟草花叶病毒的特异性剪切。
3.根据权利要求2所述光辅助青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于：将纯化好的青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇与浓度为
2.5mg/mL的烟草花叶病毒衣壳蛋白按体积比1:1混匀于25‑37℃孵育1h，转移至532nm处的圆偏振光下辐射即可，破坏病毒衣壳蛋白的二级结构，导致病毒死亡。
4.根据权利要求3所述光辅助青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于：获取反应完毕后所得烟草花叶病毒蛋白的电泳信息，圆二色光谱，荧光光谱，液质联用色谱以及电镜图像。
5.根据权利要求4所述光辅助青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于：
所述电泳具体过程为：将反应混合溶液取15μL，加5μL pH7.4‑8.0的磷酸盐缓冲液，于
75℃环境中反应1h，反应过程注意密封避免进水；反应完成后，取10μL每孔进行SDS‑PAGE实验；浓缩胶5%，分离胶15%，电压120V，时间65min，电泳完成后，取出胶染色10min，然后用脱色液于恒温摇床脱色5次，每次30min，最后获取电泳条带；所述脱色液具体为400mL超纯水，
50mL甲醇和50mL冰乙酸；
所述圆二色光谱具体为：取不同时间点的反应的混合溶液分别进行圆二色光谱测试，扫描波长为190‑260nm，扫描速度为2s/0.2nm，扫描温度稳定在25℃；以相同浓度的蛋白质的圆二色光谱作为对照，用相同浓度的纳米团簇的圆二色光谱作为基线扣除纳米团簇的影响；
所述荧光光谱具体为：取不同时间点的反应的混合溶液分别进行荧光光谱测试，激发波长为280nm，扫描范围是300‑450nm；以相同浓度的纯蛋白质的荧光光谱作为对照，用相同浓度的纳米团簇的荧光光谱作为基线扣除纳米团簇的影响；
所述液质联用色谱具体为：取完成反应的混合溶液，逐滴加入0.1 M的稀盐酸，并伴随不断搅拌，等混合溶液完全无色，将溶液加入内衬管中进行液质联用色谱测试；
液相条件为，检测器：WATERS ACQUITY PDA，检测波长：222nm，分析柱：BEH C18
2.1X150mm 1.7μm，流动相：A：1%甲酸，B：100%乙腈，流速：0.3mL/min，进样量：0.3μL，以样品
40μL +100μL水稀释；
质谱条件为：离子方式: ESI+，毛细管电压: 3.5kV，锥孔电压: 20 V，离子源温度：100℃，脱溶剂气温度：400℃，碰撞能量：6/35，质量范围：20‑1500m/z。
6.根据权利要求2所述光辅助青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于：用10mM的pH 7.4‑8.0的磷酸盐缓冲液提取烟草花叶片中的烟草花叶病毒，通过使用100 KDa透过量的超滤管，9000转以上超滤不少于10min获得纯化的高浓度的病毒颗粒；将纯化后的青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇与烟草花叶病毒按等浓度等比例混匀，于30℃烘箱孵育1 h后转移至532nnm处的圆偏振光下辐射即可。
7.根据权利要求6所述光辅助青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于：获取反应完毕后所得烟草花叶病毒蛋白的电镜信息和Western Blot信息。
8.根据权利要求3或6所述光辅助青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于：所述圆偏振光下辐射时间依次为1、2、3和6h。
9.根据权利要求4或7所述光辅助青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于所述电镜测试具体为：取不同时间点的反应的混合溶液分别进行电镜负染制样处理，首先配制10mM的磷钨酸溶液，通过加入1M的氢氧化钠溶液调节pH至6；将20μL的样品滴在碳膜上，5min后用滤纸吸取多余的样品，立即用磷钨酸浸泡5min，再用滤纸移除磷钨酸，再用戊二醛固定30min，电镜观察加速电压为120kV。
10.根据权利要求7所述光辅助青霉胺稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶病毒衣壳蛋白的方法，其特征在于所述的Western Blot具体为：首先按照电泳操作进行实验，电泳完成后进行转膜，使用半干法转膜，设置电压15V，电流不超过0.2A，转膜15min；转膜完成后，先用适量的TBST缓冲液清洗PVDF膜三次，每次10min；之后用5%的脱脂奶粉4℃封闭过夜；完成封闭后，再用TBST清洗三次，每次5min，然后加入用5%的脱脂奶粉稀释好的一抗，4℃杂交过夜，然后再用TBST清洗三次，每次5min；再加入用5%的脱脂奶粉稀释好的二抗，室温孵育2h，用TBST清洗后，用显色剂显色拍照。
说明书 :
一种光辅助青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇剪切烟草花叶
病毒衣壳蛋白的方法
技术领域
背景技术
量和左右圆偏振光的光子角动量一致。这意味着更高的转换效率。
至关重要的作用。将蛋白质作为靶标来实现蛋白质的特异性水解、剪切、降解可以用于防控
农业生产中的各种灾害，包括植物病毒病造成的各种减产。尽管，已经报道了银对多种植物
病毒甚至是微生物都有很好的杀灭和防护作用。但是，利用银来防护作物和杀菌存在至少
三个弊端，第一银中毒是不容忽视的；第二银的作用是非特异性的，不但会杀灭植物病毒同
时对作物也有损伤；第三最关键是银是贵金属，十分昂贵。
键来进行化学反应。特别是这些过渡金属价格便宜，来源丰富。开发过渡金属配合物团簇用
于防控农业生产中的病毒病是一个理想的策略。
发明内容
毒死亡。
切位点的特异性亲和，在光的辐射下特异性水解天冬酰氨和脯氨酸之间的酰氨键，实现对
烟草花叶病毒的特异性剪切。
面配体青霉氨形成稳定的氢键，同时疏水的氨基酸和硫化铜核之间存在稳定的疏水相互作
用，进而在光的辅助下发挥剪切作用特异性水解天冬酰氨和脯氨酸之间的酰氨键。
用，从而在CPL下通过N‑Cu配位导致团簇表面出现NP(Asp‑Pro)吸附，从而切断了天冬酰氨
（Asp）和脯氨酸（Pro）之间的酰氨键，破坏病毒衣壳蛋白的二级结构，导致病毒死亡。
硼氢化钠NaBH4，0.16 mmol的青霉氨Pen，95℃下回流搅拌5h；
氨稳定的手性硫化铜纳米团簇，备用；
1、2、3和6 h，等到反应完成后，获取烟草花叶病毒蛋白的电泳信息，圆二色光谱，荧光光谱，
液质联用色谱以及电镜图像；
与烟草花叶病毒（2.5mg/mL）按体积比1:1混匀于30℃烘箱孵育1 h后转移至532nm处的圆偏
振光下辐射1、2、3和6 h，等到反应完成后，获取烟草花叶病毒蛋白的电镜信息和Western
Blot（WB）信息；
PAGE实验，浓缩胶5%，分离胶15%，电压120V，时间65 min，电泳完成后，取出胶染色10min（考
马斯亮蓝R250），然后用脱色液（400mL超纯水，50mL甲醇，50mL冰乙酸）于恒温摇床脱色5次，
每次30min，最后获取电泳条带；
时，我们获得相同浓度的蛋白质的圆二色光谱作为对照，而相同浓度的纳米团簇的圆二色
光谱作为基线扣除纳米团簇的影响。
荧光光谱作为对照，而相同浓度的纳米团簇的荧光光谱作为基线扣除纳米团簇的影响。
为，检测器：WATERS ACQUITY PDA，检测波长：222nm，分析柱：BEH C18 2.1X150mm 1.7um，流
动相：A : 1%甲酸,B:100%乙腈，流速：0.3mL/min，进样量：0.3μL ，以样品40μL +100μL水稀
释；质谱条件为：离子方式: ESI+，毛细管电压: 3.5 kV，锥孔电压: 20 V，离子源温度:100
℃，脱溶剂气温度:400℃，碰撞能量：6 /35，质量范围: 20‑1500m/z。
滴在碳膜上，5min后用滤纸吸取多余的样品，立即用磷钨酸浸泡5min，再用滤纸移除磷钨
酸，再用戊二醛固定30 min。电镜观察加速电压为120 kV。
PVDF膜三次，每次10 min。之后用5%的脱脂奶粉4℃封闭过夜。完成封闭后，再用TBST清洗三
次，每次5 min，然后加入稀释好的一抗（用5%的脱脂奶粉稀释），4℃杂交过夜，然后再用
TBST清洗三次，每次5 min后，再加入稀释好的二抗（用5%的脱脂奶粉稀释），室温孵育2h，用
TBST清洗后，用显色剂显色拍照。
异性，成本更低，毒副作用小。本发明方法实现了对烟草花叶病毒的特异性剪切，在农业生
产领域有着极大的应用价值。
附图说明
具体实施方式
化钠NaBH4，0.16 mmol的青霉氨Pen，95℃下回流搅拌5h；上述反应液在氮气保护下缓慢降
到室温后，继续加入不少于0.04 mmol的青霉氨搅拌反应过夜；纯化纳米团簇：加入6倍以上
体积的异丙醇溶液，10000rpm 离心不少于15 min，获得的沉淀在65℃ 0.07‑0.1 MPa真空
烘箱干燥后，加等体积的水重悬，制得青霉氨稳定的手性硫化铜纳米团簇备用。
像圆二色吸收峰；在550nm和700nm左右有明显的吸收峰。
体衍射。具体结果显示合成的纳米团簇和标准的硫化铜（Cu1.96S）具有完全一致的晶体衍射
峰，表明合成的材料属于硫化铜纳米团簇。
完成后，获取烟草花叶病毒蛋白的电泳信息，圆二色光谱，荧光光谱，液质联用色谱以及电
镜图像。
mL）按体积比1:1混匀与30℃烘箱孵育1h后转移至532nm处的圆偏振光下辐射1、2、3和6 h，
等到反应完成后，获取烟草花叶病毒蛋白的电镜信息和Western Blot（WB）信息。
浓缩胶5%，分离胶15%，电压120V，时间65min，电泳完成后，取出胶染色10min（考马斯亮蓝
R250），然后用脱色液（400mL超纯水，50mL甲醇，50mL冰乙酸）于恒温摇床脱色5次，每次
30min，最后获取电泳条带；具体结果如图4所示，随着反应时间的延长，原始的蛋白含量逐
渐减少，并在较小的分子量处出现新的条带，新的条带随着时间的延长慢慢加深，说明蛋白
质在光照下与纳米团簇作用后丢失了一部分片段。
与此同时，获得相同浓度的蛋白质的圆二色光谱作为对照，而相同浓度的纳米团簇的圆二
色光谱作为基线扣除纳米团簇的影响。具体结果如图1所示，随着反应时间的延长，蛋白质
的圆二色光谱强度在减弱，说明蛋白质的二级结构被破坏，包括螺旋和β折叠结构都在减
少，说明蛋白质结构的崩塌。
质的荧光光谱作为对照，而相同浓度的纳米团簇的荧光光谱作为基线扣除纳米团簇的影
响。具体结果如图2所示，由于蛋白质具有一些发色集团，因此在280nm处激光辐射下，会表
现出光致发光现象，并且随着反应时间的延长，蛋白质的荧光在逐步降低并伴随着轻微的
红移，说明纳米团簇和蛋白质之间发生了结合，导致荧光的淬灭和发射光的红移。
液相条件为，检测器：WATERS ACQUITY PDA，检测波长：222nm，分析柱：BEH C18 2.1X150mm
1.7μm，流动相：A：1%甲酸，B：100%乙腈，流速：0.3mL/min，进样量：0.3μL ，以样品40μL +100
μL水稀释；质谱条件为：离子方式: ESI+，毛细管电压：3.5 kV，锥孔电压：20 V，离子源温
度：100℃，脱溶剂气温度：400℃，碰撞能量：6/35，质量范围：20‑1500m/z。具体结果如图5所
示，色谱上的三个保留时间13.5，15.8和16.7分别属于质荷比1014.6，1277.4和1752.9，同
时这三个质荷比分别归属于小的片段，大片段和原始的蛋白质，说明原始的TMV CP在光的
作用下被纳米团簇剪切成两个片段。
μL的样品滴在碳膜上，5min后用滤纸吸取多余的样品，立即用磷钨酸浸泡5min，再用滤纸移
除磷钨酸，再用戊二醛固定30min。电镜观察加速电压为120kV。
一些无规则的聚集体，而对照组的结构几乎不变，说明蛋白质的结构确实在光照下被纳米
团簇破坏了；TMV 和纳米团簇孵育后光照不同时间的透射电镜图如图8所示；真实的病毒样
本在光照下和纳米团簇反应后，杆状的病毒结构逐渐消失，出现了一些无规则的聚集体，证
明了纳米团簇可以破坏TMV的结构，导致病毒死亡。
（pH8.0）溶液将胶块浸没，震荡10min，吸去洗液，重复该过程共三次；加入100% ACN浸没胶
块，震荡10min，吸去洗液，然后把胶块在真空抽干仪中抽干；向胶块中加入10mM DTT/50mM
NH4HCO3（pH8.0）溶液，56℃孵育1h进行还原反应，之后吸去浸液；随后加入55mM
iodoacetamide/50mM NH4HCO（3 pH8.0）溶液，室温、暗处反应30min，之后吸去浸液；加入100%
ACN，震荡20min，吸去浸液，抽干胶块；向胶块中加入适量的胰蛋白酶，并补加50mM NH4HCO3
溶液以完全覆盖胶块，37℃孵育过夜进行酶切；然后加入抽提液60％ACN / 5% formic
acid，超声波震荡10min，离心后吸取上清至新的离心管；重复抽提过程两次后，合并抽提
液，在真空抽干仪中抽干；使用自制的C18小柱进行肽段除盐，抽干后冻存于‑20℃备用。肽
段样品通过自动进样器吸入后结合至C18捕获柱（5 µm, 5×0.3mm），接着被洗脱至分析柱
（75 μm × 150 mm, 3 μm particle size, 100 Å pore size, Eksigent）进行分离。利用
两个流动相(流动相A：3% DMSO, 97% H2O, 0.1% formic acid和流动相B：3% DMSO, 97%
ACN, 0.1% formic acid)建立30min的分析梯度（0 min in 5% B, 15 min of 5%‑35% B,
1 min of 35%‑80% B, 80% B for 5 min, 0.1 min of 80%‑5% B, 5% B for 8.9 min）。
液相的流速设置为300 nL/min。质谱IDA模式分析时，每个扫描循环中包含一个MS全扫描
（m/z范围是350‑1500，离子累积时间250 ms），以及随后跟着的40个MS/MS扫描（m/z范围是
100‑1500，离子累积时间50 ms）。MS/MS采集的条件设置为母离子信号大于120 cps，电荷数
为+2 +5。离子重复采集排除时间设置为18 s。测序分析如图6所示，原始蛋白质条带样本显
~
示几乎获得了从第一位丝氨酸到最后一位苏氨酸的所有氨基酸，而图4中较小的一点的样
本条带测序结果表明，从第102个氨基酸脯氨酸以后的氨基酸明显缺失，表明可能的剪切位
点在第101个氨基酸天冬酰胺和第102位氨基酸脯氨酸之间。为了进一步确定剪切位点以及
明确剪切的本质是水解还是氧化断裂，我们进行多肽QANPTTAE的液质联用分析，结果如图7
所示，我们明确观察到三个保留时间1.20，1.46和4.20以及对应的分子量333，518和831，进
一步明确了剪切位点处于天冬酰胺和脯氨酸之间，并且说明光照下纳米团簇对TMV CP的剪
切作用本质上是水解反应。
膜三次，每次10 min。之后用5%的脱脂奶粉4℃封闭过夜。完成封闭后，再用TBST清洗三次，
每次5 min，然后加入稀释好的一抗（用5%的脱脂奶粉稀释），4℃杂交过夜，然后再用TBST清
洗三次，每次5 min后，再加入稀释好的二抗（用5%的脱脂奶粉稀释），室温孵育2h，用TBST清
洗后，用显色剂显色拍照。具体结果如图9所示，仅仅加材料和仅仅光照对病毒几乎没有剪
切作用，一旦在光的辐射下加入纳米团簇，对病毒实现了一种时间依赖性的剪切作用，抗体
显色的原始的条带在减少，说明病毒的衣壳蛋白在减少，进一步说明病毒的结构在被破坏。