与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的SNP分子标记

摘要

本发明公开了一个与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的SNP分子标记，该SNP位点位于proPO基因的第4内含子区，与克氏原螯虾抗白斑综合征病毒（WSSV）性状有显著相关性，具有良好的多态性，利用该SNP分子标记对克氏原螯虾进行抗WSSV检测，有利于提高克氏原螯虾的抗病育种效率，加快实现克氏原螯虾抗WSSV新品种的选育。

权利要求

1.SNP分子标记在克氏原螯虾抗白斑综合征病毒的品种选育中的应用，其特征在于，所述分子标记为SEQ ID NO  .2和3所示的核苷酸序列，第451位的碱基是T或C，TT基因型是克氏原螯虾白斑综合征病抗性的有利标记。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于扩增权利要求1所述SNP分子标记的引物序列如SEQ ID NO .4和SEQ ID NO .5所示。

说明书

与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的SNP分子标记

技术领域

[0001] 本发明属于水产动物遗传育种技术领域，具体涉及一个与克氏原螯虾白斑综合征病抗性相关的SNP分子标记。

背景技术

[0002] 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，隶属于甲壳纲、十足目、螯虾科、原螯虾属，原产于墨西哥北部和美国南部(邓沼泽2010)。因其营养丰富，口味独特，现已成为我国重要
的经济养殖对象。据《2019中国小龙虾产业发展报告》报道，2018年小龙虾在中国的产量达
到了1638700吨，养殖总面积达1680万亩，总产值达到3690亿元。白斑综合征病毒(White 
spot syndrome virus，WSSV)是影响克氏原螯虾健康养殖产业发展的重要因素之一，给克
氏原螯虾产量造成了一定的经济损失。

[0003] WSSV是一种具有囊膜的双链DNA病毒，几乎可以感染所有的虾、蟹类等甲壳动物(Ding 2015)。虾感染WSSV后，游泳速度明显变得缓慢，摄食量减少，行动迟缓，头胸甲与腹
节分离，血淋巴变得稀薄不易凝固，最后病虾大规模死亡。整个发病过程一般持续3‑10天，
死亡率可达90％以上(闫冬春2007)。对克氏原螯虾携带WSSV情况的研究表明，池塘养殖和
江河的野生克氏原螯虾均有较高的带毒率(洪徐鹏2012)。在克氏原螯虾产量最高的湖北地
区，对7个主要养殖克氏原螯虾的地区的携带WSSV情况调查发现，克氏原螯虾携带WSSV的比
例在40‑70％之间(李青彬2018)。

[0004] WSSV主要通过水平传播、垂直传播和种间转播三种方式进行传播(Chou1998)。目前，有研究报道了许多化学和物理方法用于预防和治疗该病，如病毒蛋白口服，在体内注射
灭活的WSSV(Du et al 2006，Zhu et al 2009)，高热疗法等，这些方法虽然具有一定的可
行性，但在克氏原螯虾的养殖中广泛地应用仍具有一定的难度。

[0005] 近年来，随着分子生物技术的发展，使得人们可以透过复杂的表面现象，剖析其遗传基础，估算其遗传的部分，DNA重组技术、转基因技术、分子标记技术等逐渐地应用在育种
领域。其中，分子标记技术因具有较高的多态性、检测手段简单、开发成本低廉等优点，现广
泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别等方面。目前在中国对虾(降
锦菲2013)、半滑舌鳎(邢贺飞2015)、草鱼(王文静2014)和凡纳滨对虾(Liu et al 2014)等
水产动物中已开发出了抗病分子标记，但在克氏原螯虾抗病SNP分子标记的研究仍为空白，
有必要通过分子育种技术，挖掘克氏原螯虾抗病关键基因，为该虾抗病品种选育提供依据。

[0006] 大多数甲壳类动物缺乏适应性免疫，而依赖于先天免疫，后者分为体液免疫和细胞免疫，它们是抵抗病原体的第一道防线(Loker et al 2004；Cerenius and
2004)。凝血系统，抗菌素蛋白的合成以及酚氧化酶原(proPO)激活系统在无脊椎动物中形
成体液免疫(Iwanaga and Lee 2004；Cerenius et al 2008)。其中，酚氧化酶原(proPO)激
活系统被认为是甲壳类动物中最重要的免疫系统(Zheng 2019)，酚氧化酶原激活系统在丝
氨酸蛋白酶(Serine protease，SP)的催化下可产生有毒的反应中间体和黑色素以抵抗病
原体(Jiang and Kanost 2000)。现有研究表明，proPO在诸如结节形成，血淋巴吸引等生理
过程中起着至关重要的作用(Cerenius et al 2008；Nappi and Christensen 2005)。
proPO系统可被病原体，身体损伤和微生物产物激活(Amparyup et al 2013；Cerenius and
2004)。在过去的几十年中，proPO在各种生物中被广泛的研究，并显示了它们在无
脊椎动物免疫中的重要作用(Amparyup et al 2013；Gu et al 2019；Dziedziech et al 
2019)。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一个与克氏原螯虾抗白斑综合征病毒(WSSV)相关的SNP分子标记，该SNP分子标记的多态性位点位于克氏原螯虾酚氧化酶原基因
(prophenoloxidase,proPO)第4内含子中，与克氏原螯虾抗WSSV性状有显著相关性，具有良
好的多态性，利用该SNP分子标记对克氏原螯虾进行抗WSSV检测，有利于提高克氏原螯虾的
抗病育种效率，加快实现克氏原螯虾抗WSSV新品种的选育。

[0008] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

[0009] 本发明通过克氏原螯虾WSSV攻毒处理及基因组DNA提取，引物设计，PCR扩增，PCR产物直接测序以及SNP分子标记的筛选与分析，用SPSS 22.0软件进行数据处理，卡方检验
基因型与抗病性状的显著性差异，在proPO基因的第4内含子区发现1个与克氏原螯虾抗
WSSV性状显著相关的SNP位点g.7081T/C，SNP分子标记包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序
列，在该序列的第451bp处有一个等位基因突变，基因型是T或C。

[0010] 上述SNP分子标记在辅助选育克氏原螯虾抗白斑综合征病毒品种中的应用，具体方法为：扩增含有所述SNP位点的片段，通过直接测序法对SNP位点的基因型进行分型，TT基
因型是克氏原螯虾白斑综合征病抗性的有利标记。

[0011] 进一步地，用于扩增SNP分子标记的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

附图说明

[0012] 图1：克氏原螯虾proPO基因第4内含子中g.7081T/C位点不同基因型的测序峰图。

具体实施方式

[0013] 实施例

[0014] 1.1试验动物

[0015] 本实验所需的克氏原螯虾来自华中农业大学水产养殖基地，实验前在聚乙烯塑料养殖箱中暂养1周，挑选健康有活力的189尾虾开展实验。室内养殖水温24‑26℃，实验期间
9
每天投喂1次商品饲料，每周换水2次。将189只健康克氏原螯虾注射0.1mL WSSV(10拷贝)，
注射部位为第二腹节。随着病毒在体内的扩散，前50个发病死亡的克氏原螯虾作为敏感群
体。15天后，将50个存活的克氏原螯虾作为抗性组。

[0016] 1.2试验方法

[0017] 1.2.1克氏原螯虾基因组DNA提取

[0018] 取两个群体克氏原螯虾的尾部肌肉保存在装有无水乙醇的2mL离心管中，按照以下步骤提取其DNA：

[0019] (1)在实验开始前将水浴锅温度设置为55℃并于冰上解冻蛋白酶K，取肌肉组织于滤纸上，吸干附着于肌肉上的液体；将肌肉装入有600μL裂解液的2mL离心管中，将肌肉组织
用剪刀剪碎后加入9μL蛋白酶K；

[0020] (2)将装有肌肉组织的离心管放入水浴锅中，让肌肉组织消解完全；

[0021] (3)提前打开冰冻离心机，快速降温至4℃，待肌肉组织完全消解后，将其取出，冷却，向离心管中加入200μL醋酸铵(此步骤及以后操作均在冰上进行)，用力摇晃充分混匀；

[0022] (4)离心后，用1000μL枪缓慢吸取上清液，将其加到1.5mL离心管中(约500μL)；加入等体积预冷异丙醇(轻轻摇晃有丝状物产生)，离心(4℃，12000r/min，10‑15min)，缓慢倒
出上清液，将白色白斑留下；

[0023] (5)加入1mL 75％乙醇洗涤，离心(4℃，12000r/min，5min)；倒出上清液，将白色沉淀或白斑留下，重复一次后，再用100％乙醇洗涤一次(离心4℃，12000r/min，2‑5min)；

[0024] (6)干燥(约30min)后加入适量灭菌双蒸水，振荡后低速离心，所得DNA样本于‑20℃保存。

[0025] 1.2.2引物设计

[0026] 根据本发明克隆得到的克氏原螯虾proPO基因DNA序列(SEQ ID NO:1)，设计扩增位于proPO基因的SNP位点，用Primer Premier 6.0软件设计引物(引物序列如表1所示)

[0027] 表1本发明设计的引物序列

[0028]

[0029] 1.2.3 PCR扩增

[0030] 以抗性组和敏感组克氏原螯虾DNA为模板，以表1所示引物进行PCR扩增，扩增体系见表2。

[0031] 表2 PCR扩增体系的组分

[0032]

[0033]

[0034] PCR扩增程序为：95℃条件下预变性5min，40个扩增循环(95℃，30s；55℃，45s；72℃，1min)，72℃延伸10min。

[0035] 1.2.4小群体基因池构建及SNP筛选

[0036] 在抗性组和敏感组中各随机选取10个个体，将每个个体的DNA等量混合后构成抗性组和敏感组基因池，利用设计的引物对抗性组和敏感组DNA进行PCR扩增，取2μL扩增产物
经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，选择电泳目的条带清晰明亮的PCR产物送武汉擎科生物有限
公司测序。测序结果由DNAstar软件分析核苷酸序列以及比对测序峰图，将在小群体抗性组
和敏感组中差异显著的位点在剩余的80个个体进行单个个体验证。

[0037] 1.2.5数据分析

[0038] 用PopGene 32软件计算SNP的等位基因频率，基因型频率，多态信息含量，群体观测杂合度，期望杂合度，有效等位基因数，哈迪‑温伯格平衡检验。用SPSS 22.0对各SNP基因
型和抗病性状进行卡方检验。

[0039] 1.2.6结果分析

[0040] 1.2.6.1克氏原螯虾proPO基因SNP小群体筛选

[0041] 对克氏原螯虾proPO基因片段1‑5进行扩增测序，经过比对，片段1‑3没有发现SNP位点；在片段4中发现2个在抗性组和敏感组有显著性差异的SNP位点，经比对这2个位点位
于proPO基因的第3内含子中；在片段5(SEQ ID NO：2)中发现1个在抗性组和敏感组中有显
著性差异的SNP位点，经比对该位点位于proPO基因第4内含子中。

[0042] 1.2.6.1克氏原螯虾proPO基因大群体SNP筛选及多态分析

[0043] 使用引物proPO‑F4/R4和proPO‑F5/R5对剩余80个克氏原螯虾个体的proPO基因片段4和片段5进行扩增，经测序比对后，用PopGene 32对这3个位点的多态信息进行分析，结
果如表3所示。

[0044] 表3克氏原螯虾proPO基因SNP位点多态参数分析

[0045]

[0046] 注：SNP：单核苷酸多态；Ho：杂合度；He：预期杂合度；HWE：哈迪温伯格平衡检验；PIC：多态信息含量：Ne：有效等位基因。

[0047] 表3说明：3个SNP的杂合度为0.24至0.33，预期的杂合度为0.270至0.367，有效等位基因数为1.368至1.613。多态性参数分析表明，3个SNP位点均遵循Hard‑Weinberg。3个
SNP均表现出中等多态性(0.25

[0048] 1.2.6.2克氏原螯虾proPO基因SNP位点与抗WSSV性状关联分析

[0049] 分别统计这3个SNP位点在抗性组和敏感组中的等位基因频率和基因型频率，用SPSS 22.0软件中的卡方检验对这3个SNP位点在抗性组和敏感组的基因型频率和等位基因
频率进行显著性差异检验，P<0.05视为存在显著性差异，反之则不存在显著性差异。

[0050] 表4克氏原螯虾proPO基因SNP位点与抗WSSV的关联分析

[0051]

[0052] 注：加粗的数字表明存在显著性差异(P<0.05)。

[0053] 表4说明：在g.5057T/C、g.7081T/C和g.5061T/C中，抗性组的TT基因型克氏原螯虾比例均高于敏感组。对3个SNP的基因型频率和等位基因频率在抗性组和敏感组卡方检验表
明g.7081T/C位点基因型频率和等位基因频率在抗性组和敏感组中均存在显著性差异(P<
0.05)。这些结果表明g.7081T/C与抗WSSV性状具有显著相关性，且TT基因型在WSSV抗性组
中为优势基因型，因此可以通过选择proPO基因g.7081T/C位点是TT基因型的克氏原螯虾进
行抗WSSV育种。

[0054] 参考文献

[0055] 1.邓沼泽.小龙虾的市场经济价值论述.现代商贸工业，2010，13：155

[0056] 2.洪徐鹏.白斑综合征病毒(WSSV)在市售克氏原螯虾中携带情况调查.江西水产科技，2012：13‑15

[0057] 3.降锦菲“. 黄海2号”中国对虾高通量SNP筛选及与抗WSSV性状的关联分析.[硕士学位论文].上海：上海海洋大学，2013

[0058] 4.李青彬.克氏原螯虾白斑综合征病毒的活体检测及流行病学调查.4.[硕士学位论文].武汉：华中农业大学，2018

[0059] 5.王文静.草鱼3个Toll样受体基因克隆和表达及与细菌性败血症关联分析.[硕士学位论文].上海：上海海洋大学，2014.

[0060] 6.邢贺飞.半滑舌鳎抗病相关SNP标记的筛选及两种免疫相关基因的克隆与初步分析.[硕士学位论文].上海：上海海洋大学，2015

[0061] 7.闫冬春.对虾白斑综合征病毒(WSSV)宿主研究进展.海洋湖沼通报，2007，(01)：136‑140

[0062] 8.Amparyup P,Charoensapsri W,Tassanakajon A.Prophenoloxidase system and its role in shrimp immune responses against major pathogens.Fish 
Shellfish Immunol,2013,34:990–1001

[0063] 9.Chou HY,Huang CY,Lo CF,Kou GH.Studies on transmission of white spot syndrome associated baculovims(WSBV)in Penaeus monodon and P.japonicus via 
waterbome contact and oral ingestion.Aquaculture,1998,164:263‑276

[0064] 10.Cerenius L,Lee BL, K.The proPO‑system:pros and cons for its role in invertebrate immunity.Trends Immunol,2008,29:263–271.

[0065] 11.Cerenius L, K.The prophenoloxidase‑activating system in invertebrates.Immunol.Rev,2004,77:116–126

[0066] 12.Dziedziech A,Schmid M,Arefin B,Kienzle T,Krautz R,Theopold U.Data on Drosophila clots and hemocyte morphologies using GFP‑tagged secretory 
proteins:Prophenoloxidase and transglutaminase.Date in Brief,2019,25:104229

[0067] 13.Du H,Xu Z,Wu X,Li W,Dai W.Increased resistance to white spot syndrome virus in Procambarus clarkii by injection of envelope protein VP28 
expressed using recombinant baculovirus.Aquaculture,2006,260:39‑43

[0068] 14.Ding ZF,Yao YF,Zhang FX,Wan JJ,Sun ML,Liu HY,Zhou G,Tang JQ,Pan JL,Xue H,Zhao ZM.The first detection of white spot syndrome Virus in 
naturally infected cultured Chinese mitten crabs,Eriocheir sinensis in 
china.J.Virol.Methods,2015,220:49‑54

[0069] 15.Gu QJ,Zhou SM,Zhou YN,Huang JH,Shi M,Chen XX.A trypsin inhibitor‑like protein secreted by Cotesia vestalis teratocytes inhibits hemolymph 
prophenoloxidase activation of Plutella xylostella.J.Insect Physiol,2019,116:
41‑48

[0070] 16.Iwanaga S,Lee BL.Recent advances in the innate immunity of invertebrate animals.J.Biochem.Mol.Biol,2005,38:128–150

[0071] 17.Jiang H,Kanost MR.The clip‑domain family of serine proteinases in arthropods.Insect Biochem.Mol.Biol,2000,30:95–105

[0072] 18.Loker ES,Adema CM,Zhang SM,Kepler T.Invertebrate immune systems‑nothomogeneous,not simple,not well understood.Immunol.Rev,2004,198:10–24

[0073] 19.Liu JW,Yu Y,Li FH,Zhang XJ,Xiang JH.A new anti‑lipopolysaccharide factor(ALF)gene with its SNP polymorphisms related to WSSV‑resistance of 
Litopenaeus vannamei.Fish Shellfish Immunol,2014,39:24‑33

[0074] 20.Nappi AJ,Christensen BM.Melanogenesis and associated cytotoxic reactions:applications to insect innate immunity.Insect Biochem.Mol.Biol,
2005,35:443–459

[0075] 21.Zheng XC,Chi C,Xu CY,Liu JD,Zhang CY,Zhang L,Huang YY,He CF,He C,Jia XY,Liu WB.Effects of dietary supplementation with icariin on growth 
performance,antioxidant capacity and non‑specific immunity of Chinese mitten 
crab(Eriocheir sinensis).Fish Shellfish Immunol,2019,90:264‑273

[0076] 22.Zhu F；Du H；Miao Z；Quan H；Xu Z.Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using inactivated WSSV.Fish Shellfish 
Immunol,2009,26,685‑690