一种闹羊花毒素III半抗原及其制备方法与应用

摘要

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种闹羊花毒素III（Rhodojaponin III）半抗原及其制备方法与应用。所述的闹羊花毒素III半抗原具有如下结构：；利用本发明提供的闹羊花毒素III半抗原与载体蛋白的偶联物，通过免疫小鼠可以获得抗闹羊花毒素III的特异性抗体，且抗体制备过程简单、经济、灵敏度高、实用价值高。可用于建立酶联免疫吸附分析方法，从而实现闹羊花毒素III的快速检测。本发明公开的闹羊花毒素III的半抗原具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种闹羊花毒素III半抗原，其特征在于，具有如下结构：。

2.权利要求1所述的闹羊花毒素III半抗原的制备方法，其特征在于，将闹羊花毒素III与琥珀酸酐在55 65℃下反应，得到所述闹羊花毒素III半抗原。

~

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述闹羊花毒素III与所述琥珀酸酐的摩尔比为1:（0.8 1.2）；

~

和/或，所述反应在避光条件下进行；

和/或，所述反应的时间为7 9 h。

~

4.一种闹羊花毒素III人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述的闹羊花毒素III半抗原与载体蛋白偶联后得到；

其中，所述载体蛋白为选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白和人血清白蛋白中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的闹羊花毒素III人工抗原，其特征在于，所述闹羊花毒素III半抗原与所述载体蛋白的摩尔比为（5.5 6）:1。

~

6.权利要求4或5所述的闹羊花毒素III人工抗原在以下任一方面的应用：①在制备闹羊花毒素III特异性抗体中的应用；

②在检测抗闹羊花毒素III特异性抗体中的应用。

7.一种抗闹羊花毒素III抗体，其特征在于，以权利要求4或5所述的闹羊花毒素III人工抗原为免疫原，免疫动物制备得到；所述抗闹羊花毒素III抗体为多克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的抗闹羊花毒素III抗体，其特征在于，所述闹羊花毒素III人工抗原由权利要求1所述的半抗原和牛血清蛋白偶联得到。

9.权利要求7或8所述的抗闹羊花毒素III抗体在以下任一方面的应用：（1）在检测闹羊花毒素III中的应用；

（2）在制备闹羊花毒素III的免疫层析试纸条中的应用；

（3）在制备闹羊花毒素III的酶联免疫分析检测试剂盒中的应用。

10.一种检测试剂或检测试纸，其特征在于，含有权利要求7或8所述的抗闹羊花毒素III抗体。

说明书

一种闹羊花毒素III半抗原及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种闹羊花毒素III半抗原及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 近年来，我国南方部分省市的山区陆续爆发了多起因食用蜂蜜而中毒事件，其中以西南山区尤为严峻。蜂蜜中毒主要是人们误食了有毒蜂蜜，而有毒蜂蜜主要与有毒蜜源植物相关。西南地区横断山脉的蜜源植物十分丰富，其中就包含了众多的有毒蜜源植物，如有毒杜鹃和昆明山海棠等，其中有毒杜鹃的种类尤为丰富。在有毒杜鹃的盛花时期，蜂蜜便会采集其花蜜，将其中植物毒素迁移并富集在蜂巢中，形成有毒蜂蜜。通常，这些问题蜂蜜中含有高浓度的植物毒素，人们一旦食用，便会发生中毒反应，严重者甚至致人死亡。

[0003] 值得一提的是，土耳其和尼泊尔也常年发生蜂蜜中毒事件，主要是有当地的有毒杜鹃蜜源植物引起的，引发中毒疾病通常称之为“狂蜜症”。目前，有关导致“狂蜜症”的有毒蜂蜜研究十分详尽，主要是蜂蜜中含有高浓度的木黎芦毒素III（Grayanotoxin III）。然而，杜鹃花的种类较多，不同品种和不同产地的杜鹃花中的成分差异较大，其主要毒性化合物的种类和含量也存在巨大的差异。目前，我国有毒蜂蜜中关键植物毒素是否同国外报道的一致，也是木黎芦毒素III，当前尚未明确。

[0004] 本研究团队通过系统的科学研究发现，闹羊花毒素III（Rhodojaponin III）在有毒蜂蜜中含量高，且毒性较大，是导致我国有毒蜂蜜的关键植物毒素之一。因此，可以通过检测蜂蜜中是否含有闹羊花毒素III来鉴别有毒蜂蜜，从而保障蜂蜜质量安全。当前，有关食品中闹羊花毒素III的检测方法主要是基于高效液相色谱或者液相串联质谱等技术，这些方法主要是通过实验室分析，且耗时较长、花费大、对检验人员的专业知识要求较高，难以满足现场快速检测等场景的现实需求。

[0005] 免疫分析是当前保障食品安全的一项重要方法，因其具有灵敏度高、特异性强、耗时短和花费小等优点，深受食品安全检验人员喜爱。在免疫分析中，优质抗体的获得是成功开发免疫分析方法的关键，一旦制备出优质抗体，便可以开发多种免疫分析模式和方法。在小分子化合物特异性抗体的制备过程中，半抗原的设计与合成是核心，因为只有恰当半抗原才能高效地刺激机体获得优质抗体。而目前本领域尚未有关于闹羊花毒素III免疫分析方法的研究。

发明内容

[0006] （一）要解决的技术问题

[0007] 本发明专利旨在设计恰当的闹羊花毒素III半抗原，并采用适当的化学合成手段制备半抗原，为后续闹羊花毒素III优质抗体的获得奠定基础，并使闹羊花毒素III抗体在开发检测试剂盒、以及闹羊花毒素III的免疫检测中得到很好的应用。

[0008] （二）技术方案

[0009] 本发明第一目的在于提供一种闹羊花毒素III半抗原，具有如下结构，其可以高效地刺激机体获得优质的闹羊花毒素III抗体。

[0010] 。

[0011] 本发明第二目的在于提供所述的闹羊花毒素III半抗原的制备方法，将闹羊花毒素III与琥珀酸酐在55 65℃（更优选为60℃）下反应，得到所述闹羊花毒素III半抗原。~

[0012] 本发明发现，在上述条件下，可以在闹羊花毒素III的特定羟基位点引入间隔臂琥珀酸酐，获得本发明所需的闹羊花毒素III半抗原。

[0013] 在此基础上，本发明进一步对制备方法进行了优化，得到如下方案：

[0014] 在一些优选方案中，所述反应在在吡啶中进行；优选所述的吡啶为无水吡啶。

[0015] 在一些优选方案中，所述闹羊花毒素III半抗原与所述琥珀酸酐的摩尔比为1:（0.8 1.2），更优选为1：1。
~

[0016] 在一些优选方案中，所述反应在避光条件下进行。

[0017] 在一些优选方案中，所述反应的时间为7 9 h。~

[0018] 按照常规，本发明中的反应温度可以由一些保温装置或保温介质提供，如可以在55 65℃的油浴条件下进行所述反应。
~

[0019] 作为优选，在所述反应后，还包括纯化过程，所述纯化过程具体为：用乙酸乙酯萃取反应产物后，用稀盐酸洗涤有机相，在有机相干燥浓缩后，经C18色谱柱分离纯化，即可获得闹羊花毒素III半抗原。

[0020] 本领域人员可对上述优选方案进行组合，得到本发明较佳实施例。

[0021] 在一个优选方案中，所述闹羊花毒素III半抗原的制备方法具体如下：用5.0 mL无水吡啶分别溶解闹羊花毒素III（20 mg）与琥珀酸酐（5.4 mg），将两种反应液混合，并置于油浴磁力搅拌器避光反应8 h（60 oC，240 rpm），得到反应产物。反应体系加水淬灭后，用乙酸乙酯萃取，后用稀盐酸洗涤，有机相干燥浓缩后，经制备色谱分离纯化后即可获得目标化合物闹羊花毒素III半抗原。

[0022] 第三方面，本发明提供闹羊花毒素III人工抗原，将所述的闹羊花毒素III半抗原与载体蛋白偶联后得到，所述载体蛋白为选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白和人血清白蛋白中的一种或多种；优选牛血清白蛋白或卵清蛋白。

[0023] 优选所述闹羊花毒素III半抗原与所述载体蛋白的摩尔比为（5.5 6）:1，更优选为~5.8:1。

[0024] 本发明进一步提供闹羊花毒素III人工抗原的制备方法，通过碳二亚胺、活泼酯法或混合酸酐法使所述闹羊花毒素III半抗原与载体蛋白偶联。优选活泼酯法。

[0025] 作为优选，所述闹羊花毒素III人工抗原的制备方法包括以下步骤：

[0026] （1）按摩尔比为1：（1.8 2.2）：（1.8 2.2）的比例称取所述闹羊花毒素III半抗原、~ ~N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，用N,N-二甲基甲酰胺溶解后得到反应液，将所述反应液在350 400 rpm下室温避光反应5 h，离心取上清，获得闹羊花毒素III半抗原活化~
液；

[0027] 将所述载体蛋白溶于磷酸盐（PBS）缓冲液中，得到终浓度为4.5 5.5 mg/mL载体蛋~白溶液；

[0028] （2）将所述闹羊花毒素III半抗原活化液滴入所述载体蛋白溶液中，使所述闹羊花o毒素III半抗原与载体蛋白的摩尔比达到（28 32）:1，4  C搅拌过夜反应。
~

[0029] 在上述步骤（1）中，所述闹羊花毒素III半抗原活化液和所述载体蛋白溶液的制备过程不分先后，可根据实际情况进行调整。

[0030] 优选在所述步骤（2）后，还包括：

[0031] （3）将步骤（2）得到的反应液置于透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析3天，离心取上清，即得闹羊花毒素III人工抗原。

[0032] 本发明所述人工抗原分为免疫原和包被原，免疫原为闹羊花毒素III-BSA，包被原为闹羊花毒素III-OVA。

[0033] 第四方面，本发明提供所述的闹羊花毒素III半抗原或闹羊花毒素III人工抗原在以下任一方面的应用：

[0034] ①在制备闹羊花毒素III特异性抗体中的应用；

[0035] ②在检测抗闹羊花毒素III特异性抗体中的应用。

[0036] 进一步的，本发明提供一种抗闹羊花毒素III抗体，以所述的闹羊花毒素III人工抗原为免疫原，免疫动物制备得到；所述抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体。

[0037] 所述动物可以为Balb/c小鼠，新西兰大白兔，绵羊等，优选Balb/c小鼠。

[0038] 作为优选，当所述闹羊花毒素III人工抗原由所述的半抗原和牛血清蛋白偶联得到时，免疫效果更好。

[0039] 第五方面，本发明提供所述的抗闹羊花毒素III抗体在以下任一方面的应用：

[0040] （1）在检测闹羊花毒素III中的应用；

[0041] （2）在制备闹羊花毒素III的免疫层析试纸条中的应用；

[0042] （3）在制备闹羊花毒素III的酶联免疫分析检测试剂盒中的应用。

[0043] 进一步的，本发明提供一种检测试剂或检测试纸，含有所述的抗闹羊花毒素III抗体。

[0044] （三）有益效果

[0045] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

[0046] （1）本发明首次公开了一种新型闹羊花毒素III半抗原、人工抗原及其制备方法，用所述闹羊花毒素III人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体。本发明提供的闹羊花毒素III人工抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的闹羊花毒素III检测方法提供了新手段。

[0047] （2）本发明提供的闹羊花毒素III人工抗原可保持闹羊花毒素III的化学结构不变，并暴露于蛋白表面作为抗原决定簇，为高灵敏度抗闹羊花毒素III抗体的制备奠定基础。

[0048] （3）利用本发明提供的闹羊花毒素III人工抗原制备闹羊花毒素III抗体（尤其是多克隆抗体），制备过程简单、经济，抗体效价最高可达32000，检测灵敏度可达5.2 ng/mL，实用价值高，在公共卫生安全检测中具有良好的应用前景。

附图说明

[0049] 图1为实施例1中的闹羊花毒素III半抗原的合成路线图。

[0050] 图2为实施例1中闹羊花毒素III半抗原的质谱图。

[0051] 图3为实施例2中闹羊花毒素III-BSA的MALDI-TOF-MS图。

[0052] 图4为实施例3中抗血清2#检测闹羊花毒素III的标准曲线图。

具体实施方式

[0053] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0054] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0055] 实施例1 闹羊花毒素III半抗原的制备和鉴定

[0056] （1）用6.0 mL无水吡啶分别溶解闹羊花毒素III（20 mg）与琥珀酸酐（5.4 mg），将两种溶液混合，并置于油浴磁力搅拌器避光反应9 h（60 oC，240 rpm），得到反应产物。合成路线见图1。

[0057] （2）反应体系加水淬灭，用乙酸乙酯萃取，然后用0.1M稀盐酸洗涤，有机相干燥浓缩。

[0058] （3）柱色谱分离即得白色目标化合物闹羊花毒素III半抗原。

[0059] 采用液相串联高分辨质谱对闹羊花毒素III及纯化后的半抗原进行鉴定，根据其合成路线可知，若目标物的化学结构中连接上了琥珀酸酐，则半抗原与闹羊花毒素III相比，精确分子量增加100 Da。闹羊花毒素III在ESI负模式下m/z为367.21261 ([M-H]-)，其元素组成为C20H31O6-；闹羊花毒素III半抗原m/z为467.22811 ([M-H]-)（图2），其元素组成为C24H35O9-。半抗原的精确分子量与闹羊花毒素III相比增加100 Da (C4H4O3)，表明目标物的化学结构中连接上了琥珀酸酐，说明闹羊花毒素III半抗原合成成功，可以用于抗体的制备。

[0060] 实施例2 闹羊花毒素III人工抗原的制备

[0061] （1）分别称取实施例1制得的闹羊花毒素III半抗原（10 mg）、N-羟基琥珀酰亚胺（4.3 mg）和二环己基碳二亚胺（8.6 mg）于玻璃反应瓶中，加入1 mL DMF。将装有反应液的玻璃瓶置于磁力搅拌器上，400 rpm室温避光反应5 h。

[0062] （2）取60 mg BSA（OVA），溶于12 mL含10%（体积百分含量）DMF的PBS缓冲液中，得到蛋白溶液。

[0063] （3）将完成步骤（1）的液相逐滴加入到步骤（2）制备的蛋白溶液中，将反应液置于磁力搅拌器，4℃反应5 h。

[0064] （4）将步骤（3）中蛋白活化液转移到截留分子量为7 KDa的透析袋中，然后将透析袋置于PBS缓冲液中4 ℃透析3天（每12 h换液一次）。

[0065] （5）完成步骤（4）后，取出透析袋，将其中的液相以3000 rpm离心5 min，收集上清液，即为人工抗原闹羊花毒素III-BSA溶液。

[0066] 将步骤（2）中的BSA 替换为OVA，即可得到闹羊花毒素III-OVA。

[0067] 免疫原闹羊花毒素III-BSA经MALDI-TOF-MS鉴定（图3），可得载体蛋白BSA与闹羊花毒素III半抗原的偶联摩尔比为1:5.8，结果证明免疫原合成成功，可用于小鼠免疫，制备单克隆抗体。

[0068] 实施例3 闹羊花毒素III多克隆抗体的制备和鉴定

[0069] 一、闹羊花毒素III多克隆抗体的制备

[0070] 将实施案例2制备的闹羊花毒素III-BSA作为免疫原免疫小鼠，将闹羊花毒素III-OVA作为包被原用来检测小鼠抗血清。用Bradford法测定完全抗原的浓度，经测定可得免疫原和包被原的浓度均为4.5 mg/mL。

[0071] 首次免疫时将免疫原稀释至1 mg/mL (用0.01 M，pH为7.4的PBS进行稀释)，取稀释后的免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，并充分乳化，颈背部皮下多点接种6-8周龄Balb/c小鼠（免疫5只小鼠），接种免疫原剂量为100 μg/只，注射剂量为0.2 mL/只。每隔4周加强免疫一次，加强免疫时将免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化。免疫原的免疫剂量与首次免疫剂量相同，加强免疫次数为3次。

[0072] 二、小鼠多克隆抗体的检测

[0073] 在第3次加强免疫完成一周后对小鼠眼球采血，3000 rpm离心共获得5种抗血清（即多克隆抗体），抗血清分别按照1#-5#的编号依次进行命名。用经典棋盘法测定抗血清效价以及用间接竞争ELISA法测抗血清灵敏度。

[0074] 1、抗血清效价的测定

[0075] 用间接ELISA法对抗体效价进行检测，具体步骤如下：

[0076] (1)包被：用碳酸盐缓冲液（0.05 M, pH 9.6）将包被原闹羊花毒素III-OVA稀释成0.3 μg/mL，并加入96孔透明酶标板中（100 μL/孔），37  °C温箱孵育2 h，用PBST缓冲液（含
0.05% Tween-20 PBS，pH 7.4）洗板3次。

[0077] (2)封闭：加入封闭液（5%脱脂牛奶）150 μL/孔，37  °C温箱孵育1 h，弃封闭液，用PBST缓冲液洗涤1次，拍干。

[0078] (3)加待测抗体：各列孔加入50 μL 0.01 M PBS（pH 7.4），再加入50 μL稀释后的抗闹羊花毒素III多克隆抗体，抗体从1:2000开始，以2倍为梯度用0.01 M PBS进行稀释，共稀释8个梯度。加样量为每孔50 μL，37 oC温箱反应30 min，PBST缓冲液洗涤3次，拍干。

[0079] 同时设置未经免疫的小鼠抗血清作为阴性对照。

[0080] (4)加酶标二抗：加入用酶标二抗稀释液按照体积比1:5000倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG抗体，100 μL/孔，37 °C温箱反应30 min，PBST 缓冲液洗涤3次，拍干。

[0081] (5)显色：将辣根过氧化物酶底物3,3’,5,5’- 四甲基联苯胺溶液和质量分数为30%的过氧化氢按照1:1的体积比混合，加入微孔板中（100 μL/孔），37 °C温箱显色15 min。

[0082] (6)终止：每孔加入50 μL 2 mol/L的浓硫酸。

[0083] (7)读数：以OD450波长测定各孔OD值。以阴性OD值≤0.15，以最大OD值在1.5-1.8之间对应的抗体稀释度为抗体效价。抗血清的最佳稀释度见表1，由表中数据可得，所有抗血清的稀释度均在1:8000以上，说明用合成的半抗原偶联载体蛋白免疫小鼠，可以获得较好的免疫效果。其中抗血清2#的效价最高，为1:32000。

[0084] 2、多克隆抗体IC50的测定

[0085] (1)包被、封闭过程同上。

[0086] (2)加标准品和抗体：每孔加入50 μL闹羊花毒素III标准品溶液和50 μL稀释后的抗体溶液（按照表1中的抗体效价进行稀释），37 ℃孵育30 min，然后用PBST溶液洗涤3次，拍干。标准品溶液的溶剂为PBS缓冲液，标准品浓度分别为0.25, 0.75, 2.25, 6.75, 20.25, 60.75和182.25 ng/mL的溶液，每个浓度三个平行。

[0087] (3)加酶标二抗，显色，终止及读数过程同上。

[0088] 将所测得的数据以-log10（竞争物）值为横坐标，以OD450值为纵坐标，利用Origin 8.0软件中的四参数方程进行拟合，建立标准曲线获得IC50值。5种多克隆抗体的IC50值见表
1，由表中数据可知，2#抗血清的IC50最低。2#抗血清检测闹羊花毒素III的标准曲线图见图
4，有该图可知，2#抗血清对闹羊花毒素III的线性检测范围（IC20-IC80）为1.08-29.2 ng/mL，IC50为5.2 ng/mL。结果表明，本发明中所设计的半抗原结构作为抗原决定簇，可以很好地刺激小鼠产生高灵敏度抗体。

[0089] 表1 抗血清性质表征表

[0090]

[0091] 注：IC50测定时的检测标准物为闹羊花毒素III。

[0092] 3、多克隆抗体特异性的检测

[0093] 选取抗血清IC50最低的2#抗血清进行特异性的测定。检测方法同上。闹羊花毒素III结构类似物（闹羊花毒素I、木藜芦毒素III、木藜芦毒素I）的曲线浓度调整为0、1、3、9、27、81、243、729 ng/mL，设定3个平行，测定抗体的特异性。抗体的特异性用交叉反应率（CR）来表示，具体计算公式为：CR（%）=IC50（闹羊花毒素III）/IC50（结构类似物）×100%[0094] 结果见表2，2#抗血清可以特异性识别闹羊花毒素III，对其他结构类似物的交叉反应率均小于40.3%。

[0095] 表2 抗血清2#的交叉反应率表

[0096]

[0097] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。