飞蝗V-ATPase-V1结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用转让专利
申请号 : CN202010249056.6
文献号 : CN111394371B
文献日 : 2022-01-28
发明人 : 刘晓健 , 梁晓宇 , 史学凯 , 张建珍
申请人 : 山西大学
摘要 :
本发明公开了飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用，飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因包括飞蝗V‑ATPase‑A、V‑ATPase‑B、V‑ATPase‑C、V‑ATPase‑D、V‑ATPase‑E、V‑ATPase‑F和V‑ATPase‑G基因，通过生物信息学方法，从飞蝗转录组数据库中获取V‑ATPase‑A至V‑ATPase‑G基因，分别对其进行克隆测序后获得各基因全长cDNA序列；基于上述各基因序列，通过PCR方法分别获得V‑ATPase‑A至V‑ATPase‑G基因片段，并合成对应的dsRNA，分别将合成的dsRNA注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默靶标基因，从而使飞蝗生长发育受阻导致死亡，致死率达到60.3％‑93.7％。由于本发明的特异性及高效的致死率，对于害虫防治具有重要意义，为害虫防治提供新的途径。
权利要求 :
1.飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因，其特征是：包括以下基因：飞蝗V‑ATPase‑F基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：26。
2.飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因的dsRNA，其特征是：包括以下dsRNA：由飞蝗V‑ATPase‑F基因片段SEQ ID NO：28合成的dsRNA。
3.飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因的dsRNA的合成方法，其特征是：以含有飞蝗V‑ATPase‑F基因SEQ ID NO：26的质粒为模板，对应基因的上游引物和下游引物，PCR扩增获得两端为T7启动子的DNA模板，按照HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit试剂盒说明体外转录合成相应的dsRNA。
4.如权利要求3所述的飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因的dsRNA的合成方法，其特征是：所述飞蝗V‑ATPase‑F基因的上游引物和下游引物分别为：SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：
30。
5.飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因的dsRNA在害虫防治中的应用，其特征是：将权利要求2所述的飞蝗V‑ATPase‑F基因的dsRNA，制备成喷洒式杀虫剂或饵剂，或者将dsRNA转入飞蝗摄食植物体，应用于飞蝗防治中。
说明书 :
飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术及农业害虫防治领域，具体涉及飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用。
背景技术
[0002] 飞蝗Locusta migratoria，是一种洲际性的农业害虫，主要分布于亚、欧、非、澳四大洲。它具有暴发性、群集性和迁飞性的特点，一旦发生，不仅涉及面广，而且来势凶猛，致
灾严重。目前在蝗虫防治工作中，仍以化学杀虫剂为主要手段，化学杀虫剂的大量使用，不
仅容易导致昆虫产生抗药性，并且给生态环境带来严重污染，对人类的健康也构成威胁，因
此研发绿色新型农药对我国防治蝗虫工作具有重要意义。
灾严重。目前在蝗虫防治工作中，仍以化学杀虫剂为主要手段，化学杀虫剂的大量使用，不
仅容易导致昆虫产生抗药性，并且给生态环境带来严重污染，对人类的健康也构成威胁，因
此研发绿色新型农药对我国防治蝗虫工作具有重要意义。
[0003] RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默的现象，自2006年获得诺贝尔奖以来，RNAi技术一直跻身于科技前沿。RNAi不仅是研究基因功能的有
力工具，同时在害虫防治方面也具有极大潜力。通过RNAi进行害虫防治具有如下特点：1)杀
虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；2)RNA在自然界极易降解，无残留；3)对环境无毒
无害，相对安全。目前国际上已将RNAi技术称为第四代杀虫剂核心技术。由美国孟山都公司
研发的表达玉米根叶甲Snf7基因dsRNA的RNAi转基因玉米(MON87411)已经获得美国农业部
(USDA)和环保署(EPA)批准，即将开展商业化应用。实验表明这种转基因玉米不仅可以有效
杀死玉米根甲虫且对蜜蜂等非靶标生物没有明显毒性作用。筛选和鉴定对害虫生长发育至
关重要的基因是应用RNAi技术开发新型杀虫剂的关键环节，因为不是所有的dsRNA都能有
效的沉默靶基因的表达，也不是所有的dsRNA都能杀死害虫。
力工具，同时在害虫防治方面也具有极大潜力。通过RNAi进行害虫防治具有如下特点：1)杀
虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；2)RNA在自然界极易降解，无残留；3)对环境无毒
无害，相对安全。目前国际上已将RNAi技术称为第四代杀虫剂核心技术。由美国孟山都公司
研发的表达玉米根叶甲Snf7基因dsRNA的RNAi转基因玉米(MON87411)已经获得美国农业部
(USDA)和环保署(EPA)批准，即将开展商业化应用。实验表明这种转基因玉米不仅可以有效
杀死玉米根甲虫且对蜜蜂等非靶标生物没有明显毒性作用。筛选和鉴定对害虫生长发育至
关重要的基因是应用RNAi技术开发新型杀虫剂的关键环节，因为不是所有的dsRNA都能有
效的沉默靶基因的表达，也不是所有的dsRNA都能杀死害虫。
[0004] V‑ATPase(Vacuolar‑type ATPase)，一种H+通道蛋白，其广泛存在于原核和真核生物的内涵体、溶酶体等多种细胞器膜及某些特殊细胞的质膜上，调节细胞内外环境的pH，
对维持生物体正常生命活动至关重要。V‑ATPase是一类高度保守的复合酶，由胞外的V1结
构域和跨膜的V0结构域组装而成，其中，V1结构域由A、B、C、D、E、F、G、H大亚基组成，负责ATP
的水解；V0结构域由a,c,c',c",d,e组成(c'存在于酵母细胞中)，行使质子转运功能。目前
未见针对飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因(V‑ATPase‑A、V‑ATPase‑B、V‑ATPase‑C、V‑ATPase‑
D、V‑ATPase‑E、V‑ATPase‑F和V‑ATPase‑G)的相关研究。本发明首次证实分别注射上述飞蝗
V‑ATPase‑V1结构域基因的dsRNA至3龄若虫后出现60.3％‑93.7％致死现象。因此，V‑
ATPase‑V1结构域基因可作为基于RNAi的害虫防治技术的高致死靶标基因。
对维持生物体正常生命活动至关重要。V‑ATPase是一类高度保守的复合酶，由胞外的V1结
构域和跨膜的V0结构域组装而成，其中，V1结构域由A、B、C、D、E、F、G、H大亚基组成，负责ATP
的水解；V0结构域由a,c,c',c",d,e组成(c'存在于酵母细胞中)，行使质子转运功能。目前
未见针对飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因(V‑ATPase‑A、V‑ATPase‑B、V‑ATPase‑C、V‑ATPase‑
D、V‑ATPase‑E、V‑ATPase‑F和V‑ATPase‑G)的相关研究。本发明首次证实分别注射上述飞蝗
V‑ATPase‑V1结构域基因的dsRNA至3龄若虫后出现60.3％‑93.7％致死现象。因此，V‑
ATPase‑V1结构域基因可作为基于RNAi的害虫防治技术的高致死靶标基因。
发明内容
[0005] 针对上述现有技术现状，本发明的目的是提供飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因、基因片段及其dsRNA在致死飞蝗中的应用。
[0006] 本发明提供飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因，包括以下基因：
[0007] 飞蝗V‑ATPase‑A基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，核苷酸长度为1848bp；氨基酸序列为SEQ ID NO：2，序列长度为615个氨基酸；
[0008] 蝗V‑ATPase‑B基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：6，核苷酸长度为1503bp；氨基酸序列是SEQ ID NO：7，序列长度为500个氨基酸；
[0009] 飞蝗V‑ATPase‑C基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：11，核苷酸长度为1158bp；氨基酸序列是SEQ ID NO：12，序列长度为385个氨基酸；
[0010] 飞蝗V‑ATPase‑D基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：16，核苷酸长度为753bp；氨基酸序列是SEQ ID NO：17，序列长度为250个氨基酸；
[0011] 飞蝗V‑ATPase‑E基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：21，核苷酸长度为684bp；氨基酸序列是SEQ ID NO：22，序列长度为227个氨基酸；
[0012] 飞蝗V‑ATPase‑F基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：26，核苷酸长度为372bp；氨基酸序列是SEQ ID NO：27，序列长度为123个氨基酸；
[0013] 飞蝗V‑ATPase‑F基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：31，核苷酸长度为357bp；氨基酸序列是SEQ ID NO：32，序列长度为118个氨基酸。
[0014] 本发明提供的一种飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因片段，包括以下基因片段：
[0015] V‑ATPase‑A基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3；
[0016] V‑ATPase‑B基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：8；
[0017] V‑ATPase‑C基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：13；
[0018] V‑ATPase‑D基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：18；
[0019] V‑ATPase‑E基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：23；
[0020] V‑ATPase‑F基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：28；
[0021] V‑ATPase‑G基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：33。
[0022] 本发明提供的一种飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因的dsRNA，包括以下dsRNA：
[0023] 由飞蝗V‑ATPase‑A基因片段SEQ ID NO：3合成的dsRNA；
[0024] 由飞蝗V‑ATPase‑B基因片段SEQ ID NO：8合成的dsRNA；
[0025] 由飞蝗V‑ATPase‑C基因片段SEQ ID NO：13合成的dsRNA；
[0026] 由飞蝗V‑ATPase‑D基因片段SEQ ID NO：18合成的dsRNA；
[0027] 由飞蝗V‑ATPase‑E基因片段SEQ ID NO：23合成的dsRNA；
[0028] 由飞蝗V‑ATPase‑F基因片段SEQ ID NO：28合成的dsRNA；
[0029] 由飞蝗V‑ATPase‑G基因片段SEQ ID NO：33合成的dsRNA。
[0030] 本发明提供飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因dsRNA在害虫防治中的应用，基于飞蝗V‑ATPase‑V1结构域中包含的飞蝗V‑ATPase‑A、V‑ATPase‑B、V‑ATPase‑C、V‑ATPase‑D、V‑
ATPase‑E、V‑ATPase‑F和V‑ATPase‑G基因，对于其中每一个基因，通过primer premier 5.0
软件设计针对该基因的含有T7启动子的上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得两端为T7
TM
启动子的DNA模板。按照HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEW ENGLAND
Inc.)试剂盒说明体外转录合成相应的dsRNA。通过微量注射器分别将每一个合
成的dsRNA注射进入3龄飞蝗体腔内。结果表明：
ATPase‑E、V‑ATPase‑F和V‑ATPase‑G基因，对于其中每一个基因，通过primer premier 5.0
软件设计针对该基因的含有T7启动子的上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得两端为T7
TM
启动子的DNA模板。按照HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEW ENGLAND
Inc.)试剂盒说明体外转录合成相应的dsRNA。通过微量注射器分别将每一个合
成的dsRNA注射进入3龄飞蝗体腔内。结果表明：
[0031] 注射dsRNA后飞蝗V‑ATPase‑A基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致79.7％的死亡。
[0032] 注射dsRNA后飞蝗V‑ATPase‑B基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致85.7％的死亡。
[0033] 注射dsRNA后飞蝗V‑ATPase‑C基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致69.8％的死亡。
[0034] 注射dsRNA后飞蝗V‑ATPase‑D基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致90.4％的死亡。
[0035] 注射dsRNA后飞蝗V‑ATPase‑E基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致93.7％的死亡。
[0036] 注射dsRNA后飞蝗V‑ATPase‑F基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致77.8％的死亡。
[0037] 注射dsRNA后飞蝗V‑ATPase‑G基因的mRNA表达显著降低，飞蝗出现生长发育受阻并导致60.3％的死亡。
[0038] 其中，在飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因的dsRNA的合成中，基于不同的基因，设计的上游引物和下游引物如下所示：
[0039] 飞蝗V‑ATPase‑A基因的上游引物和下游引物分别为：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；
[0040] 飞蝗V‑ATPase‑B基因的上游引物和下游引物分别为：SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；
[0041] 飞蝗V‑ATPase‑C基因的上游引物和下游引物分别为：SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15；
[0042] 飞蝗V‑ATPase‑D基因的上游引物和下游引物分别为：SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；
[0043] 飞蝗V‑ATPase‑E基因的上游引物和下游引物分别为：SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25；
[0044] 飞蝗V‑ATPase‑F基因的上游引物和下游引物分别为：SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；
[0045] 飞蝗V‑ATPase‑G基因的上游引物和下游引物分别为：SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35。
[0046] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0047] 1、由于本发明的飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因片段合成的dsRNA特异性及高效的致死率，对于害虫防治具有重要的现实意义，可以为害虫防治提供新的途径。
[0048] 2、本发明的dsRNA易于合成，方便制备成喷洒式杀虫剂或饵剂，具有较好的推广应用价值。
附图说明
[0049] 图1为注射V‑ATPase‑A基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑A)至3龄飞蝗后对V‑ATPase‑A基因mRNA表达的影响；dsGFP为对照，dsLmV‑ATPase‑A为处理组，β‑actin为内参基因。其
中***P<0.001。
中***P<0.001。
[0050] 图2为注射V‑ATPase‑A基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑A)至3龄飞蝗后对其生长发育的影响；左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA，即dsLmV‑ATPase‑
A的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时脊线开裂背部弓起并死亡；2为处理组飞蝗3龄
蜕4龄后1‑2天死亡；3为处理组飞蝗4龄蜕5龄前1‑2天死亡；4为处理组飞蝗4龄蜕5龄时旧表
皮无法蜕掉死亡。
A的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时脊线开裂背部弓起并死亡；2为处理组飞蝗3龄
蜕4龄后1‑2天死亡；3为处理组飞蝗4龄蜕5龄前1‑2天死亡；4为处理组飞蝗4龄蜕5龄时旧表
皮无法蜕掉死亡。
[0051] 图3为注射V‑ATPase‑B基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑B)至3龄飞蝗后对V‑ATPase‑B基因mRNA表达的影响。dsGFP为对照，dsLmV‑ATPase‑B为处理组，β‑actin为内参基因。其
中**P<0.01。
中**P<0.01。
[0052] 图4为注射V‑ATPase‑B基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑B)至3龄飞蝗后对其生长发育的影响。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：8合成的dsRNA，即dsLmV‑ATPase‑
B的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时前1‑2天死亡；2为处理组飞蝗3龄蜕4龄时，旧
表皮紧裹虫体无法蜕掉死亡；3为处理组飞蝗3龄蜕4龄后1‑2天死亡。
B的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时前1‑2天死亡；2为处理组飞蝗3龄蜕4龄时，旧
表皮紧裹虫体无法蜕掉死亡；3为处理组飞蝗3龄蜕4龄后1‑2天死亡。
[0053] 图5为注射V‑ATPase‑C基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑C)至3龄飞蝗后对V‑ATPase‑C基因mRNA表达的影响。dsGFP为对照，dsLmV‑ATPase‑C为处理组，β‑actin为内参基因。其
中***P<0.001。
中***P<0.001。
[0054] 图6为注射V‑ATPase‑C基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑C)至3龄飞蝗后对其生长发育的影响。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：13合成的dsRNA，即dsLmV‑
ATPase‑C的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时脊线开裂背部弓起并死亡；2为处理组
飞蝗3龄蜕4龄后1‑2天死亡。
ATPase‑C的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时脊线开裂背部弓起并死亡；2为处理组
飞蝗3龄蜕4龄后1‑2天死亡。
[0055] 图7为注射V‑ATPase‑D基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑D)至3龄飞蝗后对V‑ATPase‑D基因mRNA表达的影响。dsGFP为对照，dsLmV‑ATPase‑C为处理组，β‑actin为内参基因。其
中**P<0.01。
中**P<0.01。
[0056] 图8为注射V‑ATPase‑D基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑D)至3龄飞蝗后对其生长发育的影响。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：18合成的dsRNA，即dsLmV‑
ATPase‑D的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄前1‑2天死亡。2为处理组飞蝗3龄蜕4龄
时无法顺利蜕掉旧表皮死亡。3为处理组飞蝗3龄蜕4龄后1‑2天死亡。
ATPase‑D的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄前1‑2天死亡。2为处理组飞蝗3龄蜕4龄
时无法顺利蜕掉旧表皮死亡。3为处理组飞蝗3龄蜕4龄后1‑2天死亡。
[0057] 图9为注射V‑ATPase‑E基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑E)至3龄飞蝗后对V‑ATPase‑E基因mRNA表达的影响。dsGFP为对照，dsLmV‑ATPase‑E为处理组，β‑actin为内参基因。其
中***P<0.001。
中***P<0.001。
[0058] 图10为注射V‑ATPase‑E基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑E)至3龄飞蝗后对其生长发育的影响。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：23合成的dsRNA，即dsLmV‑
ATPase‑E的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄前1‑2天死亡；2为处理组飞蝗3龄蜕4龄
时脊线开裂背部弓起并死亡。
ATPase‑E的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄前1‑2天死亡；2为处理组飞蝗3龄蜕4龄
时脊线开裂背部弓起并死亡。
[0059] 图11为注射V‑ATPase‑F基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑F)至3龄飞蝗后对V‑ATPase‑F基因mRNA表达的影响。dsGFP为对照，dsLmV‑ATPase‑F为处理组，β‑actin为内参基因。其
中**P<0.01。
中**P<0.01。
[0060] 图12为注射V‑ATPase‑F基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑F)至3龄飞蝗后对其生长发育的影响。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：28合成的dsRNA，即dsLmV‑
ATPase‑F的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时无法顺利蜕掉旧表皮并死亡；2为处理
组飞蝗3龄蜕4龄后1‑2天死亡。
ATPase‑F的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时无法顺利蜕掉旧表皮并死亡；2为处理
组飞蝗3龄蜕4龄后1‑2天死亡。
[0061] 图13为注射V‑ATPase‑G基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑G)至3龄飞蝗后对V‑ATPase‑G基因mRNA表达的影响。dsGFP为对照，dsLmV‑ATPase‑G为处理组，β‑actin为内参基因。其
中***P<0.001。
中***P<0.001。
[0062] 图14为注射V‑ATPase‑G基因的dsRNA(dsLmV‑ATPase‑G)至3龄飞蝗后对其生长发育的影响。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：33合成的dsRNA，即dsLmV‑
ATPase‑G的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄前1‑2天死亡。2为处理组飞蝗3龄蜕4龄
时无法顺利蜕掉旧表皮死亡。
ATPase‑G的处理组。其中，1为处理组飞蝗3龄蜕4龄前1‑2天死亡。2为处理组飞蝗3龄蜕4龄
时无法顺利蜕掉旧表皮死亡。
具体实施方式
[0063] 下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0064] 飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因，包括以下基因：
[0065] 飞蝗V‑ATPase‑A基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1；
[0066] 飞蝗V‑ATPase‑B基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：6；
[0067] 飞蝗V‑ATPase‑C基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：11；
[0068] 飞蝗V‑ATPase‑D基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：16；
[0069] 飞蝗V‑ATPase‑E基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：21；
[0070] 飞蝗V‑ATPase‑F基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：26；
[0071] 飞蝗V‑ATPase‑G基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：31。
[0072] 实施例1：飞蝗V‑ATPase‑V1结构域中各基因及基因片段的获得
[0073] 1)飞蝗V‑ATPase‑V1结构域中各基因的获得
[0074] 飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因包括飞蝗V‑ATPase‑A、飞蝗V‑ATPase‑B、飞蝗V‑ATPase‑C、飞蝗V‑ATPase‑D、飞蝗V‑ATPase‑E、飞蝗V‑ATPase‑F和飞蝗V‑ATPase‑G共7个基
因。
因。
[0075] 基于飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗V‑ATPase‑A、飞蝗V‑ATPase‑B、飞蝗V‑ATPase‑C、飞蝗V‑ATPase‑D、飞蝗V‑ATPase‑E、飞蝗V‑ATPase‑F和飞蝗V‑
ATPase‑G基因进行搜索，获得飞蝗V‑ATPase‑A基因(LmV‑ATPase‑A)序列，飞蝗V‑ATPase‑B
基因(LmV‑ATPase‑B)序列，飞蝗V‑ATPase‑C基因(LmV‑ATPase‑C)序列，飞蝗V‑ATPase‑D基
因(LmV‑ATPase‑D)序列，飞蝗V‑ATPase‑E基因(LmV‑ATPase‑E)序列，飞蝗V‑ATPase‑F基因
(LmV‑ATPase‑F)序列，飞蝗V‑ATPase‑G基因(LmV‑ATPase‑G)序列。
ATPase‑G基因进行搜索，获得飞蝗V‑ATPase‑A基因(LmV‑ATPase‑A)序列，飞蝗V‑ATPase‑B
基因(LmV‑ATPase‑B)序列，飞蝗V‑ATPase‑C基因(LmV‑ATPase‑C)序列，飞蝗V‑ATPase‑D基
因(LmV‑ATPase‑D)序列，飞蝗V‑ATPase‑E基因(LmV‑ATPase‑E)序列，飞蝗V‑ATPase‑F基因
(LmV‑ATPase‑F)序列，飞蝗V‑ATPase‑G基因(LmV‑ATPase‑G)序列。
[0076] 采用primer premier 5.0软件分别设计各自的上下游引物用于验证上述获得的各序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。选取生长健康，大小一致雌雄各半
的3龄飞蝗若虫4头，在体式显微镜下将其体壁快速解剖下来，并冷冻于液氮中。依照TaKaRa
RNAiso Plus试剂盒提取RNA，采用Reverse Transcriptase M‑MLV(RNase H‑)试剂按照说
明书将所提RNA反转录成第一链cDNA，以此cDNA为模板，结合设计的各个基因的上下游引
物，通过PCR扩增LmV‑ATPase‑A基因cDNA全长序列，LmV‑ATPase‑B基因cDNA全长序列，LmV‑
ATPase‑C基因cDNA全长序列，LmV‑ATPase‑D基因cDNA全长序列，LmV‑ATPase‑E基因cDNA全
长序列，LmV‑ATPase‑F基因cDNA全长序列，LmV‑ATPase‑G基因cDNA全长序列。将得到的各个
产物分别进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，并送往生工生物工程(上海)股份有限公司进
行测序，结果为：
的3龄飞蝗若虫4头，在体式显微镜下将其体壁快速解剖下来，并冷冻于液氮中。依照TaKaRa
RNAiso Plus试剂盒提取RNA，采用Reverse Transcriptase M‑MLV(RNase H‑)试剂按照说
明书将所提RNA反转录成第一链cDNA，以此cDNA为模板，结合设计的各个基因的上下游引
物，通过PCR扩增LmV‑ATPase‑A基因cDNA全长序列，LmV‑ATPase‑B基因cDNA全长序列，LmV‑
ATPase‑C基因cDNA全长序列，LmV‑ATPase‑D基因cDNA全长序列，LmV‑ATPase‑E基因cDNA全
长序列，LmV‑ATPase‑F基因cDNA全长序列，LmV‑ATPase‑G基因cDNA全长序列。将得到的各个
产物分别进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，并送往生工生物工程(上海)股份有限公司进
行测序，结果为：
[0077] 飞蝗V‑ATPase‑A基因序列为SEQ ID NO：1，核苷酸长度为1848bp；
[0078] 飞蝗V‑ATPase‑B基因序列为SEQ ID NO：6，核苷酸长度为1503bp；
[0079] 飞蝗V‑ATPase‑C基因序列为SEQ ID NO：11，核苷酸长度为1158bp；
[0080] 飞蝗V‑ATPase‑D基因序列为SEQ ID NO：16，核苷酸长度为753bp；
[0081] 飞蝗V‑ATPase‑E基因序列为SEQ ID NO：21，核苷酸长度为684bp；
[0082] 飞蝗V‑ATPase‑F基因序列为SEQ ID NO：26，核苷酸长度为372bp；
[0083] 飞蝗V‑ATPase‑G基因序列为SEQ ID NO：31，核苷酸长度为357bp。
[0084] 2)飞蝗V‑ATPase‑V1结构域中各基因的氨基酸序列分析
[0085] 通过ExPaSy在线软件分别对已获LmV‑ATPase‑A、LmV‑ATPase‑B、LmV‑ATPase‑C、LmV‑ATPase‑D、LmV‑ATPase‑E、LmV‑ATPase‑F、LmV‑ATPase‑G基因的核苷酸序列进行翻译，
预测各基因的开放阅读框编码、分子量和等电点，结果如下：
预测各基因的开放阅读框编码、分子量和等电点，结果如下：
[0086] LmV‑ATPase‑A基因的开放阅读框编码615个氨基酸，分子量为58KDa，等电点为5.11；
[0087] LmV‑ATPase‑B基因的开放阅读框编码500个氨基酸，分子量为55.6KDa，等电点为5.33；
[0088] LmV‑ATPase‑C基因的开放阅读框编码385个氨基酸，分子量为44.4KDa，等电点为8.16；
[0089] LmV‑ATPase‑D基因的开放阅读框编码250个氨基酸，分子量为28KDa，等电点为9.63；
[0090] LmV‑ATPase‑E基因的开放阅读框编码227个氨基酸，分子量为28KDa，等电点为8.51；
[0091] LmV‑ATPase‑F基因的开放阅读框编码123个氨基酸，分子量为13.8KDa，等电点为5.92；
[0092] LmV‑ATPase‑G基因的开放阅读框编码118个氨基酸，分子量为14KDa，等电点为9.66。
[0093] 3)飞蝗V‑ATPase‑V1结构域中各基因片段的获得
[0094] 根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列，采用primer premier 5.0软件设计特异性引物，上游引物序列为SEQ ID NO：4，下游引物序列为SEQ ID NO：5，所有引物均由生工生物工程
(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：1的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑ATPase‑
A基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程(上海)股
份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：3。
(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：1的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑ATPase‑
A基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程(上海)股
份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：3。
[0095] 根据SEQ ID NO：6的核苷酸序列，采用primer premier 5.0软件设计特异性引物，上游引物序列为SEQ ID NO：9，下游引物序列为SEQ ID NO：10，所有引物均由生工生物工程
(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：6的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑ATPase‑
B基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程(上海)股
份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：8。
(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：6的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑ATPase‑
B基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程(上海)股
份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：8。
[0096] 根据SEQ ID NO：11的核苷酸序列，采用primer premier 5.0软件设计特异性引物，上游引物序列为SEQ ID NO：14，下游引物序列为SEQ ID NO：15，所有引物均由生工生物
工程(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：11的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑
ATPase‑C基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程
(上海)股份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：13。
工程(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：11的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑
ATPase‑C基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程
(上海)股份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：13。
[0097] 根据SEQ ID NO：16的核苷酸序列，采用primer premier 5.0软件设计特异性引物，上游引物序列为SEQ ID NO：19，下游引物序列为SEQ ID NO：20，所有引物均由生工生物
工程(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：16的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑
ATPase‑A基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程
(上海)股份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：18。
工程(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：16的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑
ATPase‑A基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程
(上海)股份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：18。
[0098] 根据SEQ ID NO：21的核苷酸序列，采用primer premier 5.0软件设计特异性引物，上游引物序列为SEQ ID NO：24，下游引物序列为SEQ ID NO：25，所有引物均由生工生物
工程(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：21的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑
ATPase‑A基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程
(上海)股份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：23。
工程(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：21的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑
ATPase‑A基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程
(上海)股份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：23。
[0099] 根据SEQ ID NO：26的核苷酸序列，采用primer premier 5.0软件设计特异性引物，上游引物序列为SEQ ID NO：29，下游引物序列为SEQ ID NO：30，所有引物均由生工生物
工程(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：26的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑
ATPase‑A基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程
(上海)股份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：28。
工程(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：26的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑
ATPase‑A基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程
(上海)股份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：28。
[0100] 根据SEQ ID NO：31的核苷酸序列，采用primer premier 5.0软件设计特异性引物，上游引物序列为SEQ ID NO：34，下游引物序列为SEQ ID NO：35，所有引物均由生工生物
工程(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：31的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑
ATPase‑A基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程
(上海)股份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：33。
工程(上海)股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO：31的质粒为模板，PCR扩增获得飞蝗V‑
ATPase‑A基因片段，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，送往生工生物工程
(上海)股份有限公司进行测序，其序列为SEQ ID NO：33。
[0101] 实施例2：飞蝗V‑ATPase‑V1结构域中各基因特异性dsRNA合成
[0102] 分别以实施例1中获得的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：33的基因片段为模板，经Gel Extraction
TM
Kit(OMEGA)试剂盒纯化后按照HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEW
ENGLAND Inc.)试剂盒说明体外转录合成相应的dsRNA。使用NANODROP 2000
(Thermo scientific)进行定量，使其终浓度达到2μg/μL。保存于‑80℃超级低温冰箱备用。
TM
Kit(OMEGA)试剂盒纯化后按照HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEW
ENGLAND Inc.)试剂盒说明体外转录合成相应的dsRNA。使用NANODROP 2000
(Thermo scientific)进行定量，使其终浓度达到2μg/μL。保存于‑80℃超级低温冰箱备用。
[0103] 实施例3：飞蝗V‑ATPase‑V1结构域中各基因dsRNA致死飞蝗实验
[0104] 1)飞蝗V‑ATPase‑V1结构域各基因dsRNA的注射
[0105] 选取生长健康、大小一致共72头3龄第1天若虫进行LmV‑ATPase‑A基因dsRNA(dsLmV‑ATPase‑A)的注射。将合成的dsLmV‑ATPase‑A使用微量注射器将3μL(6μg dsLmV‑
ATPase‑A)轻轻注射进入若虫侧腹部的二、三腹节之间。同时注射相同量的dsGFP至对照组。
将注射dsRNA后飞蝗置于人工气候箱中饲养(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，湿度
60％)，每天饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸。
ATPase‑A)轻轻注射进入若虫侧腹部的二、三腹节之间。同时注射相同量的dsGFP至对照组。
将注射dsRNA后飞蝗置于人工气候箱中饲养(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，湿度
60％)，每天饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸。
[0106] V‑ATPase‑B基因dsRNA(dsLmV‑ATPase‑B)的注射方法以及注射飞蝗数量与V‑ATPase‑A基因dsRNA的相同。对照组为注射相同量的dsGFP。
[0107] V‑ATPase‑C基因dsRNA(dsLmV‑ATPase‑C)的注射方法以及注射飞蝗数量与V‑ATPase‑A基因dsRNA的相同。对照组为注射相同量的dsGFP。
[0108] V‑ATPase‑D基因dsRNA(dsLmV‑ATPase‑D)的注射方法以及注射飞蝗数量与V‑ATPase‑A基因dsRNA的相同。对照组为注射相同量的dsGFP。
[0109] V‑ATPase‑E基因dsRNA(dsLmV‑ATPase‑E)的注射方法以及注射飞蝗数量与V‑ATPase‑A基因dsRNA的相同。对照组为注射相同量的dsGFP。
[0110] V‑ATPase‑F基因dsRNA(dsLmV‑ATPase‑F)的注射方法以及注射飞蝗数量与V‑ATPase‑A基因dsRNA的相同。对照组为注射相同量的dsGFP。
[0111] V‑ATPase‑G基因dsRNA(dsLmV‑ATPase‑G)的注射方法以及注射飞蝗数量与V‑ATPase‑A基因dsRNA的相同。对照组为注射相同量的dsGFP。
[0112] 2)飞蝗V‑ATPase‑V1结构域各基因沉默效率检测
[0113] 分别收集注射dsGFP的对照组和注射dsLmV‑ATPase‑A、dsLmV‑ATPase‑B、dsLmV‑ATPase‑C、dsLmV‑ATPase‑D、dsLmV‑ATPase‑E、dsLmV‑ATPase‑F和dsLmV‑ATPase‑G的处理组
24h这一时间点的若虫进行总RNA提取，对照和注射V‑ATPase‑V1结构域各基因dsRNA组均为
3个生物学重复，每个生物学重复3头试虫，并反转录成第一链cDNA，采用RT‑qPCR方法分别
检测各个靶标基因(LmV‑ATPase‑A、LmV‑ATPase‑B、dsLmV‑ATPase‑C、LmV‑ATPase‑D、LmV‑
ATPase‑E、LmV‑ATPase‑F和LmV‑ATPase‑G)和内参基因(β‑actin)的相对表达量，从而对其
沉默效率进行计算。RT‑qPCR反应体系及程序参考 Green Realtime PCR Master
Mix(TOYOBO)说明书。结果表明，与对照组比较，注射dsLmV‑ATPase‑A组试虫LmV‑ATPase‑A
基因表达显著降低，***P<0.001(图1)，注射dsLmV‑ATPase‑B组试虫LmV‑ATPase‑B基因表达
显著降低，**P<0.01(图3)，注射dsLmV‑ATPase‑C组试虫LmV‑ATPase‑C基因表达显著降
低，***P<0.001(图5)，注射dsLmV‑ATPase‑D组试虫LmV‑ATPase‑D基因表达显著降低，***P<
0.001(图7)，注射dsLmV‑ATPase‑E组试虫LmV‑ATPase‑E基因表达显著降低，***P<0.001(图
9)，注射dsLmV‑ATPase‑F组试虫LmV‑ATPase‑F基因表达显著降低，***P<0.001(图11)、注射
dsLmV‑ATPase‑G组试虫LmV‑ATPase‑G基因表达显著降低，***P<0.001(图13)。
24h这一时间点的若虫进行总RNA提取，对照和注射V‑ATPase‑V1结构域各基因dsRNA组均为
3个生物学重复，每个生物学重复3头试虫，并反转录成第一链cDNA，采用RT‑qPCR方法分别
检测各个靶标基因(LmV‑ATPase‑A、LmV‑ATPase‑B、dsLmV‑ATPase‑C、LmV‑ATPase‑D、LmV‑
ATPase‑E、LmV‑ATPase‑F和LmV‑ATPase‑G)和内参基因(β‑actin)的相对表达量，从而对其
沉默效率进行计算。RT‑qPCR反应体系及程序参考 Green Realtime PCR Master
Mix(TOYOBO)说明书。结果表明，与对照组比较，注射dsLmV‑ATPase‑A组试虫LmV‑ATPase‑A
基因表达显著降低，***P<0.001(图1)，注射dsLmV‑ATPase‑B组试虫LmV‑ATPase‑B基因表达
显著降低，**P<0.01(图3)，注射dsLmV‑ATPase‑C组试虫LmV‑ATPase‑C基因表达显著降
低，***P<0.001(图5)，注射dsLmV‑ATPase‑D组试虫LmV‑ATPase‑D基因表达显著降低，***P<
0.001(图7)，注射dsLmV‑ATPase‑E组试虫LmV‑ATPase‑E基因表达显著降低，***P<0.001(图
9)，注射dsLmV‑ATPase‑F组试虫LmV‑ATPase‑F基因表达显著降低，***P<0.001(图11)、注射
dsLmV‑ATPase‑G组试虫LmV‑ATPase‑G基因表达显著降低，***P<0.001(图13)。
[0114] 3)注射V‑ATPase‑V1结构域各基因dsRNA后3龄若虫表型观察
[0115] 3龄若虫注射dsLmV‑ATPase‑A后，对照组虫体在第5天全部成功蜕皮至4龄，且蜕皮后虫体发育状态良好。与对照组比较，注射dsLmV‑ATPase‑A后飞蝗，死亡率达到79.7％，表
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时脊线开裂背部弓起并死亡；2为处理组飞蝗3龄蜕4龄后
1‑2天死亡。3为处理组飞蝗4龄蜕5龄前1‑2天死亡；4为处理组飞蝗4龄蜕5龄时旧表皮无法
蜕掉并死亡，结果如图2所示。
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时脊线开裂背部弓起并死亡；2为处理组飞蝗3龄蜕4龄后
1‑2天死亡。3为处理组飞蝗4龄蜕5龄前1‑2天死亡；4为处理组飞蝗4龄蜕5龄时旧表皮无法
蜕掉并死亡，结果如图2所示。
[0116] 3龄若虫注射dsLmV‑ATPase‑B后，对照组虫体在第5天全部成功蜕皮至4龄，且蜕皮后虫体发育状态良好。与对照组比较，注射dsLmV‑ATPase‑B后飞蝗，死亡率达到85.7％，表
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时前1‑2天死亡。2为处理组飞蝗3龄蜕4龄时，旧表皮紧裹
虫体无法蜕掉死亡。3为处理组飞蝗3龄蜕4龄后1‑2天死亡，结果如图4所示。
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时前1‑2天死亡。2为处理组飞蝗3龄蜕4龄时，旧表皮紧裹
虫体无法蜕掉死亡。3为处理组飞蝗3龄蜕4龄后1‑2天死亡，结果如图4所示。
[0117] 3龄若虫注射dsLmV‑ATPase‑C后，对照组虫体在第5天全部成功蜕皮至4龄，且蜕皮后虫体发育状态良好。与对照组比较，注射dsLmV‑ATPase‑C后飞蝗，死亡率达到69.8％，表
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时脊线开裂无法顺利蜕皮并死亡；2为处理组飞蝗3龄蜕4
龄后1‑2天死亡，结果如图6所示。
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时脊线开裂无法顺利蜕皮并死亡；2为处理组飞蝗3龄蜕4
龄后1‑2天死亡，结果如图6所示。
[0118] 3龄若虫注射dsLmV‑ATPase‑D后，对照组虫体在第5天全部成功蜕皮至4龄，且蜕皮后虫体发育状态良好。与对照组比较，注射dsLmV‑ATPase‑D后飞蝗，死亡率达到90.4％，表
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄前1‑2天死亡。2为处理组飞蝗3龄蜕4龄时无法顺利蜕掉旧
表皮死亡。3为处理组飞蝗3龄蜕4龄后1‑2天死亡，结果如图8所示。
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄前1‑2天死亡。2为处理组飞蝗3龄蜕4龄时无法顺利蜕掉旧
表皮死亡。3为处理组飞蝗3龄蜕4龄后1‑2天死亡，结果如图8所示。
[0119] 3龄若虫注射dsLmV‑ATPase‑E后，对照组虫体在第5天全部成功蜕皮至4龄，且蜕皮后虫体发育状态良好。与对照组比较，注射dsLmV‑ATPase‑E后飞蝗，死亡率达到93.5％，表
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄前1‑2天死亡。2为处理组飞蝗3龄蜕4龄时脊线开裂背部弓
起并死亡，结果如图10所示。
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄前1‑2天死亡。2为处理组飞蝗3龄蜕4龄时脊线开裂背部弓
起并死亡，结果如图10所示。
[0120] 3龄若虫注射dsLmV‑ATPase‑F后，对照组虫体在第5天全部成功蜕皮至4龄，且蜕皮后虫体发育状态良好。与对照组比较，注射dsLmV‑ATPase‑F后飞蝗，死亡率达到77.8％，表
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时无法顺利蜕掉旧表皮并死亡；2为处理组飞蝗3龄蜕4龄
后1‑2天死亡，结果如图12所示。
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄时无法顺利蜕掉旧表皮并死亡；2为处理组飞蝗3龄蜕4龄
后1‑2天死亡，结果如图12所示。
[0121] 3龄若虫注射dsLmV‑ATPase‑G后，对照组虫体在第5天全部成功蜕皮至4龄，且蜕皮后虫体发育状态良好。与对照组比较，注射dsLmV‑ATPase‑G后飞蝗，死亡率达到60.3％，表
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄前1‑2天死亡。2为处理组飞蝗3龄蜕4龄时无法顺利蜕掉旧
表皮死亡，结果如图14所示。
型如下：1为处理组飞蝗3龄蜕4龄前1‑2天死亡。2为处理组飞蝗3龄蜕4龄时无法顺利蜕掉旧
表皮死亡，结果如图14所示。
[0122] 综上所述，飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因片段包括的飞蝗V‑ATPase‑A、飞蝗V‑ATPase‑B、飞蝗V‑ATPase‑C、飞蝗V‑ATPase‑D、飞蝗V‑ATPase‑E、飞蝗V‑ATPase‑F、飞蝗V‑
ATPase‑G的基因片段，由各基因片段合成的dsRNA，分别注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉
默靶标基因，从而使飞蝗生长发育受阻导致死亡，致死率达到60.3％‑93.7％。因此，飞蝗V‑
ATPase‑V1结构域基因的dsRNA应用于飞蝗防治中，具体实现方法为：将所述dsRNA制备成喷
洒式杀虫剂，或者dsRNA制备成饵剂，或者将dsRNA转入飞蝗摄食植物体。任选其中一种或几
种dsRNA制备成喷洒式杀虫剂或饵剂，或者将dsRNA转入飞蝗摄食植物体，应用于飞蝗防治
中。
ATPase‑G的基因片段，由各基因片段合成的dsRNA，分别注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉
默靶标基因，从而使飞蝗生长发育受阻导致死亡，致死率达到60.3％‑93.7％。因此，飞蝗V‑
ATPase‑V1结构域基因的dsRNA应用于飞蝗防治中，具体实现方法为：将所述dsRNA制备成喷
洒式杀虫剂，或者dsRNA制备成饵剂，或者将dsRNA转入飞蝗摄食植物体。任选其中一种或几
种dsRNA制备成喷洒式杀虫剂或饵剂，或者将dsRNA转入飞蝗摄食植物体，应用于飞蝗防治
中。
[0123] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵
盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
[0124] LmV‑ATPase‑A SEQ ID NO：1
[0125] atgacgagcacattgataaagacgtccgatgaggaccgggagtccaaattcggctttgtttttgccgtatctggacctgtggtgacagctgaacgaatggccggttctgctatgtacgaactggtgcgtgtcggttattatgaa
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taggcgatcccgtgctgcgcacaggcaagccgctgtccgtggaactgggacccggaatcatgggcagcatcttcga
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tgtacggtttggtccacgaaaatactctggtgaaacacaagttgctgctgccgccccgtgccaagggaactgtcac
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ttcagcaagccttcaggaacctggaggattaa
[0126] LmV‑ATPase‑A SEQ ID NO：2
[0127] MTSTLIKTSDEDRESKFGFVFAVSGPVVTAERMAGSAMYELVRVGYYELVGEIIRLEGDMATIQVYEDTSGVTVGDPVLRTGKPLSVELGPGIMGSIFDGIQRPLKDINELSNSIYIPKGVNVPALSRTAQWDFSPVSVKVGSHIT
GGDLYGLVHENTLVKHKLLLPPRAKGTVTYIAEPGNYTVDDVVLETEFDGERSKFTMLQVWPVRQPRPVTEKLPANY
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[0128] LmV‑ATPase‑A SEQ ID NO：3
[0129] gcaaacacatcaaacatgcctgtggctgctcgagaagcatctatctacacaggtattacactgtcagaatacttcagggacatgggttacaatgtatccatgatggctgactcaacttcacgatgggccgaagctcttcgagaa
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[0130] LmV‑ATPase‑A SEQ ID NO：4
[0131] taatacgactcactataggggcaaacacatcaaacatgcc
[0132] LmV‑ATPase‑A SEQ ID NO：5
[0133] taatacgactcactatagggacctttgtacgcagtgggac
[0134] LmV‑ATPase‑B SEQ ID NO：6
[0135] atgtcgtacaacaaagttataagtccaaatcaggcgaataaagaacatgttttggcagtttcaagagattttatatcccagcctcgtctaacatataaaactgtatctggtgtcaatggaccactagttattctcgacgaagtt
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[0136] LmV‑ATPase‑B SEQ ID NO：7
[0137] MSYNKVISPNQANKEHVLAVSRDFISQPRLTYKTVSGVNGPLVILDEVKFPKFAEIVQLKLADGTIRSGQVLEVSGSKAVVQVFEGTSGIDAKNTLCEFTGDILRTPVSEDMLGRVFNGSGKPIDKGPPILAEDYLDIQGQPINPW
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[0139] tgacagctgctgaattcctggcatatcaatgtgagaaacacgtattagtcattctcacagacatgagttcatatgctgaggctttgcgagaggtttcagctgctagggaggaagtaccagggcgaagaggattccctggttaca
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ttgatatggttgatactaaagtgtaa
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[0147] MTEYWLISAPGDKTCQQTWETLNNLTSKQNNVSVNYKFHIPDLKVGTLDQLVGLSDDLGKLDSYVEQVTRKVAAYLGEVLEDQRDKLHENLLANNSDLPGYITRFQWDMAKYPIKQSLRNIADIISKQVGQIDADLKTKSTAYNNL
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VDMVDTKV
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[0154] LmV‑ATPase‑D SEQ ID NO：16
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[0158] LmV‑ATPase‑D SEQ ID NO：18
[0159] gcgcagatgttaatgaaagctagactaaaaggagcacaaaaaggtcacagtttactgaagaaaaaggcagatgctttgcaaatgcgatttcggcagatactgggcaaaatcatagagactaagacgctcatgggagaagtaatg
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[0167] MALSDADVQKQIKHMMAFIDQEANEKAEEIDAKAEEEFNIEKGRLVQQQRLKIMEYYERKEKQVELQKKIQSSNMLNQARLKALKVREDHVRGVLEEARKRLGEITKDQSRYSHVLHQLIMQGLLQLLEPNVTVRTREVDQRIVDS
ILPAITQKYKEITGGKDISLKVDTEAFLNPEVTGGIELLAQKGRIKIVNTLEARLELIAQQLIPEIRCALFGRNPNR
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[0168] LmV‑ATPase‑E SEQ ID NO：23
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ccatccttatgatgccaccaaagattcgatattacgtagggcaaagggaatgttcaacccagatgacttcaagtaa
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[0180] LmV‑ATPase‑F SEQ ID NO：29
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[0182] LmV‑ATPase‑F SEQ ID NO：30
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[0184] LmV‑ATPase‑G SEQ ID NO：31
[0185] atggctagccagactcagggaattcaacagcttctagcagctgaaaaaagggcagcagagaaggtttcagaagcaagaaagcgaaaagcacgcaggttgaaacaggccaaagaagaagcccaggaagaaattgaaaaatacaga
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[0189] aagggcagcagagaaggtttcagaagcaagaaagcgaaaagcacgcaggttgaaacaggccaaagaagaagcccaggaagaaattgaaaaatacagacaagaaagagagaggcagtttaaagagtttgaagcaaagcacatggg
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[0192] LmV‑ATPase‑G SEQ ID NO：35
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