以高盐糖蜜为原料进行发酵制备PHA的方法

摘要

本发明涉及PHA发酵领域，具体涉及一种以高盐糖蜜为原料进行发酵制备PHA的方法。该方法包括：在能够发酵产PHA的条件下，将PHA发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵；其中，所述发酵培养基含有高盐糖蜜，以高盐糖蜜的干重为基准，盐含量为8‑11重量百分比，糖含量为40‑70重量百分比。该方法能够有效降低PHA的生产成本，且发酵效率还得到了提升。

权利要求

1.一种发酵制备PHA的方法，其特征在于，在能够发酵产PHA的条件下，将PHA发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵；

其中，所述发酵培养基含有高盐糖蜜，以高盐糖蜜的干重为基准，盐含量为8-11重量百分比，糖含量为40-70重量百分比；

其中，所述发酵培养基由高盐糖蜜、酵母粉、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁和氯化钠组成；相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜的含量为15-35ml、酵母粉的含量为15-17g、磷酸氢二钾的含量为2-5g、磷酸氢二钠的含量为5-8g、硫酸镁的含量为0.2-0.3g、氯化钠的含量为

45-55g；

其中，所述发酵在搅拌的条件下进行，从发酵0h到发酵8-12h，所述搅拌的转速为400-

600rpm；

从发酵8-12h到发酵16-20h，所述搅拌的转速为600-1000rpm；

从发酵16-20h到发酵结束，所述搅拌的转速为400-600rpm；

其中，该方法还包括在发酵的过程中补加营养物质，所述营养物质的补加量使得发酵培养基中的糖含量控制在5-20g/L；

所述营养物质的补加方法包括：

（1）当发酵培养基中的糖含量第一次下降至12g/L以下时，补充第一营养物质，所述第一营养物质的碳氮比为10-20：1，第一营养物质的补充量为发酵培养基的8-12体积百分比；

（2）当第一营养物质补充结束后，补充第二营养物质，所述第二营养物质的碳氮比为

30-50：1，第二营养物质的补充量为发酵培养基的5-10体积百分比；

（3）当第二营养物质补充结束后，补充第三营养物质，所述第三营养物质为高盐糖蜜，第三营养物质的补充量为发酵培养基的20-30体积百分比。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：温度为30-45℃，pH值为7-

9，溶氧量为1-40%。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述发酵在通风的条件下进行，通风量为0.5-

1.5vvm。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一营养物质含有高盐糖蜜和酵母粉；和/或所述第二营养物质含有高盐糖蜜和酵母粉；和/或所述第三营养物质为高盐糖蜜。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵为连续式发酵或间歇式发酵。

说明书

以高盐糖蜜为原料进行发酵制备PHA的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及PHA发酵领域，具体涉及一种以高盐糖蜜为原料进行发酵制备PHA的方法。

背景技术

[0002] 当前社会飞速发展，绿色环保已经成为当代化工产品的主旋律，以往的化石提炼材料已经越来越难满足环境保护的需求。正是在这样的趋势下，生物可降解材料的开发与生产显得更为迫切与必须。PHA是一种可生物降解的新型可塑原料，它具备和传统塑料制品相似的材料学性质。PHA可以在大多数微生物体内作为供能物质积累和储存，利用生物发酵的方法可以大规模生产和提取纯化。

[0003] 在大多数PHA发酵工艺中，往往使用单一糖类——主要是单糖，例如葡萄糖作为主要碳源进行培养。PHA主要是在高碳低氮的失衡条件下进行积累的，因此葡萄糖的使用贯穿整个PHA发酵过程，在整体发酵成本中占比较大的部分。因此找到能够替代葡萄糖且发酵性能又高的廉价碳源，将会更好地节约PHA发酵成本。

发明内容

[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供以高盐糖蜜为原料进行发酵制备PHA的方法，该方法能够有效降低PHA的生产成本，且发酵效率还得到了提升。

[0005] 在一些糖类加工工厂中会产生很多工业副产物糖蜜，糖蜜成深色浓稠状，其中富含蔗糖、葡萄糖、果糖。一些糖蜜由于受加工过程的影响还会富集盐分形成高盐糖蜜，该类糖蜜的含盐量约占总成分的8%以上。高盐糖蜜虽然糖含量高，但是盐浓度高、色素含量大、粘稠度高，导致其作为副产物的处理难度加大。本发明的发明人发现，将该种高盐糖蜜运用到PHA的发酵（耐盐菌）生产过程中，替代葡萄糖进行发酵，一方面，高盐糖蜜的使用减少了发酵过程中外源盐的添加，有效提高了工业副产物的利用率，降低了成本；第二方面，高盐糖蜜富含多种微量元素，以及微生物生长所必需的N、P化合物，维生素等，能够有效促进菌体生长，在使用过程中可以适当减少培养基中相应原料的添加或甚至直接代替常规培养基配料，降低了培养基的成本，同时仍能够保证PHA发酵的正常进行，且能够提高发酵效率。

[0006] 为了实现上述目的，本发明提供一种发酵制备PHA的方法，在能够发酵产PHA的条件下，将PHA发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵；

[0007] 其中，所述发酵培养基含有高盐糖蜜，以高盐糖蜜的干重为基准，盐含量为8-11重量百分比，糖含量为40-70重量百分比。

[0008] 优选的，所述发酵培养基含有高盐糖蜜、酵母粉、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁和氯化钠；相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜的含量为15-35ml、酵母粉的含量为15-17g、磷酸氢二钾的含量为2-5g、磷酸氢二钠的含量为5-8g、硫酸镁的含量为0.2-0.3g、氯化钠的含量为45-55g。

[0009] 优选的，所述发酵在搅拌的条件下进行，从发酵0h到发酵8-12h，所述搅拌的转速为400-600rpm；

[0010] 从发酵8-12h到发酵16-20h，所述搅拌的转速为600-1000rpm；

[0011] 从发酵16-20h到发酵结束，所述搅拌的转速为400-600rpm。

[0012] 优选的，（1）当发酵培养基中的糖含量第一次下降至12g/L以下，优选下降至10g/L以下，更优选下降至5-8g/L以下时，补充第一营养物质，所述第一营养物质的碳氮比为10-20：1，第一营养物质的补充量为发酵培养基的8-12体积百分比；

[0013] （2）当第一营养物质补充结束时，补充第二营养物质，所述第二营养物质的碳氮比为30-50：1，第二营养物质的补充量为发酵培养基的5-10体积百分比；

[0014] （3）当第二营养物质补充结束时，补充第三营养物质，所述第三营养物质为高盐糖蜜，第三营养物质的补充量为发酵培养基的20-30体积百分比。

[0015] 通过上述技术方案，本发明能够获得如下有益技术效果：

[0016] 1）本发明的方法能够充分利用高盐糖蜜中高糖分和高盐浓度的优势，为PHA发酵菌种的发酵提供足够的碳源供给和环境要求，为该种工业废物的利用带来了新的途径；

[0017] 2）高盐糖蜜含盐量高，在配制培养基时可降低盐的添加，从而降低生产成本；

[0018] 3）高盐糖蜜价格低廉，约在800元/吨，比常用的葡萄糖更为经济实惠，在碳源成本上可降低约700元/吨；

[0019] 4）高盐糖蜜含盐量高，较高的盐含量可以抑制非耐盐杂菌的生长，起到了有效的抑菌作用，减少了发酵罐灭菌所带来的额外操作和经济成本；

[0020] 5）高盐糖蜜富含多种微量元素，以及微生物生长所必需的N、P化合物，维生素等，能够有效促进菌体生长，在使用过程中可以适当减少培养基中相应原料的添加或甚至直接代替常规培养基配料，降低了培养基的成本，提高了发酵效率；

[0021] 6）所述高盐糖蜜还可以应用于发酵补料当中，作为补料碳源进行PHA生产。

具体实施方式

[0022] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0023] 本发明提供了一种发酵制备PHA的方法，在能够发酵产PHA的条件下，将PHA发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵；

[0024] 其中，所述发酵培养基含有高盐糖蜜，以高盐糖蜜的干重为基准，盐含量为8-11重量百分比，糖含量为40-70重量百分比。

[0025] 本发明需要说明的是，所述“高盐糖蜜”中的“盐”是指氯化钠。

[0026] 根据本发明，所述高盐糖蜜可以为任意的在盐含量和糖含量上符合如上要求的糖蜜，例如，可以为高盐甘蔗糖蜜和/或高盐甜菜糖蜜。

[0027] 根据本发明一种优选的实施方式，所述高盐糖蜜为高盐甘蔗糖蜜，以干重为基准，其盐含量在9重量百分比以上，例如，9-11重量百分比，糖含量在50重量百分比以上，例如，50-70重量百分比，所述糖包括葡萄糖、蔗糖和果糖，其中，以总糖计，葡萄糖的含量为5-15重量百分比，蔗糖的含量为75-85重量百分比，果糖的含量为5-12重量百分比。

[0028] 根据本发明，所述高盐糖蜜可以为粗制高盐糖蜜，也可以为精制高盐糖蜜，还可以为由精制高盐糖蜜进行脱色和稀释后得到的糖浆。

[0029] 根据本发明，所述高盐糖蜜在发酵培养基中的含量可以在较宽的范围内选择，其可以完全或部分替代发酵培养基中的碳源（葡萄糖）。根据本发明一种优选的实施方式，其完全替代发酵培养基中的碳源（葡萄糖），相对于1L发酵培养基，所述高盐糖蜜的含量为10-60mL，例如，可以为10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL，更优选为15-35mL。

[0030] 根据本发明，所述发酵培养基中还可以含有PHA发酵过程中其他的组分，例如，氮源、磷酸盐、镁盐和钠盐。

[0031] 根据本发明，所述氮源的种类没有特别的限制，只要能够为PHA发酵菌种提供所需的氮源即可，可以为有机氮源，例如，酵母粉、玉米浆粉、豆粕粉、氨基酸等，也可以为无机氮源，例如，尿素、硫酸铵、碳酸铵等。根据本发明一种优选的实施方式，所述氮源为有机氮源，更优选为酵母粉。

[0032] 其中，所述氮源的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述氮源的含量为13-18g，例如，13 g、14 g、15 g、16 g、17 g、18 g，优选为15-17g。

[0033] 根据本发明，所述磷酸盐可以为PHA发酵过程中常规使用的磷酸盐，例如，磷酸的钠盐、磷酸的钾盐，优选的，所述磷酸盐为磷酸氢二钾和磷酸氢二钠。

[0034] 其中，所述磷酸盐的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述磷酸盐的含量为5-20g，例如，可以为5 g、7 g、9 g、11 g、13 g、15 g、17 g、19 g、20 g；优选为7-13g。

[0035] 根据本发明一种优选的实施方式，所述磷酸盐为磷酸氢二钾和磷酸氢二钠，相对于1L发酵培养基，磷酸氢二钾的含量为2-5g，优选2.5-4g、磷酸氢二钠的含量为5-8g，优选5.5-6.5g。

[0036] 根据本发明，所述镁盐可以为常规的各种可溶性镁盐，但不包括磷酸的镁盐，优选的，所述镁盐为硫酸镁和/或氯化镁。

[0037] 其中，所述镁盐的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述镁盐的含量为0.1-0.5g，例如，可以为0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g，优选为0.2-0.3g。

[0038] 根据本发明，所述钠盐可以为常规的各种钠盐，但不包括磷酸的钠盐，优选的，钠盐为氯化钠。

[0039] 其中，所述钠盐的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述钠盐的含量为40-70g，例如，可以为40g、45g、50g、55g、60g、65g、70g，优选为45-55g。

[0040] 根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵培养基含有高盐糖蜜、酵母粉、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁和氯化钠；相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜的含量为15-35ml、酵母粉的含量为15-17g、磷酸氢二钾的含量为2-5g、磷酸氢二钠的含量为5-8g、硫酸镁的含量为0.2-0.3g、氯化钠的含量为45-55g。

[0041] 需要说明的是，如上各物质的含量指的是在培养基中各物质的含量，而并非是指各物质的总投料量。

[0042] 根据本发明，PHA发酵的温度可以为其常规的发酵温度，优选的，温度为30-45℃，例如，可以为30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃。更优选的，温度为35-39℃。

[0043] 根据本发明，PHA发酵的pH可以为其常规的发酵pH，优选的，pH值为7-9，例如，可以为7、7.5、8、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、9。更优选的，pH值为8.3-8.7。其中，所述pH值可以使用常规的碱进行调节，例如，8-12mol/L的氢氧化钠溶液。

[0044] 根据本发明，PHA发酵的溶氧量可以为其常规的发酵溶氧量，优选的，溶氧量为1-40%，例如，可以为1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%。更优选的，溶氧量为1-
30%。

[0045] 根据本发明，所述PHA的发酵条件还优选包括对通风量进行控制，优选的，通风量为0.5-1.5vvm，例如，可以为0.5vvm、0.6vvm、0.7vvm、0.8vvm、0.9vvm、1vvm、1.1vvm、1.2vvm、1.3vvm、1.4vvm、1.5vvm，优选为1-1.2vvm。

[0046] 根据本发明，所述PHA的发酵条件还优选包括搅拌，其中，所述搅拌的转速可以在较宽的范围内选择，优选的，以2-7L发酵罐计，所述搅拌的转速为400-1000rpm，例如，可以为400rpm、450rpm、500rpm、550rpm、600rpm、650rpm、700rpm、750rpm、800rpm、850rpm、900rpm、950rpm、1000rpm。

[0047] 本发明的发明人在研究的过程中发现，通过在不同的发酵阶段控制不同的搅拌转速，能够进一步提高最终的发酵效果。优选的，所述发酵在搅拌的条件下进行，从发酵0h到发酵8-12h（例如，可以为0-8h、0-9h时、0-10h、0-11h、0-12h），优选到发酵9-11h，所述搅拌的转速为400-600rpm；

[0048] 从发酵8-12h（优选9-11h）到发酵16-20h（例如，可以为8-16h、9-17h、10-18h、11-19h、12-20h、9-20h、10-20h等等，优选17-19h，具体起始时间依据上一阶段终止时间而定），所述搅拌的转速为600-1000rpm；

[0049] 从发酵16-20h（优选17-19h）到发酵结束（例如，16h至发酵结束、17h至发酵结束、18h至发酵结束、19h至发酵结束、20h至发酵结束，具体起始时间依据上一阶段终止时间而定），所述搅拌的转速为400-600rpm。

[0050] 根据本发明，所述PHA的发酵可以在不补料情况下进行，也可以在补料的情况下进行。根据本发明一种优选的实施方式，所述PHA的发酵为补料发酵，也即，在发酵的过程中补加营养物质。

[0051] 其中，所述营养物质的添加时机可以根据PHA发酵菌种对糖的需求情况而定，优选的，当发酵培养基中的糖含量下降至12g/L以下，优选下降至10g/L以下，更优选下降至5-8g/L（例如，5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L）以下时，开始补加所述营养物质。

[0052] 其中，所述营养物质的补加量优选使得发酵培养基中的糖含量控制在5-20g/L，例如，5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L、11 g/L、12 g/L、13 g/L、14 g/L、15 g/L、16 g/L、17 g/L、18 g/L、19 g/L、20 g/L。

[0053] 其中，所述糖含量是指利用SBA-90生物传感分析仪测定的发酵离心上清液中的糖含量。

[0054] 其中，优选的，在发酵的过程中实时监测发酵体系中的糖含量。

[0055] 其中，当所述发酵液的OD600的增速小于5/h时即可结束发酵，根据发明人的发酵经验，当发酵36-48小时，优选39-42小时，OD600的增速可以降低至如上的水平。

[0056] 其中，OD600指的是发酵液在分光光度计中在600nm波长处的吸光值。

[0057] 其中，优选的，在发酵的过程中实时监测发酵体系中的OD600。

[0058] 根据本发明，所述营养物质可以为常规的发酵过程中的补料，只要能够满足如上的要求即可，例如，所述营养物质可以含有葡萄糖。但根据本发明一种优选的实施方式，所述营养物质含有高盐糖蜜。

[0059] 本发明的发明人进一步发现，在发酵的不同阶段补加不同的营养物质，能够进一步提高发酵效果，优选的，所述营养物质的补加方法包括：

[0060] （1）当发酵培养基中的糖含量第一次下降至12g/L以下，优选下降至12g/L以下，更优选下降至5-8g/L以下时，补充第一营养物质，所述第一营养物质的碳氮比为10-20：1，优选为14-18:1，进一步优选15-17:1，第一营养物质的补充量为发酵培养基的8-12体积百分比，进一步优选为9-11体积百分比。

[0061] 优选的，所述第一营养物质含有高盐糖蜜和酵母粉。

[0062] 优选的，相对于1L的第一营养物质，高盐糖蜜的含量为550-830ml，酵母粉的含量为80-120g。

[0063] （2）当第一营养物质补充结束后，补充第二营养物质，所述第二营养物质的碳氮比为30-50：1，优选为34-42：1，进一步优选38-42:1；第二营养物质的补充量为发酵培养基的5-10体积百分比，优选为6-8体积百分比。

[0064] 优选的，所述第二营养物质含有高盐糖蜜和酵母粉。

[0065] 优选的，相对于1L的第二营养物质，高盐糖蜜的含量为830-980ml，酵母粉的含量为40-80g。

[0066] 其中，所述第二营养物质可以在第一营养物质补充结束马上补充，也可以间隔一定的时间，但间隔的时间要使得发酵培养基中的糖含量在5-20g/L，优选8-15 g/L。

[0067] （3）当第二营养物质补充结束后，补充第三营养物质，所述第三营养物质为高盐糖蜜，第三营养物质的补充量为发酵培养基的20-30体积百分比，优选为23-27体积百分比。

[0068] 其中，所述第三营养物质可以在第二营养物质补充结束马上补充，也可以间隔一定的时间，但间隔的时间要使得发酵培养基中的糖含量在5-20g/L，优选8-15 g/L。

[0069] 优选的，在第三营养物质补加结束后，继续发酵1-3小时时结束发酵。

[0070] 根据本发明，所述营养物质的补加可以采用间歇式的补加方式，也可以采用流加的方式，本领域技术人员可以根据实际情况而定。

[0071] 根据本发明，所述发酵制备PHA的方式可以为连续式发酵，也可以为间歇式发酵。

[0072] 根据本发明，所述PHA发酵菌种可以为常规的各种能够发酵产PHA的嗜盐发酵菌种，优选的，所述PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)；更优选的，所述PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)TD01，其保藏编号为CGMCC NO.4353（CN201010578858.8）。

[0073] 根据本发明，所述发酵菌种的接种量可以不受特别的限制，优选的，相对于1L发酵培养基，所述发酵菌种的接种量为9-15体积百分比；例如，可以为9体积百分比、10体积百分比、11体积百分比、12体积百分比、13体积百分比、14体积百分比、15体积百分比。

[0074] 根据本发明，接种至所述发酵培养基中的发酵菌种优选为活化后的发酵种子液，所述发酵种子液的OD600值优选为3-5。

[0075] 其中，所述活化的方式可以采用本领域常规的技术手段，例如，将低温保藏菌种接种至种子培养基中进行活化培养。所述种子培养基可以含有5-10g/L的酵母粉、10-15g/L的蛋白胨以及50-60g/L的氯化钠，高温高压灭菌即得。

[0076] 其中，所述活化培养的条件优选包括：温度为30-40℃，转速为150-250rpm，培养至OD600达到3-5。

[0077] 其中，所述活化培养优选为多级活化培养，例如，2-3级，从而得到充分活化后的种子液。

[0078] 根据本发明，所述方法还包括对从发酵得到的发酵液中进行PHA的提取。所述PHA提取的方法可以为本领域常规的方法。例如，参照文献：Chung A  , Liu Q , Ouyang S P , et al. Microbial production of 3-hydroxydodecanoic acid by phaoperon and fadBA knockout mutant of Pseudomonas putida KT2442 harboring tesB gene[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2009, 83(3):513-519.。

[0079] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，

[0080] PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)TD01，其保藏编号为CGMCC NO.4353，来自CN201010578858.8；

[0081] 高盐甘蔗糖蜜1为甘蔗精炼制糖工艺所产生的废料，呈浓稠液体状，含盐量约10重量百分比，以干固计，糖含量约51重量百分比，含有葡萄糖、蔗糖和果糖，以总糖计，葡萄糖含量11重量百分比，蔗糖含量81重量百分比，果糖含量8重量百分比；

[0082] 高盐甘蔗糖蜜2为甘蔗精炼制糖工艺所产生的废料，呈浓稠液体状，含盐量约9重量百分比，以干固计，糖含量约60重量百分比，含有葡萄糖、蔗糖和果糖，以总糖计，葡萄糖含量15重量百分比，蔗糖含量75重量百分比，果糖含量10重量百分比；

[0083] 高盐甘蔗糖蜜3为甘蔗精炼制糖工艺所产生的废料，呈浓稠液体状，含盐量约11重量百分比，以干固计，糖含量约70重量百分比，含有葡萄糖、蔗糖和果糖，以总糖计，葡萄糖含量10重量百分比，蔗糖含量85重量百分比，果糖含量5重量百分比；

[0084] 高盐甜菜糖蜜4为甘蔗精炼制糖工艺所产生的废料，呈浓稠液体状，含盐量约8重量百分比，以干固计，糖含量约40重量百分比，含有葡萄糖、蔗糖和果糖，以总糖计，葡萄糖含量5重量百分比，蔗糖含量83重量百分比，果糖含量12重量百分比；

[0085] 糖含量根据SBA-90生物传感分析仪方法测定；

[0086] 发酵液中盐单胞菌生物量的测定方法为取25-45 ml发酵液离心（8000rpm，10min）留沉淀，无菌水洗涤2次，使用真空冷冻干燥机对洗涤后的沉淀进行干燥48h后称重；

[0087] 参照文献：Chung A  , Liu Q  , Ouyang S P  , et al. Microbial production of 3-hydroxydodecanoic acid by phaoperon and fadBA knockout mutant of Pseudomonas putida KT2442 harboring tesB gene[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2009, 83(3):513-519. 从发酵液中进行PHA的提取；

[0088] 发酵罐体积5L。

[0089] 制备例

[0090] 本制备例用于说明发酵菌种的活化

[0091] 种子培养基：含有8g/L的酵母粉、12g/L的蛋白胨以及55g/L的氯化钠。

[0092] 将盐单胞菌接种于种子培养基中在37℃和200rpm的条件下进行一级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到一级种子液；

[0093] 将所述一级种子液以10体积百分比的接种量接种于种子培养基中，在37℃和200rpm的条件下进行二级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到二级种子液，得到发酵种子液。

[0094] 实施例1

[0095] 本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法

[0096] 发酵培养基：相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜1的含量为25mL、酵母粉的含量为17g、磷酸氢二钾的含量为3.5g、磷酸氢二钠的含量为6.2g、硫酸镁的含量为0.25g、氯化钠的含量为55g。调节pH至8.5。

[0097] 补料一：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为16:1。其中，相对于1L的第一营养物质，高盐糖蜜1 640 mL，酵母粉108g；补料一与发酵培养基的用量体积比为9：100。

[0098] 补料二：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为40:1。其中，相对于1L的第二营养物质，糖蜜900mL，酵母粉69.4g；补料二与发酵培养基的用量体积比为6：100。

[0099] 补料三：以纯高盐糖蜜1为碳源，补料三与发酵培养基的用量体积比为23:100。

[0100] 将制备例制得的种子液以10体积百分比的接种量接种于发酵培养基中，在37℃以及1vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8.5左右，溶氧量控制在10-30百分比。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-10h，所述搅拌的转速为
400rpm；发酵10-18h，所述搅拌的转速为800rpm；发酵18h至发酵结束，所述搅拌的转速为
400rpm。

[0101] 在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。

[0102] 当发酵体系中的糖含量第一次下降至6g/L以下时，流加补料一，当补料一结束时，流加补料二，当补料二结束时，流加补料三。

[0103] 补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在10g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。

[0104] 发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。

[0105] 实施例2

[0106] 本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法

[0107] 发酵培养基：相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜1的含量为35ml、酵母粉的含量为15g、磷酸氢二钾的含量为2.5g、磷酸氢二钠的含量为6.5g、硫酸镁的含量为0.3、氯化钠的含量为45g。调节pH至8.3。

[0108] 补料一：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为15:1。其中，相对于1L的第一营养物质，高盐糖蜜1 783 mL，酵母粉120 g；补料一与发酵培养基的用量体积比为10：100。

[0109] 补料二：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为38:1。其中，相对于1L的第二营养物质，糖蜜830 mL，酵母粉80 g；补料二与发酵培养基的用量体积比为7：100。

[0110] 补料三：以纯高盐糖蜜1为碳源，补料三与发酵培养基的用量体积比为25:100。

[0111] 将制备例制得到的种子液以12体积百分比的接种量接种于发酵培养基中，在35℃以及1.1vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8.3左右，溶氧量控制在10-30百分比。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-9h，所述搅拌的转速为
500rpm；发酵9-17h，所述搅拌的转速为900rpm；发酵17h至发酵结束，所述搅拌的转速为
500rpm。

[0112] 在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。

[0113] 当发酵体系中的糖含量第一次下降至5g/L以下时，流加补料一，当补料一结束时，流加补料二，当补料二结束时，流加补料三。

[0114] 补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在8g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。

[0115] 发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。

[0116] 实施例3

[0117] 本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法

[0118] 发酵培养基：相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜1的含量为15ml、酵母粉的含量为16g、磷酸氢二钾的含量为4g、磷酸氢二钠的含量为5.5g、硫酸镁的含量为0.2g、氯化钠的含量为50g。调节pH至8.7。

[0119] 补料一：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为17:1。其中，相对于1L的第一营养物质，高盐糖蜜1 560 mL，酵母粉91g；补料一与发酵培养基的用量体积比为11：100。

[0120] 补料二：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为42:1。其中，相对于1L的第二营养物质，糖蜜875 mL，酵母粉58g；补料二与发酵培养基的用量体积比为8：100。

[0121] 补料三：以纯高盐糖蜜1为碳源，补料三与发酵培养基的用量体积比为27:100。

[0122] 将制备例制得到的种子液以15体积百分比的接种量接种于发酵培养基中，在39℃以及1.2vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8.7左右，溶氧量控制在10-30百分比。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-11h，所述搅拌的转速为
600rpm；发酵11-19h，所述搅拌的转速为1000rpm；发酵19h至发酵结束，所述搅拌的转速为
600rpm。

[0123] 在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。

[0124] 当发酵体系中的糖含量第一次下降至8g/L以下时，流加补料一，当补料一结束时，流加补料二，当补料二结束时，流加补料三。

[0125] 补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在15g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。

[0126] 发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。

[0127] 实施例4

[0128] 本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法

[0129] 发酵培养基：相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜1的含量为40ml、酵母粉的含量为10g、磷酸氢二钾的含量为2.0g、磷酸氢二钠的含量为5.0g、硫酸镁的含量为0.15g、氯化钠的含量为40g。调节pH至8.0。

[0130] 补料一：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为18:1。其中，相对于1L的第一营养物质，高盐糖蜜1 750 mL，酵母粉116 g；补料一与发酵培养基的用量体积比为8：100。

[0131] 补料二：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为34:1。其中，相对于1L的第二营养物质，糖蜜900 mL，酵母粉74 g；补料二与发酵培养基的用量体积比为5：100。

[0132] 补料三：以纯高盐糖蜜1为碳源，补料三与发酵培养基的用量体积比为20:100。

[0133] 将制备例制得到的种子液以10体积百分比的接种量接种于发酵培养基中，在30℃以及1.5vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8左右。此外，在发酵的过程中转速控制在800rpm左右。

[0134] 在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。

[0135] 当发酵体系中的糖含量第一次下降至10g/L以下时，流加补料一，当补料一结束时，流加补料二，当补料二结束时，流加补料三。

[0136] 补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在5g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。

[0137] 发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。

[0138] 实施例5

[0139] 本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法

[0140] 发酵培养基：相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜1的含量为15ml、酵母粉的含量为20g、磷酸氢二钾的含量为5g、磷酸氢二钠的含量为8g、硫酸镁的含量为0.5g、氯化钠的含量为70g。调节pH至9。

[0141] 补料：使用实施例1补料一。补料与发酵培养基的用量体积比为42:100。

[0142] 将制备例制得到的种子液以10体积百分比的接种量接种于发酵培养基中，在45℃以及0.5vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在9左右，溶氧量控制在10-30百分比。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-12h，所述搅拌的转速为
400rpm；发酵12-20h，所述搅拌的转速为800rpm；发酵20h至发酵结束，所述搅拌的转速为
400rpm。

[0143] 在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。

[0144] 当发酵体系中的糖含量第一次下降至12g/L以下时，仅流加补料一。

[0145] 补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在20g/L左右，补料流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。

[0146] 发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。

[0147] 实施例6

[0148] 本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法

[0149] 按照实施例1的方法进行PHA的制备，不同的是，将所述高盐糖蜜1替换为等量的高盐甘蔗糖蜜2。

[0150] 发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。

[0151] 实施例7

[0152] 本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法

[0153] 按照实施例1的方法进行PHA的制备，不同的是，将所述高盐糖蜜1替换为等量的高盐甘蔗糖蜜3。

[0154] 发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。

[0155] 实施例8

[0156] 本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法

[0157] 按照实施例1的方法进行PHA的制备，不同的是，将所述高盐糖蜜1替换为等量的高盐甜菜糖蜜4。

[0158] 发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。

[0159] 对比例1

[0160] 本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法

[0161] 按照实施例4的方法进行PHA的制备，不同的是，将所述高盐糖蜜1替换为等量的低盐糖蜜，并通过调节发酵培养基中氯化钠的含量使得与实施例4发酵培养基中氯化钠含量相同。

[0162] 发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。

[0163] 对比例2

[0164] 本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法

[0165] 按照实施例4的方法进行PHA的制备，不同的是，将所述高盐糖蜜1替换为等量的葡萄糖、蔗糖和果糖的混合物，并通过调节发酵培养基中氯化钠的含量使得与实施例4发酵培养基中氯化钠含量相同。

[0166] 发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。

[0167] 对比例3

[0168] 本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法

[0169] 按照实施例4的方法进行PHA的制备，不同的是，将所述高盐糖蜜1替换为等量的葡萄糖，并通过调节发酵培养基中氯化钠的含量使得与实施例4发酵培养基中氯化钠含量相同。

[0170] 发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。

[0171] 表1

[0172]

[0173] 通过表1的结果可以看出，将实施例4与对比例1-2相比，采用本发明技术方案能够有效降低PHA的生产成本，将实施例4与对比例3相比，采用本发明技术方案不仅能够有效降低PHA的生产成本，还能够提高发酵液中菌体生物量以及PHA的产量。将实施例1-3与实施例4-5相比可以看出，将发酵过程控制在本发明的优选方式下，能够进一步降低成本，提高发酵液中菌体生物量以及PHA的产量。将实施例1、6和7与实施例8相比可以看出，选择特定的高盐糖蜜，并且将高盐糖蜜的盐含量和糖含量控制在本发明的范围内，能够进一步提高发酵效果。

[0174] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。