一种分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法

摘要

本发明提供一种分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法，现利用微流控技术制备了单乳液液滴模板（O/W），内相为油相，外相为添加有造孔剂的水凝胶预聚溶液，将外相紫外光聚合，通过牺牲模板法获得反蛋白石多孔生物支架，最后将造孔剂析出进一步获得分级结构反蛋白石多孔生物支架。本发明所制备的分级结构反蛋白石多孔生物支架具有多尺度的孔洞结构，有利于细胞的黏附、迁移和分布，以及营养物质和代谢产物的交换，并促进细胞‑细胞和细胞‑胞外基质之间的联系；本方法简单易操作、一步化、实时可控，解决了传统三维多孔生物支架结构单一、孔洞单分散性差、缺乏连通性的问题，在组织工程和再生医学领域具有极大的应用价值。

权利要求

1.一种分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法，其特征在于，先利用微流控技术制备单乳液液滴模板，其中，内相为油相，外相为添加有造孔剂的水凝胶预聚溶液，并通过调节微流控内相和外相的流速，获得不同直径的液滴正模版，然后固化外相，去除液滴模板，初步获得一级结构反蛋白石多孔生物支架；随后将一级结构反蛋白石多孔生物支架浸泡到磷酸缓冲盐溶液中，析出外相中的造孔剂，最终获得分级结构反蛋白石多孔生物支架；

所述内相为50 cs的甲基硅油，外相为甲基丙烯酸酐化明胶、造孔剂、十二烷基硫酸钠和聚醚型表面活性剂F108的混合溶液。

2.根据权利要求1所述的分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、搭建微流控单乳液生成装置；

S2、微流控单乳液液滴模板的制备：

配制高分子水凝胶预聚溶液作为外相，外相溶液内包括造孔剂，外相与内相互不相容；

将外相溶液注入微流控单乳液生成装置的外相通道，将内相液体注入微流控单乳液生成装置的内相通道，并调节控制内相和外相的流速，利用两相之间的流体剪切力生成单分散的水包油液滴，液滴以六方密堆积的方式自组装形成有序的液滴模板；

S3、分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备：

将S2中制备的液滴模板的外相用紫外光固化，然后用正己烷去除液滴模板，初步获得一级结构反蛋白石多孔生物支架；将一级结构反蛋白石多孔生物支架浸入磷酸盐缓冲溶液中去除造孔剂，最终获得分级结构反蛋白石多孔生物支架。

3.根据权利要求1所述的分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法，其特征在于，所述造孔剂为质量百分比浓度0.5-1.5%的聚氧化乙烯溶液。

4.根据权利要求2所述的分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法，其特征在于， S2中，可通过调节内相和外相的流速而调整液滴模板的尺寸大小；液滴的直径随着内相流速的增大而增大，随着外相流速的增大而减小，从而获得不同孔径的反蛋白石多孔生物支架。

5.根据权利要求2所述的分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法，其特征在于，S2中，可通过调节造孔剂的浓度获得不同大小孔径的分级孔洞结构，造孔剂的浓度越高，分级孔洞结构的孔径越小，孔隙率越高。

6.根据权利要求2所述的分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法，其特征在于，S3中，所述的一级结构反蛋白石多孔生物支架的孔洞直径在190 μm-280 μm范围内。

7.根据权利要求2所述的分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法，其特征在于，S3中，所述的分级结构反蛋白石多孔生物支架的孔洞直径在6 μm-8 μm范围内。

8.根据权利要求2所述的分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法，其特征在于，S1中，所述微流控单乳液生成装置的搭建方法为：S1、制备内相管、外相管和观察管：

使用微电极控制仪将一根外径为1000 μm，内径为580 μm的玻璃毛细管拉细，然后用砂纸手工将其打磨成内径为120 μm的尖头毛细管，作为微流控单乳液生成装置的内相管；另外再取一根外径为1000 μm，内径为580 μm的玻璃毛细管，用砂纸将毛细管两端打磨平滑，作为微流控单乳液生成装置的外相管；第三根玻璃毛细管为内径为1200 μm的方形管，砂纸打磨平滑后作为液滴生成的观察管；将内相管、外相管和观察管浸泡在乙醇溶液中，超声清洗5-10 min，然后取出，用氮气吹干或常温晾干后即可使用；

S2、微流控单乳液生成装置的搭建：

根据内相管与外相管的长度，将载玻片切割至匹配尺寸，然后用速干胶将方形管固定在载玻片的中间区域，待胶凝固之后将内相管和外相管嵌套入观察管内，内相管的尖头插入外相管中，并对齐两者的中线，之后用速干胶固定，最后将平头针头底部刻出凹槽，使其能平稳的立在内相管与外相管连接处上方，并用速干胶固定与密封。

说明书

一种分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法。

背景技术

[0002] 传统的二维细胞培养很难准确地反映出细胞在体内的真实生长环境，进而可能造成细胞结构和组织功能的缺失。相比之下，三维细胞培养能够通过细胞-细胞和细胞-基质间的相互作用更好的模拟胞内复杂的微环境，为细胞提供一个更加接近体内的三维生存条件。同时，三维细胞培养具有类组织结构，并且可以长时间保持高水平的组织特异性功能。因此，三维细胞培养已经引起科研人员的广泛关注。

[0003] 为了实现三维细胞培养，诸多的生物支架材料被研发，这些支架能够为细胞的生长和增殖提供一种物理支撑，保持细胞的三维结构，促使其在更接近体内环境的状态下行使功能。目前支架的制备方法主要包括冷冻干燥法、成孔剂析出法和气体发泡技术等，然而，由于对支架孔洞的单分散性及连通性缺乏精准的控制，这些支架大多数只能为细胞附着提供有限的外表面。另外，大多数的支架只能为细胞的生长提供单一尺度的多孔结构，不利于营养物质的运输。因此，具有多尺度分级结构的多孔生物支架具有极大的前景。

[0004] 基于此，在本发明中，我们基于微流控技术和造孔剂析出法，设计发明了一种分级结构反蛋白石多孔生物支架，可用于三维细胞培养，并进一步应用于组织工程和再生医学领域。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法，在高度有序连通的一级多孔结构基础上，还能提供高孔隙率的二级多孔结构，从而赋予所述的分级结构反蛋白石多孔生物支架多尺度的分级结构。

[0006] 本发明采用以下技术方案：

[0007] 一种分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法，先利用微流控技术制备单乳液液滴模板，其中，内相为油相，外相为添加有造孔剂的水凝胶预聚溶液，并通过调节微流控内相和外相的流速，获得不同直径的液滴正模版，然后固化外相，去除液滴模板，初步获得一级结构反蛋白石多孔生物支架；随后将一级结构反蛋白石多孔生物支架浸泡到磷酸缓冲盐溶液中，析出外相中的造孔剂，最终获得分级结构反蛋白石多孔生物支架。

[0008] 进一步的，本发明具体包括以下步骤：

[0009] S1、搭建微流控单乳液生成装置；

[0010] S2、微流控单乳液液滴模板的制备：

[0011] 配制高分子水凝胶预聚溶液作为外相，外相溶液内包括造孔剂，外相与内相互不相容；将外相溶液注入微流控单乳液生成装置的外相通道，将内相液体注入微流控单乳液生成装置的内相通道，并调节控制内相和外相的流速，利用两相之间的流体剪切力生成单分散的水包油（O/W）液滴，液滴以六方密堆积的方式自组装形成有序的液滴模板；

[0012] S3、分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备：

[0013] 将S2中制备的液滴模板的外相用紫外光固化，然后用正己烷去除液滴模板，初步获得一级结构反蛋白石多孔生物支架；将一级结构反蛋白石多孔生物支架浸入磷酸盐缓冲溶液中去除造孔剂，最终获得分级结构反蛋白石多孔生物支架。

[0014] 进一步的，S2中，所述内相为50 cs的甲基硅油，外相为甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）、造孔剂、十二烷基硫酸钠（SDS）和聚醚型表面活性剂F108的混合溶液。

[0015] 进一步的，所述造孔剂为质量百分比浓度0.5-1.5%的聚氧化乙烯溶液。

[0016] 进一步的，S2中，可通过调节内相和外相的流速而调整液滴模板的尺寸大小；液滴的直径随着内相流速的增大而增大，随着外相流速的增大而减小，从而获得不同孔径的反蛋白石多孔生物支架。

[0017] 进一步的，S2中，可通过调节造孔剂的浓度获得不同大小孔径的分级孔洞结构，造孔剂的浓度越高，分级孔洞结构的孔径越小，孔隙率越高。

[0018] 进一步的，S3中，所述的一级结构反蛋白石多孔生物支架的孔洞直径在190 μm-280 μm范围内。

[0019] 进一步的，S3中，所述的分级结构反蛋白石多孔生物支架的孔洞直径在6 μm-8 μm范围内。

[0020] 进一步的，S1中，所述微流控单乳液生成装置的搭建方法为：

[0021] S1、制备内相管、外相管和观察管：

[0022] 使用微电极控制仪将一根外径为1000 μm，内径为580 μm的玻璃毛细管拉细，然后用砂纸手工将其打磨成内径为120 μm的尖头毛细管，作为微流控单乳液生成装置的内相管；另外再取一根外径为1000 μm，内径为580 μm的玻璃毛细管，用砂纸将毛细管两端打磨平滑，作为微流控单乳液生成装置的外相管；第三根玻璃毛细管为内径为1200 μm的方形管，砂纸打磨平滑后作为液滴生成的观察管；将内相管、外相管和观察管浸泡在乙醇溶液中，超声清洗5-10 min，然后取出，用氮气吹干或常温晾干后即可使用；

[0023] S2、微流控单乳液生成装置的搭建：

[0024] 根据内相管与外相管的长度，将载玻片切割至匹配尺寸，然后用速干胶将方形管固定在载玻片的中间区域，待胶凝固之后将内相管和外相管嵌套入方形管内，内相管的尖头插入外相管中，并对齐两者的中线，之后用速干胶固定，最后将平头针头底部刻出凹槽，使其能平稳的立在内相管与外相管连接处上方，并用速干胶固定与密封。

[0025] 本发明的有益效果：

[0026] （1）本发明基于微流控技术制备单乳液液滴模板，操作简单，尺寸可控，单分散性好，成本低廉，可稳定的量产；

[0027] （2）本发明基于微流控技术制备分级结构反蛋白石多孔生物支架，可通过调节内相和外相的流速而调整液滴模板的尺寸大小，通过调节造孔剂的浓度获得不同孔径及孔隙率的分级孔洞结构，在高度有序连通的一级多孔结构基础上，还能提供高孔隙率的二级多孔结构，从而赋予反蛋白石多孔生物支架多尺度的分级结构，解决了传统三维多孔生物支架结构单一、孔洞单分散性差、缺乏连通性的问题；并且该制备方法简单易操作、一步化、实时可控；

[0028] （3）本发明制备的分级结构反蛋白石多孔生物支架的多尺度分级结构，能够大大缩短细胞之间的距离，除了有利于细胞培养过程中氧气和营养物质的运输，还能够促进细胞之间的信号传导，该分级结构反蛋白石多孔生物支架具有良好的生物相容性，有望作为理想的支架材料应用于组织工程和再生医学领域，具有极大的应用价值。

[0029] 附图说明：

[0030] 图1为本发明实施例分级结构反蛋白石多孔生物支架制备的示意图；其中，图a为微流控单乳液装置示意图，图b为液滴模板排列示意图；

[0031] 图2为本发明实施例单乳液液滴模板光镜图；其中，图a为液滴模板，图b为液滴尺寸与流速的关系；

[0032] 图3为本发明实施例分级结构反蛋白石多孔生物支架的电镜图；其中，图a为分级结构反蛋白石多孔生物支架的整体图，图b为分级结构反蛋白石多孔生物支架的局部放大图；

[0033] 图4为本发明实施例分级结构反蛋白石多孔生物支架应用于三维细胞培养；图a-c为人血管内皮细胞（HUVECs）在分级结构反蛋白石多孔生物支架内培养1、3、5天的显微图像。

[0034] 具体实施方式：

[0035] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0036] 一种分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备方法，先利用微流控技术制备单乳液液滴模板，其中，内相为油相，外相为添加有造孔剂的水凝胶预聚溶液，并通过调节微流控内相和外相的流速，获得不同直径的液滴正模版，然后固化外相，去除液滴模板，初步获得一级结构反蛋白石多孔生物支架；随后将一级结构反蛋白石多孔生物支架浸泡到磷酸缓冲盐溶液中，析出外相中的造孔剂，最终获得分级结构反蛋白石多孔生物支架。

[0037] 具体包括以下步骤：

[0038] S1、搭建微流控单乳液生成装置；

[0039] （1）制备内相管、外相管和观察管：使用微电极控制仪将一根外径为1000 μm，内径为580 μm的玻璃毛细管拉细，然后用砂纸手工将其打磨成内径为120 μm的尖头毛细管，作为微流控单乳液生成装置的内相管；另外再取一根外径为1000 μm，内径为580 μm的玻璃毛细管，用砂纸将毛细管两端打磨平滑，作为微流控单乳液生成装置的外相管；第三根玻璃毛细管为内径为1200 μm的方形管，砂纸打磨平滑后作为液滴生成的观察管；将内相管、外相管和观察管浸泡在乙醇溶液中，超声清洗5-10 min，然后取出，用氮气吹干或常温晾干后即可使用；

[0040] （2）微流控单乳液生成装置的搭建：根据内相管与外相管的长度，将载玻片切割至匹配尺寸，然后用速干胶将方形管固定在载玻片的中间区域，待胶凝固之后将内相管和外相管嵌套入观察管内，内相管的尖头插入外相管中，并对齐两者的中线，之后用速干胶固定，最后将平头针头底部刻出凹槽，使其能平稳的立在内相管与外相管连接处上方，并用速干胶固定与密封。

[0041] S2、微流控单乳液液滴模板的制备：

[0042] 配制高分子水凝胶预聚溶液作为外相，外相溶液内包括造孔剂，外相与内相互不相容；将外相溶液注入微流控单乳液生成装置的外相通道，将内相液体注入微流控单乳液生成装置的内相通道，并调节控制内相和外相的流速，利用两相之间的流体剪切力生成单分散的水包油（O/W）液滴，液滴以六方密堆积的方式自组装形成有序的液滴模板；所述内相为50 cs的甲基硅油，外相为甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA，10-20%，m/v）、造孔剂、十二烷基硫酸钠（SDS，1-2%，m/v）和聚醚型表面活性剂F108（1-2%，m/v）的混合溶液；所述造孔剂为质量百分比浓度0.5-1.5%的聚氧化乙烯溶液；具体的，可通过调节内相和外相的流速而调整液滴模板的尺寸大小；液滴的直径随着内相流速的增大而增大，随着外相流速的增大而减小，从而获得不同孔径的反蛋白石多孔生物支架；可通过调节造孔剂的浓度获得不同大小孔径的分级孔洞结构，造孔剂的浓度越高，分级孔洞结构的孔径越小，孔隙率越高。

[0043] S3、分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备：

[0044] 将S2中制备的液滴模板的外相用紫外光固化，然后用正己烷去除液滴模板，初步获得一级结构反蛋白石多孔生物支架；将一级结构反蛋白石多孔生物支架浸入磷酸盐缓冲溶液中去除造孔剂，最终获得分级结构反蛋白石多孔生物支架；所述的一级结构反蛋白石多孔生物支架的孔洞直径在190 μm-280 μm范围内；所述的分级结构反蛋白石多孔生物支架的孔洞直径在6 μm-8 μm范围内。

[0045] 实施例1：分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备

[0046] （1）微流控单乳液装置的搭建

[0047] 使用微电极控制仪将一根外径为1000 μm，内径为580 μm的玻璃毛细管拉细，然后用砂纸手工将其打磨成内径为120 μm的尖头毛细管，作为微流控装置的内相管；另外再取一根外径为1000 μm，内径为580 μm的玻璃毛细管，用砂纸将毛细管两端打磨平滑，作为外相管；第三根玻璃毛细管为内径为1200 μm的方形管，作为液滴生成的观察管；将砂纸打磨后的内相管、外相管和观察管浸泡在乙醇溶液中，超声清洗5-10 min，然后取出，用氮气吹干或常温晾干后即可使用；

[0048] 根据内相管与外相管的长度，将载玻片切割至匹配尺寸，然后用速干胶将观察管固定在载玻片的中间区域，待胶凝固之后将内相管和外相管嵌套入观察管内，内相管的尖头插入外相管中，并对齐两者的中线，之后用速干胶固定；最后将平头针头底部刻出凹槽，使其能平稳的立在内相管与外相管连接处上方，并用速干胶固定与密封。

[0049] （2）单乳液液滴模板的制备

[0050] 配制20%甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）、1%聚氧化乙烯（PEO）、2%十二烷基硫酸钠（SDS）、2%聚醚型表面活性剂F108和1%光引发剂（2-羟基-2-甲基苯丙酮）的混合溶液作为外相；用5 mL注射器吸取50 cs的甲基硅油作为内相，并将注射器固定在蠕动泵上，通过PE管与微流控装置内相管的入口端连接；另外，用10 mL注射器吸取外相溶液，同样固定在蠕动泵上，通过PE管与微流控装置外相管的入口端连接；设计系列蠕动泵参数，通过调整内外相流速比，获得直径不同的硅油液滴。

[0051] （3）分级结构反蛋白石多孔生物支架的制备

[0052] 待步骤（2）中制备的液滴有序排列后，用紫外光照30 s将外相溶液固化，之后用正己烷清洗内相的硅油至少3次，获得反蛋白石多孔生物支架，然后将该支架浸入PBS溶液中至少24 h，将造孔剂—聚氧化乙烯（PEO）析出，最后用去离子水清洗支架3次，获得分级结构反蛋白石多孔生物支架。

[0053] （4）分级结构反蛋白石多孔生物支架的表征

[0054] 利用体式显微镜和扫描电子显微镜观察分级结构反蛋白石多孔生物支架的结构，测得分级结构反蛋白石多孔生物支架的一级孔洞结构直径为250 μm左右，二级孔洞结构的直径大概为6 μm。

[0055] 试验例1：分级结构反蛋白石多孔生物支架用于三维细胞培养

[0056] （1）细胞培养

[0057] 人血管内皮细胞HUVECs，培养在含DMEM高糖培养基，10％胎牛血清和1％双抗（青霉素和链霉素）的细胞培养基中，置于二氧化碳培养箱（37℃、5％CO2、饱和湿度）中，隔天换液，以5天为一个周期（细胞生长达到80-90％），之后用0.25%的胰酶消化传代。

[0058] （2）分级结构反蛋白石多孔生物支架生物相容性研究

[0059] 将分级结构反蛋白石多孔生物支架放入小号培养皿中，用75%的酒精清洗3次，然后在超净台中紫外灭菌4 h，之后用PBS清洗3次确保将酒精清洗干净，将分级结构反蛋白石多孔生物支架转移入另外一个小号培养皿中，用无血清的DMEM培养基浸泡清洗2-3遍，备用；将分级结构反蛋白石多孔生物支架转移至6孔板内，然后加入2 mL的人血管内皮细胞（HUVECs）（1*105 cells/mL）悬液；对照组为在相同条件下6孔板内培养细胞，每组至少3 个重复，然后在24 h、48 h、72 h 和 96 h后向每个孔中加入500 μL，3 mg/mL的噻唑蓝溶液（MTT），于培养箱中继续培养4 h，吸出孔内的液体，加入800 μL二甲基亚砜(DMSO)溶解结晶，使用酶标仪在490 nm处测定吸光值，计算细胞的增殖率，进而体外评估支架的生物相容性。

[0060] 评估结果表明，与传统的反蛋白石多孔生物支架相比，细胞在分级结构反蛋白石多孔生物支架内的存活率更高，尤其是在培养一周之后，这种差异更加显著，这说明该分级结构反蛋白石多孔生物支架能够促进细胞的增殖，并有利于细胞的长时间培养。

[0061] （3）分级结构反蛋白石多孔生物支架用于三维细胞培养

[0062] 将分级结构反蛋白石多孔生物支架放入小号培养皿中，用75%的酒精清洗3次，然后在超净台中紫外灭菌4 h，之后用PBS清洗3次确保将酒精清洗干净；将分级结构反蛋白石多孔生物支架转移入另外一个小号培养皿中，用无血清的DMEM培养基浸泡清洗2-3遍，备用；将分级结构反蛋白石多孔生物支架转移至6孔板内，加入2 mL的人血管内皮细胞（HUVECs）(1*106 cells/mL)悬液，然后在第1、5、7天后用Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒染色，在共聚焦显微镜下直接观察细胞的生长情况。

[0063] 结果表明，细胞在传统的反蛋白石多孔生物支架内主要以圆形的形态生长，而在分级结构反蛋白石多孔生物支架内细胞大多呈现梭形的形态生长，这说明该分级结构反蛋白石多孔生物支架更有利于细胞的黏附，使细胞能够以正常的形态生长，这种伸展的细胞能够促进细胞与细胞之间的信号传导。

[0064] 试验例2：分级结构反蛋白石多孔生物支架用于三维细胞共培养

[0065] （1）分级结构反蛋白石多孔生物支架用于三维细胞共培养

[0066] 将分级结构反蛋白石多孔生物支架放入小号培养皿中，用75%的酒精清洗3次，然后在超净台中紫外灭菌4 h，之后用PBS清洗3次确保将酒精清洗干净，将分级结构反蛋白石多孔生物支架转移入另外一个小号培养皿中，用无血清的DMEM培养基浸泡清洗2-3遍，备用；为了更直观的观察细胞共培养体系，在共培养之前，将人血管内皮细胞（HUVECs）用Calcein-AM染色（绿色），人肝癌细胞（HepG2）用DID染色（红色）；将分级结构反蛋白石多孔生物支架转移至6孔板内，然后加入2 mL的人血管内皮细胞（HUVECs）（1*106 cells/mL）悬液，培养24 h后继续加入2 mL的人肝癌细胞（HepG2）（0.5*106 cells/mL）悬液，继续共培养1-7天，在培养的过程中可在共聚焦显微镜下直接观察细胞的生长情况。

[0067] 结果表明，在共培养7天后，传统反蛋白石多孔生物支架内的细胞多呈现圆形，并且支架内部的细胞出现大量的坏死，而分级结构反蛋白石多孔生物支架内的细胞则生长良好，细胞沿着支架的骨架贴壁生长并增殖，只出现了少量的细胞坏死情况。

[0068] （2）三维细胞共培养体系促进肝功能的表达

[0069] 步骤（1）中的三维共培养体系在共培养第1、3、5、7时，用2 mL离心管收集细胞培养液，1000 rpm离心5 min，弃沉淀；将上清液转移入新的2 mL离心管内备用；按照购买的白蛋白和细胞色素p450酶试剂盒提供的实验步骤，定量测定不同共培养时间下白蛋白和细胞色素p450酶的分泌量。

[0070] 本发明基于微流控技术制备分级结构反蛋白石多孔生物支架，可通过调节内相和外相的流速而调整液滴模板的尺寸大小，通过调节造孔剂的浓度获得不同孔径及孔隙率的分级孔洞结构，在高度有序连通的一级多孔结构基础上，还能提供高孔隙率的二级多孔结构，从而赋予反蛋白石多孔生物支架多尺度的分级结构，解决了传统三维多孔生物支架结构单一、孔洞单分散性差、缺乏连通性的问题；并且该制备方法简单易操作、一步化、实时可控；本发明分级结构反蛋白石多孔生物支架能够大大缩短细胞之间的距离，除了有利于细胞培养过程中氧气和营养物质的运输，还能够促进细胞之间的信号传导，该分级结构反蛋白石多孔生物支架具有良好的生物相容性，有望作为理想的支架材料应用于组织工程和再生医学领域，具有极大的应用价值。

[0071] 以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。