一种多肽-量子点复合探针、制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种多肽‑量子点复合探针，所述多肽‑量子点复合探针以谷胱甘肽为量子点表面修饰剂，以末端为Cys的带电荷的氨基酸短链为连接基团修饰多肽序列获得靶向多肽(Cys‑X)‑Targeting domain。本发明还提供了多肽‑量子点复合探针的制备方法：将Te溶液与Cd溶液混合加热至回流，缓慢滴加合成的靶向多肽(Cys‑X)‑Targeting domain溶液，回流15‑300min。本发明所述多肽‑量子点复合探针以谷胱甘肽为量子点表面修饰剂，能够与靶向多肽中的Cys兼容，制备的多肽‑量子点复合探针稳定性良好；谷胱甘肽为人体中自然合成的肽，生物相容性好、毒性低；并且该方法条件温和、绿色环保、工艺简单，不需进一步的量子点修饰即可一步合成，制备的多肽‑量子点复合探针可用于体内成像。

权利要求

1.一种多肽-量子点复合探针，其特征在于，所述多肽-量子点复合探针包括表面包覆谷胱甘肽的量子点CdTe和靶向多肽(Cys-X)-Targeting domain；所述Targeting domain为靶向多肽序列；所述Cys-X为连接基团，所述X为Glu，所述X与Targeting domain的N端和/或C端连接，所述Cys与量子点CdTe结合。

2.如权利要求1所述的多肽-量子点复合探针，其特征在于，所述Targeting domain包括蛋白质靶向肽、细胞靶向肽、金属离子靶向肽中的一种或几种。

3.如权利要求2所述的多肽-量子点复合探针，其特征在于，所述Targeting domain为蛋白质靶向肽。

4.如权利要求3所述的多肽-量子点复合探针，其特征在于，所述Targeting domain为病变胶原蛋白靶向肽或Ⅰ型胶原蛋白靶向肽。

5.如权利要求2所述的多肽-量子点复合探针，其特征在于，所述Targeting domain为细胞靶向肽。

6.如权利要求5所述的多肽-量子点复合探针，其特征在于，所述Targeting domain是通过靶向细胞器来靶向细胞。

7.如权利要求6所述的多肽-量子点复合探针，其特征在于，所述的细胞器为内质网或细胞核。

8.如权利要求5所述的多肽-量子点复合探针，其特征在于，所述Targeting domain是通过靶向细胞上的细胞受体来靶向细胞。

9.如权利要求8所述的多肽-量子点复合探针，其特征在于，所述细胞受体为整合素。

10.如权利要求1所述的多肽-量子点复合探针，其特征在于，所述谷胱甘肽为L-谷胱甘肽和/或D-谷胱甘肽。

11.如权利要求1-10任一所述多肽-量子点复合探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）将谷胱甘肽与氯化镉溶解于超纯水中，得Cd溶液，所得溶液由氢氧化钠调节pH到

10-13，脱氧搅拌待用；

（2）称取碲粉和硼氢化钠，脱氧后加入脱氧超纯水，于50-70℃反应得Te溶液；

（3）将Te溶液加入到Cd溶液中，100℃加热至回流，缓慢滴加1-2 mL的靶向多肽(Cys-X)-Targeting domain溶液，回流15-300 min，获得多肽-量子点复合探针溶液；

（4）将步骤（3）所述的多肽-量子点复合探针溶液冷却后，加入1-2倍体积的异丙醇沉淀探针，离心收集探针并由异丙醇洗涤后风干，即得多肽-量子点复合探针。

12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中靶向多肽(Cys-X)-Targeting domain的浓度为2.5-10 mg/ml。

13.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中Cd与Te的摩尔比为1:

0.6-0.3。

14.如权利要求1-10任一所述多肽-量子点复合探针在制备蛋白质成像试剂、细胞受体成像试剂或细胞器成像试剂中的应用。

说明书

一种多肽-量子点复合探针、制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于半导体量子点材料领域，具体涉及一种多肽-量子点复合探针、制备方法和应用。

背景技术

[0002] 半导体量子点，是一种由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的新型纳米材料，由于其具有特殊的光学性能，与传统的荧光染料相比，具有光稳定性好、荧光强度强、激发光谱范围宽、发射光谱半峰宽对称且狭窄、荧光寿命长、颜色多样可调、量子产率高等优点，在生物成像方面具有广阔的应用前景。

[0003] 多肽量子点是在量子点表面连接多肽分子形成的一种新型生物标记探针，是目前研究的热点。其中，CdTe量子点由于其强大的量子限制效应，它的荧光几乎可以覆盖整个可见光谱范围，已经被广泛应用于电子设备以及传感器等领域。然而，CdTe量子点在细胞实验中因释放出有毒Cd2+离子而引起细胞毒性，极大的限制了其在生物检测中的应用。同时，CdTe量子点体内成像中的应用，要求其具备良好的光学性能、较小的粒径和较低的毒性。因此，开发新型可溶于水、高荧光强度、小粒径、低毒性的CdTe量子点，对开拓它们的生物医学应用至关重要。

[0004] 目前含有Zn的脂溶性量子点CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或CdTe/ZnSe在生物标记中应用最为广泛。其在进行生物标记时，一般有两种方法：①先通过巯基小分子取代脂溶性量子点表面的配体，然后通过静电吸附或偶联剂与多肽等生物分子连接。但是，静电吸附受环境影响大、稳定性差；而偶联一般需要引入化学试剂，反应效率低、副反应多、毒性较大；②在生物分子上引入连接基团，量子点表面的Zn原子可以和连接基团形成金属亲和协调作用，能够将含有连接基团的蛋白质或多肽直接接到量子点CdSe/ZnS表面的Zn原子上。虽然这种方法制备的多肽量子点稳定性较好，但是，它依赖连接基团与量子点CdSe/ZnS表面的Zn原子的亲和力来实现，具有一定的局限性。并且，该方法需要多个步骤才能实现，过程比较复杂：①通过有机相合成方法制备疏水性的半导体量子点；②通过双官能团的巯基配体、二氧化硅和聚合物等修饰剂进一步修饰，使它们具有亲水性和生物相容性；③将多肽分子结合到量子点上。该方法还存在如下缺陷：①有机相合成需要使用大量的有机溶剂和有机金属试剂，反应温度高且毒性大；②额外复杂的修饰过程，导致量子点的粒径变大、荧光量子产率降低，不利于生物应用；③后续的多肽修饰过程繁琐复杂、副反应多、修饰效率低、所得探针稳定性差，且修饰过程容易破坏靶向多肽的结构。

[0005] 为了克服上述不足，以巯基为表面修饰试剂的水相合成量子点的方法受到广泛关注。所述的巯基主要包括α-硫代甘油、巯基乙酸、巯基丙酸、半胱氨酸以及乙酰半胱氨酸等。其中，中国专利CN103897699B公开了一种以硫代甘油为表面修饰剂，将镉溶液、锌溶液、碲溶液以及多肽溶液混合90-100℃恒温加热1-48h后冷却获得多肽-量子点纳米复合物溶液。
然而该方法未在多肽上修饰连接基团，会导致多肽分子与量子点表面结合不稳定的问题。

[0006] 最新研究发现，聚组氨酸通过侧链咪唑基团与量子点壳层的金属阳离子产生螯合作用，可作为量子点与多肽的定向连接的桥梁，且不会干扰蛋白质和量子点的功能，是发展量子点生物标记有潜力的方向。例如，文献(贾静,功能化多肽量子点的制备及其生物医学应用[D].南方医科大学,2013.)中设计了一种功能性聚乙二醇修饰的尾部含有聚组氨酸(His6)的多肽，并以一步法水相合成了多肽-CdTe量子点纳米探针，但是，天然蛋白质中很少含有聚组氨酸，并且聚组氨酸作为量子点生物标记桥梁与功能性肽段连接方式须采用醛和胺的腙化反应，其过程复杂，成腙与成脎反应竞争激烈。产品成脎路径中，还易分解为原底物，从而导致连接基团断裂，稳定性差。中国专利CN104231035B公开了一种以组氨酸-N-内羧酸酐为聚氨基酸单体，以具有末端氨基的多肽为引发剂，引发组氨酸-N-内羧酸酐的开环聚合，实现聚组氨酸链段与功能性多肽的共价偶联，并以聚组氨酸侧链咪唑基团与量子点壳层螯合连接，形成量子点-多肽复合物。该方法制备过程复杂，需要引入二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、甲苯等一种或者几种有机溶剂，容易导致有机溶剂残留，毒性较大。

[0007] 基于此，本发明通过大量的实验研究意外发现，以谷胱甘肽作为量子点表面修饰剂；用末端为Cys的带电荷的氨基酸短链为连接基团修饰靶向多肽(Cys-X)-Targeting domain；将Te溶液与Cd溶液混合加热至回流，缓慢滴加靶向多肽(Cys-X)-Targeting domain溶液，回流15-300min，制备了多肽-量子点复合探针。该方法以谷胱甘肽为量子点表面修饰剂，能够与靶向多肽中的Cys兼容，制备的多肽-量子点复合探针稳定性良好；并且谷胱甘肽为人体中自然合成的肽，生物相容性好、毒性低。该方法条件温和、绿色环保、工艺简单，制备的多肽-量子点复合探针可用于体内成像。

发明内容

[0008] 针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种多肽-量子点复合探针，所述多肽-量子点复合探针包括表面包覆谷胱甘肽的量子点CdTe和靶向多肽(Cys-X)-Targeting domain，所述Targeting domain为靶向多肽序列，所述Cys-X为连接基团，所述X为带电荷的氨基酸，所述X与Targeting domain的N端和/或C端连接，所述Cys与量子点CdTe结合。

[0009] 优选地，所述的X为Asp或Glu。

[0010] 优选地，所述的X为Glu。

[0011] 优选地，所述Targeting domain包括蛋白质靶向肽、细胞靶向肽、金属离子靶向肽中的一种或几种。

[0012] 优选地，所述Targeting domain为蛋白质靶向肽。

[0013] 优选地，所述Targeting domain为病变胶原蛋白靶向肽或Ⅰ型胶原蛋白靶向肽。

[0014] 优选地，所述Targeting domain为细胞靶向肽。

[0015] 优选地，所述Targeting domain是通过靶向细胞器来靶向细胞。

[0016] 优选地，所述的细胞器为内质网或细胞核。

[0017] 优选地，所述Targeting domain是通过靶向细胞上的细胞受体来靶向细胞。

[0018] 优选地，所述细胞受体为整合素。

[0019] 优选地，所述谷胱甘肽为L-谷胱甘肽和/或D-谷胱甘肽。

[0020] 本发明的另一目的在于提供一种多肽-量子点复合探针的制备方法，所述方法包括以下步骤：

[0021] (1)将谷胱甘肽与氯化镉溶解于超纯水中，得Cd溶液，所得溶液由氢氧化钠调节pH到10-13，脱氧搅拌待用；

[0022] (2)称取碲粉和硼氢化钠，脱氧后加入脱氧超纯水，于50-70℃反应得Te溶液；

[0023] (3)将Te溶液加入到Cd溶液中，100℃加热至回流，缓慢滴加1-2mL的靶向多肽(Cys-X)-Targeting domain溶液，回流15-300min，获得多肽-量子点复合探针溶液；

[0024] (4)将步骤(3)所述的多肽-量子点复合探针溶液冷却后，加入1-2倍体积的异丙醇沉淀探针，离心收集探针并由异丙醇洗涤后风干，即得多肽-量子点复合探针。

[0025] 优选地，所述步骤(3)中靶向多肽(Cys-X)-Targeting domain的浓度为2.5-10mg/ml。

[0026] 优选地，所述步骤(3)中Cd与Te的摩尔比为1:0.6-0.3。

[0027] 本发明的另一目的在于提供一种多肽-量子点复合探针在制备蛋白质成像试剂，细胞受体成像试剂或细胞器成像试剂中的应用。

[0028] 本发明的有益效果是：①本发明提供的多肽-量子点复合探针以谷胱甘肽为量子点表面修饰剂，以末端为Cys的带电荷的氨基酸短链为连接基团修饰多肽序列获得靶向多肽(Cys-X)-Targeting domain，所述连接基团能够与量子点表面修饰的谷胱甘肽兼容；②本发明提供的多肽-量子点复合探针可以在成分复杂的细胞培养基中数小时不破坏并能完成染色，具有良好的稳定性；③本发明使用的谷胱甘肽为人体中自然合成的肽，生物相容性、毒性低，可用于体内成像；④本发明提供的多肽-量子点复合探针的制备方法简单、条件温和、不需进一步的量子点修饰即可一步合成。

附图说明

[0029] 图1不同发射波长的多肽-量子点探针的发射光谱；

[0030] 图2不同发射波长的病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对小鼠病变膀胱组织的染色图；

[0031] 图3病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针特异性染色图；

[0032] 图4I型胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对小鼠尾组织的染色图；

[0033] 图5细胞核靶向肽-量子点复合探针对HeLa细胞的染色图；

[0034] 图6整合素靶向肽-量子点复合探针对HeLa细胞的染色图；

[0035] 图7内质网靶向肽-量子点复合探针对HeLa细胞的染色图。

具体实施方式

[0036] 为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。

[0037] 定义

[0038] 除非另外定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语具有的含义与所述方法所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和组合物也可用于实践或测试所述方法和组合物，但现在描述具有代表性的示例方法和组合物。也应了解本发明所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图限制本发明的将仅由随附权利要求限制的范围。

[0039] 必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文以及随附权利要求中所用，单数形式“一个/一种”和“所述”包括复数个(种)指示物。举例来说，提及“一种多肽-量子点复合探针”包括多种所述多肽-量子点复合探针，提及“所述多肽-量子点复合探针”是提及一种或多种多肽-量子点复合探针及其为本领域技术人员所知的等效物，依此类推。

[0040] “包含(包括)”意指“包括但不限于”，并且不意图排除例如其它组分、整数等。特定来说，在陈述为“包括金属离子靶向肽”，明确涵盖包括所列内容(除非包括限制性术语诸如“由...组成”)，这意味着不意图排除例如未列于所述雷人中的其它组分。

[0041] 在提供范围值的情况下，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述或中间值包含在所述方法和组合物内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内，并且也包括在所述方法和组合物内，受所述范围中任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些所包括的限制之一或两者的范围也包括在方法和组合物中。

[0042] 应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方式的上下文中描述的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的方法和组合物的各种特征也可单独提供或以任何合适的次组合提供。

[0043] 对于本领域技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的是，本文描述和表示出的每个单独实施方式具有可以容易地与任何其他实施例的特征分离或组合的独立组件和特征，而不脱离本方法的范围或精神。任何列举的方法可以按照所述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。

[0044] 术语“量子点”又可称为半导体纳米微晶体或人造原子，它们是包含100至1,000之间的任何数量的电子并且大小为约2nm至10nm的半导体晶体，主要由元素周期表中II-VI族(如CdTe，CdS，CdSe等)或III-V族(InP，InAs)及IV-VI族(如PbS，PbSe)元素组成。

[0045] 术语“包覆”是指量子点CdTe的表面修饰有谷胱甘肽，所述靶向多肽中的连接基团Cys-X将靶向多肽和量子点结合。

[0046] 术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指通过肽键或修饰的肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或更多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物，它们含有经修饰的残基和非天然存在的氨基酸聚合物。

[0047] 实施例1病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针的制备

[0048] 1.病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针的制备

[0049] 称取90mg谷胱甘肽与22.7mg氯化镉溶解于30ml超纯水中，得Cd溶液，所得溶液由1M氢氧化钠调节pH到11.5，脱氧搅拌待用；称取12.75mg碲粉和10mg硼氢化钠，脱氧后加入
1ml脱氧超纯水，于65℃反应得Te溶液；将0.5mlTe溶液加入到Cd溶液中，100℃加热回流，其中不同发生波长复合探针的回流时间如下：530nm探针回流15min，545nm探针回流30min，
560nm探针回流45min，575nm探针回流60min，585nm探针回流70min，600nm探针回流90min，
620nm探针回流120min，635nm探针回流150min，645nm探针回流180min，680nm探针回流
240min。回流至指定时间后，缓慢滴加1ml含10mg病变胶原蛋白靶向肽CE-(GPO)8-NH2的溶液，回流15min，分别获得不同发射波长的多肽-量子点复合探针溶液；多肽-量子点复合探针溶液冷却后，加入2倍体积的异丙醇沉淀探针，离心收集探针并由异丙醇洗涤后风干，即得不同发射波长的病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针。

[0050] 实施例2 I型胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针的制备

[0051] 称取90mg谷胱甘肽与22.7mg氯化镉溶解于30ml超纯水中，得Cd溶液，所得溶液由1M氢氧化钠调节pH到12.0，脱氧搅拌待用；称取12.75mg碲粉和10mg硼氢化钠，脱氧后加入
1ml脱氧超纯水，于65℃反应得Te溶液；将0.55mlTe溶液加入到Cd溶液中，100℃加热回流，回流时间如下：530nm探针回流15min，545nm探针回流30min，560nm探针回流45min，575nm探针回流60min，585nm探针回流70min，600nm探针回流90min，620nm探针回流120min，635nm探针回流150min，645nm探针回流180min，680nm探针回流240min。回流至指定时间后，缓慢滴加1ml含10mg I型胶原蛋白靶向肽CE-Ahx-LRELHLNNN-NH2的溶液，回流15min，获得不同发射波长的I型胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针溶液；多肽-量子点复合探针溶液冷却后，加入2倍体积的异丙醇沉淀探针，离心收集探针并由异丙醇洗涤后风干，即得不同发射波长的I型胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针。

[0052] 实施例3细胞核靶向肽-量子点复合探针的制备

[0053] 称取90mg谷胱甘肽与22.7mg氯化镉溶解于30ml超纯水中，得Cd溶液，所得溶液由1M氢氧化钠调节pH到12.0，脱氧搅拌待用；称取12.75mg碲粉和10mg硼氢化钠，脱氧后加入
1ml脱氧超纯水，于65℃反应得Te溶液；将0.5mlTe溶液加入到Cd溶液中，100℃加热回流，回流时间如下：530nm探针回流15min，545nm探针回流30min，560nm探针回流45min，575nm探针回流60min，585nm探针回流70min，600nm探针回流90min，620nm探针回流120min，635nm探针回流150min。回流至指定时间后，缓慢滴加1.5ml含7mgTAT靶向肽的溶液，回流15min，获得不同发射波长的细胞核靶向肽-量子点复合探针溶液；细胞核靶向肽-量子点复合探针溶液冷却后，加入2倍体积的异丙醇沉淀探针，离心收集探针并由异丙醇洗涤后风干，即得不同发射波长的细胞核靶向肽-量子点复合探针。

[0054] 实施例4整合素靶向肽-量子点复合探针的制备

[0055] 称取90mg谷胱甘肽与22.7mg氯化镉溶解于30ml超纯水中，得Cd溶液，所得溶液由1M氢氧化钠调节pH到12.5，脱氧搅拌待用；称取12.75mg碲粉和10mg硼氢化钠，脱氧后加入
1ml脱氧超纯水，于65℃反应得Te溶液；将0.6mlTe溶液加入到Cd溶液中，100℃加热回流，回流时间如下：530nm探针回流15min，545nm探针回流30min，560nm探针回流45min，575nm探针回流60min，585nm探针回流70min，600nm探针回流90min，620nm探针回流120min，635nm探针回流150min。回流至指定时间后，缓慢滴加1ml含5mg RGD靶向肽的溶液，回流15min，获得不同发射波长的整合素靶向肽-量子点复合探针溶液；整合素靶向肽-量子点复合探针溶液冷却后，加入2倍体积的异丙醇沉淀探针，离心收集探针并由异丙醇洗涤后风干，即得不同发射波长的整合素靶向肽-量子点复合探针。

[0056] 实施例5内质网靶向肽-量子点复合探针的制备

[0057] 称取90mg谷胱甘肽与22.7mg氯化镉溶解于30ml超纯水中，得Cd溶液，所得溶液由1M氢氧化钠调节pH到12.5，脱氧搅拌待用；称取12.75mg碲粉和10mg硼氢化钠，脱氧后加入
1ml脱氧超纯水，于65℃反应得Te溶液；将0.6mlTe溶液加入到Cd溶液中，100℃加热回流，回流时间如下：530nm探针回流15min，545nm探针回流30min，560nm探针回流45min，575nm探针回流60min，585nm探针回流70min，600nm探针回流90min，620nm探针回流120min，635nm探针回流150min。回流至指定时间后，缓慢滴加1ml含5mgER靶向肽的溶液，回流15min，获得不同发射波长的内质网靶向肽-量子点复合探针溶液；多肽-量子点复合探针溶液冷却后，加入2倍体积的异丙醇沉淀探针，离心收集探针并由异丙醇洗涤后风干，即得不同发射波长的内质网靶向肽-量子点复合探针。

[0058] 实施例6不同发射波长的多肽-量子点探针发射光谱测定

[0059] 配制浓度为1μg/ml的多肽-量子点探针溶液，取2ml溶液测定荧光发射光谱。激发波长为365nm，发射波长扫描范围为450-700nm。结果如图1所示，其中曲线1为发射波长530nm的I型胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针，曲线3为发射波长560nm的I型胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针；曲线10为发射波长680nm的I型胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针；曲线2为发射波长为545nm的病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针；曲线4为发射波长575nm的病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针；曲线6为发射波长600nm的病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针；曲线7为发射波长620nm的病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针；曲线9为发射波长645nm的病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针；曲线8为发射波长635nm的细胞核靶向肽-量子点复合探针；曲线5为发射波长585nm的整合素靶向肽-量子点复合探针。以上结果说明本方法制备的多肽-量子点复合探针发射波长可覆盖绿光到近红外波长范围。

[0060] 实施例7组织染色

[0061] 1.不同发射波长病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对损伤小鼠膀胱组织的染色

[0062] 取损伤小鼠膀胱组织样品制备冰冻切片至4μm；切片清洗后，在组织切片上加封闭液，放置30min后吸走液体，取0.1mg/ml上述病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针溶液100μL进行染色，4℃孵育6h；吸去染色液后；使用1x PBS洗涤3次，洗液清洗未结合的探针；滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。

[0063] 不同发射波长病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对损伤小鼠膀胱组织的染色结果如图2所示，其中a和e为530nm发射波长病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针的染色结果，b和f为545nm发射波长病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针的染色结果，c和g为585nm发射波长病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针的染色结果，d和h为620nm发射波长病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针的染色结果，上述染色结果表明，不同发射波长病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针均能染色损伤小鼠膀胱组织。

[0064] 2.病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对病变组织的特异性染色

[0065] 取小鼠不同部位组织样品制备冰冻切片至4μm；切片清洗后，在组织切片上加封闭液，放置30min后吸走液体，取0.1mg/ml探针溶液100μL进行染色，4℃孵育6h；吸去染色液后；使用1x PBS洗涤3次，洗液清洗未结合的探针；滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照；

[0066] 530nm发射波长的病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对各种组织染色结果如图3所示，其中a为病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对小鼠病变尾巴组织的染色结果，b为病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对小鼠正常尾巴组织的染色结果，c为未被靶向肽标记的量子点对小鼠病变尾巴组织的染色结果，d为病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对小鼠病变耳组织的染色结果，e为病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对小鼠正常耳组织的染色结果，f为未被靶向肽标记的量子点对小鼠病变耳组织的染色结果。染色结果表明，病变组织能够被病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针染色，但不能被未标记量子点染色；同时，病变胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针未对正常组织染色。以上结果说明，本方法制备的多肽-量子点复合探针在提供量子点固有优良发光性质的同时，赋予了探针优越的靶向识别能力。

[0067] 3.I型胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对小鼠尾组织的染色

[0068] 取小鼠尾巴组织样品制备冰冻切片至4μm；切片清洗后，在组织切片上加封闭液，放置30min后吸走液体，取0.1mg/ml探针溶液100μL进行染色，4℃孵育6h；吸去染色液后；使用1x PBS洗涤3次，洗液清洗未结合的探针；滴封固液，加盖玻片，使用荧光显微镜观察拍照。

[0069] I型胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对小鼠尾组织的染色结果如图4所示，其中a为585nm发射波长的I型胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对小鼠尾组织的染色图，b为600nm发射波长的I型胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针对小鼠尾组织的染色图，上述染色图表明，不同发射波长的I型胶原蛋白靶向肽-量子点复合探针均能染色小鼠尾组织。

[0070] 实施例8细胞染色

[0071] 1.细胞核靶向肽-量子点复合探针对HeLa细胞染色

[0072] HeLa细胞由3.7％多聚甲醛固定30min，0.05％Triton X-100处理2min。由PBS洗涤1次。取0.01mg/ml的细胞核靶向肽-量子点复合探针于室温染色2h，DAPI染色5min。PBS洗涤细胞3次。使用荧光显微镜观察拍照。

[0073] 530nm发射波长的细胞核靶向肽-量子点复合探针对HeLa细胞染色结果如图5所示，其中a为DAPI对细胞核的染色图，b为细胞核靶向肽-量子点复合探针对细胞核的染色图，c为DAPI和细胞核靶向肽-量子点复合探针对细胞核的叠加染色图。上述染色结果表明，探针靶向染色细胞核。

[0074] 2.整合素靶向肽-量子点复合探针对HeLa细胞染色

[0075] HeLa细胞由0.01mg/ml整合素靶向肽-量子点复合探针于室温染色6h，PBS洗涤细胞3次。3.7％多聚甲醛固定30min，由PBS洗涤1次。DAPI染色5min，PBS洗涤细胞3次。使用荧光显微镜观察拍照。

[0076] 620nm发射波长的整合素靶向肽-量子点复合探针对HeLa细胞的染色结果如图6所示，其中a为整合素靶向肽-量子点复合探针对细胞的染色图，b为DAPI对细胞核的染色图，c为DAPI和整合素靶向肽-量子点复合探针对细胞的叠加染色图。上述染色结果表明，整合素靶向肽-量子点复合探针靶向于细胞膜中整合素。

[0077] 3.内质网靶向肽-量子点复合探针对HeLa细胞染色

[0078] HeLa细胞由0.01mg/ml内质网靶向肽-量子点复合探针于室温染色2h，PBS洗涤细胞3次。3.7％多聚甲醛固定30min，由PBS洗涤1次。DAPI染色5min，PBS洗涤细胞3次。使用荧光显微镜观察拍照。

[0079] 620nm发射波长的内质网靶向肽-量子点复合探针对HeLa细胞染色结果如图7所示，其中a为内质网靶向肽-量子点复合探针对细胞的染色图，b为内质网靶向肽-量子点复合探针和DAPI同时对细胞的染色图。上述染色结果表明，探针靶向染色内质网。

[0080] 以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。