与长QT综合征相关的新突变蛋白、新突变基因及其应用

摘要

本发明公开了突变蛋白和突变的KCNH2基因，与人类KCNH2基因相比，具有c.1369G>A杂合错义变异，研究数据验证该突变与长QT综合征相关，基于请求保护上述突变蛋白和基因的用途，以及检测长QT综合征的试剂盒。本发明提供的突变的KCNH2基因可以将长QT综合征患者和正常人群区分开，可以作为临床辅助诊断长QT综合征的生物标志物；可以早期筛查该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询；为人类攻克长QT综合征提供可能的药物治疗靶点。

权利要求

1.一种人工制备的突变蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.2所示，与野生型钾离子通道蛋白同源比对，具有如下突变：A457T；其中所述野生型钾离子通道蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

2.一种突变的KCNH2基因片段，其编码权利要求1所述的突变蛋白。

3.根据权利要求2所述的突变的KCNH2基因片段，其核苷酸序列如Seq ID No.4所示，其与野生型KCNH2基因同源比对，具有c.1369G>A杂合错义变异，其中所述野生型KCNH2基因序列如Seq ID No.3所示。

4.权利要求1所述的突变蛋白的用途，其特征在于，将所述突变蛋白用作靶蛋白制备长QT综合征的检测试剂盒。

5.权利要求2所述的突变的KCNH2基因片段的用途，将突变的KCNH2基因片段作为靶分子片段制备长QT综合征检测试剂盒。

说明书

与长QT综合征相关的新突变蛋白、新突变基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种人体变异基因，特别是一种与长QT综合征相关的新突变蛋白、新突变基因及其应用。

背景技术

[0002] 长QT综合征(long QT syndrome，LQTS)是一种心脏结构正常但心肌复极延迟的单基因遗传性心血管疾病，主要表现为心电图校正的QT间期(QTc)延长，易发尖端扭转型室速
导致晕厥甚至SCD。长QT综合征临床表型多样，患者可终生无明显症状亦可幼年发生SCD。
2018年，长QT综合征被收录进《第一批罕见病目录》中。根据《罕见病诊疗指南(2019年版)》，
长QT综合征的发病率估测为1/2500例活产婴儿。未治疗的长QT综合征患者10年病死率可达
50％。对长QT综合征的发病特征简要总结如下：(1)发病年龄小，女性多见。(2)常有晕厥或
猝死家族史。(3)不同基因型和表现型，可累及钾、钠、钙通道。常有特征性尖端扭转性室速
(TdP)，导致晕厥或猝死。(4)心电图表现为QT间期延长。(5)心电图一般有如下特征：①表现
为QT间期延长，短‑长‑短周期现象诱发；②心室率160～240bpm，QRS波振幅与形态围绕等电
位线扭转，5～20个心动周期主波围绕基线扭转一次，多数能自行终止；③ATP较难终止TdP。

[0003] 目前报道的长QT综合征相关致病基因至少16个，其中明确的致病基因有9个(KCNQ1、KCNH2、SCN5A、KCNE1、KCNJ2、CACNA1C、CAV3、CALM1、CALM2)，分别编码电压门控钾、
钠、钙通道蛋白及其相关调节蛋白。其中KCNH2基因编码一种电压激活型钾离子通道，其野
生型蛋白序列信息在NCBI编号为NP_001191727.1，如本文附件氨基酸序列表SeqID No.1所
示，该蛋白在心室动作电位的复极末期起到重要作用，因此KCNH2基因也被称为hERG基因。

[0004] KCNH2基因突变与常染色体显性遗传的遗传性长QT综合征2型和短QT综合征1型(遗传方式未知)的发生有关。长QT综合征既有家族性发病病例，亦有散发病例，散发病例可
能与新发突变有关。长QT综合征主要为常染色体显性遗传，KCNQ1和KCNE1除了常染色体显
性遗传外，亦可由常染色体隐性遗传模式导致与耳聋相关的Jervell‑Lange‑Nielsen综合
征。长QT综合征有外显延迟性，致病基因突变携带者发病时间不等，早至宫内尚未分娩时即
可检测到QTc延长，亦有携带者晚年发病甚至终生不发病。长QT综合征尚无特殊疗法和根治
手段，只能通过手术或者药物对具体症状进行有限的缓解。因缺乏特异性临床表现，绝大多
数长QT综合征无法仅通过临床表现和传统实验室检查进行分型，具体分类需依靠基因诊
断，因此，基因检测是确诊长QT综合征的重要手段。

[0005] 现在，KCNQ1(LQT1)、KCNH2(LQT2)和SCN5A(LQT3)3个致病基因可解释约75％的患者，其余致病基因可解释5％～10％的患者。

[0006] 目前仍有15％～20％的长QT综合征患者无法用已知的致病基因解释，提示可能存在未发现的致病基因。基于该疾病的罕见性，任何一个或一组长QT综合征的相关基因的发
现与提出都将是对本领域的重要技术贡献。

发明内容

[0007] 本发明发明人在对长QT综合征的家系成员进行分析过程中意外发现家系中的长QT综合征患者具有KCNH2基因c.1369G>A杂合错义变异。该变异所致的氨基酸改变对应位置
由非极性的丙氨酸变为极性不带电荷的苏氨酸。

[0008] 查询人群频率数据库发现该变异为罕见变异(千人基因组：无，ESP6500：无，ExAC：无)。在发现此变异之前，现有数据库中均未有报道病症相关家系携带有该变异，数据库包
括但不限于中国各地区人群。使用多个生物信息预测软件(包括SIFT和Polyphen‑2)对该变
异进行交叉预测，结果多为有害(SIFT为“D”，Polyphen‑2为“D”，其他为“5个D/1个M”)，提示
该变异所致的氨基酸改变可能会对蛋白功能产生影响。查询数据库发现该位置的氨基酸在
脊椎动物中高度保守；查询ClinVar、HGMD数据库未发现该变异，该位点附近的错义变异
c.1383G>T(p.Met461Ile)、c.1379G>T(p.Gly460Val)、c.1379G>C(p.Gly460Ala)、c.1376T>
C(p.Leu459Pro)、c.1370C>A(p.Ala457Asp)、c.1342G>A(p.Glu448Lys)均被报导为致病变
异，文献检索未发现本发明发现的变异与长QT综合征的关系。

[0009] 发明人通过大量样本验证了该变异与长QT综合征患者的关系，该发现对于长QT综合征诊断、优生筛查，以及未来作为药物设计靶点方面都具有重要意义。基于此，本发明请
求保护以下技术方案：

[0010] 本发明的第一方面，提供一种人工制备的突变蛋白，其与野生型钾离子通道蛋白同源比对，具有如下突变：A457T；

[0011] 其中所述野生型钾离子通道蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

[0012] 本领域技术人员可以理解，上述人工制备的突变蛋白，基于一些使用目的，突变蛋白仅需具有上述突变位点即可，而不必如野生型蛋白一样完整。

[0013] 优选地，所述人工制备的突变蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

[0014] 本发明的第二方面提供一种突变的KCNH2基因片段，其编码上述人工制备的突变蛋白。

[0015] 本领域技术人员很好理解，基于氨基酸密码子的简并性，编码上述突变蛋白的基因片段可以是多种序列；

[0016] 优选地，所述突变的KCNH2基因片段与野生型KCNH2基因同源比对，具有c.1369G>A杂合错义变异，其中所述野生型KCNH2基因序列为人第7号染色体chr7:150646497‑
150652917区间的片段(Seq ID No.3)。

[0017] 优选地，所述突变的KCNH2基因片段具有Seq ID No.4所示的序列。

[0018] 第三方面，本发明提供了上述的突变蛋白的用途应用，其特征在于，将所述突变蛋白分子用作靶蛋白以研发长QT综合征的检测试剂盒或治疗药物。

[0019] 第五方面，本发明提供了上述突变的KCNH2基因片段的用途，其特征在于，将所述突变基因作为靶分子片段，用于研发长QT综合征检测试剂盒或治疗药物。

[0020] 第六方面，本发明提供了一种检测长QT综合征的试剂盒，其特征在于，包含

[0021] 扩增上述突变的KCNH2基因的特异性引物，和/或检测上述突变的KCNH2基因的特异性探针。

[0022] 在一个优选的实施方案中，所述特异性引物具有：

[0023] 正向引物KCNH2‑E5F：其核苷酸序列为：5'CCAGGTCCTTCCCAAGACAC 3'，和

[0024] 反向引物KCNH2‑E5R其核苷酸序列为：5'TGAAACCAAATGCCGAGCTTC 3'。

[0025] 优选地，还包括阳性对照重组质粒；阴性对照重组质粒；

[0026] 优选地，还DNA提取试剂、Taq DNAPolymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、PCR稳定剂及增强剂等。

[0027] 优选地，所述试剂盒还包含对PCR扩增产物进行测序的试剂。

[0028] 优选地，所述对PCR扩增产物进行测序的试剂为Sanger测序试剂、荧光定量PCR试剂、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)方法用试剂、单链构象多态性(SSCP)分析用试剂和
等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)检测用试剂中的一种或多种。

[0029] 本发明的有益效果是：

[0030] 1.本发明提供的KCNH2基因c.1369G>A杂合错义变异可以将长QT综合征患者和正常人群区分开，因此，该变异可以作为临床辅助诊断长QT综合征的生物标志物。

[0031] 2.通过检测受试者是否携带上述变异，可以早期筛查该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生。

[0032] 3.为人类攻克长QT综合征提供可能的药物治疗靶点，促进创新药物研发。

附图说明

[0033] 图1是实施例2中长QT综合征患者家系图。

[0034] 图2是长QT综合征患者与正常对照的KCNH2基因测序结果，其中，A为家系中及本地数据库中正常对照的Sanger测序图，B为家系中长QT综合征患者的Sanger测序图。

具体实施方式

[0035] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

[0036] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

[0037] 试剂来源：

[0038] PCR Mix：2×Taq MasterMix(Dye)，购自江苏康为世纪生物科技有限公司，货号：2+
l01037/70335；包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg 、dNTPs、PCR稳定剂和
增强剂等常规PCR所需要的组分。

[0039] Agencourt AMPure XP磁珠：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，货号：311303。

[0040] 扩增用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0041] RNase‑Free H2O：购自北京索莱宝科技有限公司。

[0042] 磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒：购自江苏百世诺医疗科技有限公司，批号：20031886‑01C。

[0043] 实施例1：长QT综合征患者/携带者验证实验

[0044] 样本来源：保定市第一中心医院，在长QT综合征先证者及家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5‑10mL全血样本(加入EDTA抗凝，‑80℃保存)，建立病历资料库，详细记录
先证者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。

[0045] 随机收集200名与该长QT综合征先证者家系无关的健康样本作为验证样本，每位采集2‑4ml EDTA抗凝血，‑80℃保存。

[0046] 1.制备基因组DNA

[0047] 对先证者和验证样本的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，采用磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒，操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行
检测，作为PCR扩增的模板DNA。

[0048] 2.准备PCR反应体系

[0049] 该PCR反应体系用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成为：PCR Mix 25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA＜1000ng，加RNase‑Free H2O
补至50μL。所用的正、反向引物信息如下表1所示：

[0050] 表1引物信息

[0051] 3.目的片段扩增

[0052]

[0053] 将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s,59℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最终72℃延伸2min；4℃
保存。

[0054] 4.PCR产物的检测

[0055] 取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考，检测验证扩增产物为预期的大小。

[0056] 5.PCR产物纯化

[0057] PCR产物检测后，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化，纯化步骤按照产品说明书进行，具体步骤如下：

[0058] 5.1涡旋振荡磁珠30秒，使其彻底混匀为均一溶液。

[0059] 5.2向1.5ml的离心管中加入待纯化的PCR产物，然后加入2倍样品体积的磁珠溶液。涡旋振荡混匀后，室温下在1400rpm的Thermomixer上振荡5分钟。

[0060] 5.3将上一步的离心管放于磁力架上，直至磁珠完全吸附(约需1分钟)。

[0061] 5.4保持离心管固定于磁力架上，弃去溶液，期间避免接触磁珠。

[0062] 5.5向上一步的离心管中加入500μL Buffer PW后，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡10秒钟后将离心管重新放回磁力架，静置1分钟，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后彻
底弃去漂洗液。

[0063] 5.6重复步骤5.5。

[0064] 5.7保持离心管固定于磁力架上静置放置10分钟，使乙醇完全挥发干净。

[0065] 5.8将离心管从磁力架上取下，加入20‑100μL Buffer EB，涡旋振荡将磁珠重悬于洗脱液中后将离心管放于65℃、1400rpm的Thermomixer上振荡洗脱5分钟。

[0066] 5.9将离心管放于磁力架上直至磁珠完全吸附(约需1分钟)。

[0067] 5.10将洗脱液转移至一个新的1.5ml离心管中，此时，可弃去磁珠。

[0068] 6.Sanger测序

[0069] 使用AppliedBiosystems 3500Dx系列基因分析仪对扩增产物进行Sanger测序。

[0070] 7.测序结果进行生物信息学分析

[0071] 将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型KCNH2基因序列(Suq id No.3)在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。

[0072] 测序后获得的原始数据由Trimmomatic(version 0.36)(可参考Bolger AM,Lohse M,Usadel B,Trimmomatic:a flexible trimmer for Illumina sequence data.2014 30
(15):2114‑20，通过参考的方式将其全文并入本文)进行处理，经过过滤去除污染，包括：修
剪接头序列，去除低质量的reads；

[0073] 应用fastp(Chen S,Zhou Y,Chen Y,et al,fastp:an ultra‑fast all‑in‑one FASTQ preprocessor. 2018 34(17):i884‑i890，通过参考的方式将其全文并入本文)对
clean reads进行质量控制，统计每个碱基位置的测序质量平均值以及GC含量分布，保证后
续分析的准确性。

[0074] 使用BWA(version 0.7.12‑r1039)(通过Burrows‑Wheeler变换比对)比对参考基因组hg19，获得比对到基因组上的唯一比对序列。

[0075] 然后利用Samtools(version 1.2)(可参考Li H,Handsaker B,Wysoker A,et al,The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.2009 25(16):2078‑9，通过参考的
方式将其全文并入本文)和VarScan(version v2.3.9)(可参考Koboldt DC,Chen K,Wylie,
et al,VarScan:variant detection in massively parallel sequencing of 
individual and pooled samples.Bioinformatics 2009,25(17),2283‑5,通过参考的方
式将其全文并入本文)确定靶区域的SNP和INDEL的基因型。

[0076] 通过四个公共数据库：dbSNP(version 138)(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp138.txt.gz.)，千人数据库(https://
www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)，ESP数据库(https://
esp.gs.washington.edu/drupal/)，ExAC数据库(http://exac.hms.harvard.edu/)的过
滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。

[0077] 通过比对正常样本，去掉所有已知变异，同义变异以及非编码区的变异，利用SIFT(可参考Choi Y,Sims GE,Murphy S,et al,Predicting the Functional Effect of 
Amino Acid Substitutions and Indels.PLoS ONE 2009,7(10):e46688,通过参考的方式
将其全文并入本文)和Polyphen(可参考Adzhubei IA,Schmidt S,Peshkin L,A method 
and server for predicting damaging missense mutations.2010 7(4):248‑9.通过参
考的方式将其全文并入本文)软件进行SNP功能预测，结果提示该变异所致的氨基酸改变可
能会对蛋白功能产生影响。另外通过查询ClinVar数据库(https://www.snpedia.com/
index.php/ClinVar)、HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.

[0078] uk/ac/index.php)数据库以及文献检索均未发现该变异与疾病相关的报导。综合考虑测序质量和生物信息学分析结果，最终发现先证者可能具有致病意义的基因突变
(KCNH2基因c.1369G>A，p.Ala457Thr杂合错义变异)。测序结果显示，先证者有KCNH2基因
c.1369G>A杂合错义变异(KCNH2:p.Ala457Thr het)，而200名健康的对照成员均未检测到
该变异。查询“人群频率数据库”发现该变异为罕见变异，千人基因组(https://
www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无；ESP6500(https://
esp.gs.washington.edu/drupal/)：无；ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/)：无。在发
现此变异之前，现有数据库中均未有报道病症相关家系携带有该变异，数据库包括但不限
于中国各地区人群。使用多个生物信息预测软件(包括SIFT和Polyphen‑2)对该变异进行交
叉预测，结果多为有害(SIFT为“D”，Polyphen‑2为“D”，其他为“5个D/1个M”)，提示该变异所
致的氨基酸改变可能会对蛋白功能产生影响。氨基酸由非极性的丙氨酸变为极性不带电荷
的苏氨酸。查询数据库发现该位置的氨基酸在脊椎动物中高度保守。查询ClinVar
(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)、HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/
index.php)数据库未发现该变异，该位点附近的错义变异c.1383G>T(p.Met461Ile)、
c.1379G>T(p.Gly460Val)、c.1379G>C(p.Gly460Ala)、c.1376T>C(p.Leu459Pro)、c.1370C>
A(p.Ala457Asp)、c.1342G>A(p.Glu448Lys)均被报导为致病变异，文献检索未发现该变异
与疾病相关的报导。

[0079] 8.基因变异论证

[0080] 200名表型健康的对照成员均未检测到该变异；长QT综合征先证者检测到KCNH2基因c.1369G>A杂合错义变异。

[0081] 实施例2：无关样本验证实验‑‑长QT综合征家系筛查

[0082] 1.实验方法

[0083] 招募1个长QT综合征家系(家系图如图1所示)，对所有的家系成员(4名家系内患者和4名家系内正常人)进行实验室检查、心电图和动态心电图检查、运动心电图检查和影像
学检查，初步确认其符合长QT综合征家系特征。

[0084] 通过基因检测，在该家系中检查到有4名长QT综合征病人；据家系成员介绍，该家系中有一名已故成员也是长QT综合征患者。

[0085] 另外招募了1453名未患有长QT综合征的健康人群作为对照。

[0086] 使用实施例1中的方法扩增该家系每个成员以及对照人群的KCNH2基因c.1369，扩增完成后进行Sanger测序后进行分析。

[0087] 基于样本信息保密，现公开部分样本信息。

[0088] 样本可公开信息：

[0089] (1)长QT综合征家系国别/地区：中国/保定

[0090] 家系成员男女比例：4﹕7

[0091] 家系成员年龄分布：26‑80岁

[0092] (2)对照人群国别/地区：中国

[0093] 对照人群男女比例：1﹕1

[0094] 对照人群年龄分布：12‑78岁

[0095] 2.结果

[0096] Sanger测序结果显示(如图2所示)，招募的长QT综合征家系中患病成员均携带c.1369G>A杂合突变；而家系内非患病成员和正常对照人群未见前述任一位点的突变。

[0097] 实施例3：体外检测长QT综合征患者的KCNH2基因试剂盒

[0098] 1、试剂盒组成：

[0099]

[0100] 2、使用方法：

[0101] (1)基因组DNA提取：使用DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。

[0102] (2)PCR扩增：采用上述的试剂盒进行PCR扩增，反应体系和反应条件参照实施例1。

[0103] (3)对PCR扩增产物进行纯化。

[0104] (4)对纯化的PCR扩增产物进行Sanger测序。

[0105] (5)分析测序结果，比对是否有KCNH2基因c.1369G>A杂合突变。

[0106] 上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术
方案的范围内。