一种制备高纯度鼠尾草酚的方法

摘要

一种制备高纯度鼠尾草酚的方法。将迷迭香提取物用水饱和的醋酸乙酯进行溶解；溶解液正相硅胶拌样，干法上柱，用氯仿∶甲醇∶乙酸＝(100～95)∶(0～5)∶(0～1‰)进行梯度洗脱，合并相同组分，减压浓缩得到纯度85％左右的鼠尾草酚；再进行Sephadex LH‑20凝胶柱色谱纯化，流动相用氯仿‑甲醇或石油醚‑氯仿‑甲醇进行洗脱，合并相同组分，减压蒸干得到纯度在98％以上的鼠尾草酚。该方法能够从迷迭香提取物中获得含量≥98％的高纯度鼠尾草酚。凝胶柱可以反复使用，每次柱层析时间短，效率高。该方法简单、容易操作、收率高，适合规模化生产。

权利要求

1.一种制备高纯度鼠尾草酚的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：I. 将迷迭香提取物用水饱和的醋酸乙酯溶解，过滤，除去不溶物；

II. 滤液用正相硅胶拌样，干法装柱、干法上样，流动相的体积比用氯仿：甲醇：乙酸 =（100 95）:（0 5）:（0 1‰）进行梯度洗脱，合并相同组分，获得5个组分，分别为：小极性杂质~ ~ ~

部分、鼠尾草酚粗品、鼠尾草酸粗品、主要成分为熊果酸的组分和大极性杂质部分；

. 反复用羟丙基葡聚糖凝胶柱对步骤II获得的鼠尾草酚粗品进行纯化，流动相用体积比为：氯仿：甲醇=（2 2.5）:1或石油醚：氯仿：甲醇=（2 5）:（2 5）:1进行等度洗脱，合并相~ ~ ~

同组分，减压蒸干各组分，得到含量≧98%的鼠尾草酚。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述迷迭香提取物为迷迭香花或叶的乙醇水溶液浸提物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤I中梯度洗脱分五次进行，流动相依次为：氯仿；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100：0：1‰；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100：1：

1‰；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100：2：1‰；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为95：5：1‰。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤 中羟丙基葡聚糖凝胶柱的长度为120 150 cm；湿法装柱，湿法上样；流动相在羟丙基葡聚糖凝胶中的流速为2   6 ml/~ ~

min。

5.根据权利要求1‑4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤 中流动相的体积比为：氯仿：甲醇= 2.5：1，或者石油醚：氯仿：甲醇 = 5：5：1。

说明书

一种制备高纯度鼠尾草酚的方法

[0001] 本申请是专利申请《一种从迷迭香提取物中同时制备高纯度鼠尾草酚和鼠尾草酸的方法》的分案申请，原申请号：201810092815.5，原申请日：2018年1月30日。

技术领域

[0002] 本发明涉及一种从迷迭香提取物制备高纯度的天然抗氧化活性成分鼠尾草酚的方法，具体涉及一种对分离大量鼠尾草酚具有显著效果的Sephadex LH‑20凝胶柱色谱的分
离方法。

背景技术

[0003] 迷迭香是一种天然的抗氧化剂，而鼠尾草酚和鼠尾草酸是其主要的抗氧化成分，随着功能食品行业的快速发展，对食用抗氧化产品的需求量越来越大；而随着迷迭香成功
引种到我国及大面积的栽培，找到即简单易行又廉价的从迷迭香或其提取物制备高纯度抗
氧化活性单体的方法，将具有很好的使用价值和现实意义。

[0004] 有多篇专利报道了迷迭香中抗氧化活性物质的提取方法：CN 1698587A报道了迷迭香总酚类物质的提取方法，其中主要成分鼠尾草酚和鼠尾草酸的含量之和在13％以上；
CN 101402864A发明制得的产品，其中主要抗氧化活性成分鼠尾草酚和鼠尾草酸的含量大
于50wt％；CN 105669432 A得到的迷迭香提取物中鼠尾草酚和鼠尾草酸的含量在40‑45％。
但截止目前，有多篇专利报道了只从迷迭香中分离纯化得到高纯度鼠尾草酸的方法：CN 
102115442 A利用制备磷酸‑硅胶柱层析，得到纯度为92％的鼠尾草酸；CN 104058955 A运
用硅胶柱层析的方法，可获得纯度在98％以上鼠尾草酸；CN 101851158 A用中压色谱分离
纯化，再用有机溶剂重结晶得到98％纯度的鼠尾草酸；CN 101113133 A迷迭香用EDTA二钠
盐的弱碱水溶液进行提取，滤液用酸调pH并用有机溶剂调极性，得沉淀，干燥即得纯度为
99.42％的鼠尾草酸。也有只从迷迭香中分离纯化得到鼠尾草酚的方法：CN 103319495 A利
用大孔吸附树脂纯化得到鼠尾草酚粗品，再用亲水性有机溶剂结晶得到纯度95％的鼠尾草
酚；CN 102171217 A将迷迭香提取液与加按一定比例的乙酸形成结晶，可得到的纯度
85.6％的鼠尾草酚；专利CN 101835782 A和专利CN 101835783 A报道，利用催化由鼠尾草
酸生产鼠尾草酚的方法，得到纯度90％以上的鼠尾草酚。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供一种大量制备高纯度鼠尾草酚的方法，该方法简单、容易操作、收率高，适合规模化生产。

[0006] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

[0007] 一种制备高纯度鼠尾草酚的方法，该方法包括以下步骤：

[0008] I.将迷迭香提取物用水饱和的醋酸乙酯溶解，过滤，除去不溶物；

[0009] II.滤液用正相硅胶拌样，干法装柱、干法上样，用氯仿∶甲醇∶乙酸＝(100～95)∶(0～5)∶(0～1‰)(体积比)进行梯度洗脱，合并相同组分，获得5个组分，分别为：小极性杂
质部分、鼠尾草酚粗品、鼠尾草酸粗品、主要成分为熊果酸的组分和大极性杂质部分；

[0010] III.用羟丙基葡聚糖凝胶对步骤I获得的鼠尾草酚粗品进行纯化，流动相用氯仿∶甲醇＝(2～2.5)∶1(体积比)或石油醚∶氯仿∶甲醇＝(2～5)∶(2～5)∶1(体积比)进行等度洗
脱，合并相同组分，减压蒸干，得到含量≥98％的鼠尾草酚。

[0011] 如上所述的方法，优选地，所述迷迭香提取物为迷迭香花或叶的乙醇水溶液浸提物。

[0012] 如上所述的方法，优选地，所述迷迭香提取物的提取方法为：将迷迭香花或叶粉碎，用体积百分浓度为(50～70)％乙醇水溶液按照液料比为(10～15)∶1(L/Kg)进行超声提
取，时间为60～90分钟，连续提取2～4次，合并提取液，减压浓缩蒸干后得到迷迭香提取物。

[0013] 如上所述的方法，优选地，所述步骤I中梯度洗脱分五次进行，流动相依次为：氯仿；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100∶0∶1‰；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100∶1∶1‰；氯仿、甲
醇、乙酸，体积比为100∶2∶1‰；氯仿、甲醇、乙酸，体积比为95∶5∶1‰。

[0014] 如上所述的方法，优选地，所述步骤II中羟丙基葡聚糖凝胶柱的长度为120～150cm；湿法装柱，湿法上样；流动相在羟丙基葡聚糖凝胶中的流速为2～6ml/min。

[0015] 如上所述的方法，优选地，所述步骤II中氯仿∶甲醇＝2.5∶1(体积比)，或者石油醚∶氯仿∶甲醇＝5∶5∶1(体积比)。

[0016] 本发明的有益效果在于：本发明的方法只用一次正相硅胶吸附柱，既除去了样品中吸附性的色素杂质，又避免了正相硅胶多次重复上样导致死吸附而造成样品的损失。
Sephadex LH‑20凝胶对被分离样品没有吸附，可以反复多次使用。本方法操作简单易行，适
合用迷迭香提取物规模化生产含量≥98％的鼠尾草酚。

附图说明

[0017] 图1为高纯度鼠尾草酚HPLC检测图；

[0018] 图2为鼠尾草酚1H‑NMR图；

[0019] 图3为鼠尾草酚13C‑NMR图；

具体实施方式

[0020] 实施例1制备迷迭香提取物

[0021] 将干燥的迷迭香叶10Kg粉碎过20目筛，溶剂用体积百分浓度为60％的乙醇水溶液，液料比为12∶1(L/Kg)进行超声提取，超声时间75min。连续提取三次，合并提取液，减压
浓缩蒸干后得到迷迭香提取物，其中鼠尾草酚含量为10.28wt％。

[0022] 实施例2从迷迭香提取物中制备高纯度鼠尾草酚

[0023] (一)正相硅胶柱分离纯化

[0024] 将实施例1制备的迷迭香提取物500g加入5000ml用水饱和的醋酸乙酯中，超声溶解0.5小时，过滤，除去不溶物。滤液用500g正相硅胶(160‑200目)拌样，3000g正相硅胶
(160‑200目)干法上柱，用常压正相硅胶柱色谱纯化。进行梯度洗脱，按照洗脱顺序，各流动
相和提取物如下：

[0025] (1)流动相为氯仿，洗脱体积为5L，洗脱成分主要为小极性杂质部分；

[0026] (2)流动相为氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100：0：1‰，洗脱体积为10L，主要成分为含量在85％左右的鼠尾草酚；

[0027] (3)流动相为氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100：1：1‰，洗脱体积为15L，主要成分为含量在90％的鼠尾草酸；

[0028] (4)流动相为氯仿、甲醇、乙酸，体积比为100：2：1‰，洗脱体积为10L，主要成分为熊果酸；

[0029] (5)流动相为氯仿、甲醇、乙酸，体积比为95：5：1‰，洗脱体积为5L，主要成分为大极性杂质部分。

[0030] 合并相同组分，减压回收溶剂，可以得到含量≥98％的鼠尾草酚1.2g，将含量85％左右的鼠尾草酚组分用于下一步凝胶柱分离。

[0031] (二)凝胶柱分离纯化

[0032] 将步骤(一)获得的含85wt％左右的鼠尾草酚组分，反复用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH‑20凝胶)进行纯化。凝胶柱的长度为150cm，湿法装柱，湿法上样。流动相用氯
仿∶甲醇＝2.5∶1(体积比)进行洗脱，流动相的流速为5ml/min，层析时间为490min。合并相
同组分，减压蒸干，得到≥98％高含量的鼠尾草酚41.5g。

[0033] (三)HPLC检测

[0034] 对步骤(二)获得的鼠尾草酚进行HPLC检测，结果见附图1。

[0035] 液相色谱仪：Waters 2545型2998检测器

[0036] 色谱柱：Waters XBridge TM Shield RP 18 Column(4.6*250mm，5μm)

[0037] 流速：1mL/min

[0038] 检测波长：284nm

[0039] 进样量：10μl

[0040] 供试品及对照品配制溶液：色谱级甲醇溶解

[0041] 检测鼠尾草酚的流动相：甲醇∶水∶冰乙酸＝70∶30∶3‰

[0042] 鼠尾草酚出峰时间：13.76min

[0043] (四)核磁共振一维谱的测定

[0044] 用INOVA‑500核磁共振仪(美国Varian公司)对步骤(二)获得的含量≥98％的鼠尾草酚样品进行检测，得到一维核磁氢谱和碳谱数据，结果参见附图2、图3。

[0045] 1.鼠尾草酚的波谱数据

[0046] 1H‑NMR(DMSO，500MHz)δ：0.78(3H，s，H‑18)，0.81(3H，s，H‑19)，1.12(3H，d，J＝7.0Hz，H‑16)，1.23(3H，d，J＝7.0Hz，H‑17)，3.22(1H，m，H‑15)，5.46(1H，s，H‑7)，6.70(1H，
s，H‑14)；

[0047] 13C‑NMR(DMSO，100MHz)δ：28.81(C‑1)，18.57(C‑2)，40.55(C‑3)，34.18(C‑4)，47.87(C‑5)，29.26(C‑6)，76.95(C‑7)，134.25(C‑8)，131.57(C‑9)，44.95(C‑10)，143.30
(C‑11)，143.07(C‑12)，121.87(C‑13)，111.28(C‑14)，26.20(C‑15)，22.82(C‑16)，22.69
(C‑17)，31.38(C‑18)，19.44(C‑19)，175.54(C‑20)。

[0048] 与已知文献进行比对，最终确证了鼠尾草酚的结构。

[0049] 实施例3从迷迭香提取物中制备高纯度鼠尾草酚

[0050] (一)正相硅胶柱分离纯化

[0051] 采用与实施例2步骤(一)相同的方法获得含量85％左右的鼠尾草酚组分。

[0052] (二)凝胶柱分离纯化

[0053] 将步骤(一)获得的含85wt％左右的鼠尾草酚组分，反复用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH‑20凝胶)进行纯化。凝胶柱的长度为120cm，湿法装柱，湿法上样。流动相用氯
仿∶甲醇＝2∶1(体积比)进行洗脱，流动相的流速为3ml/min，层析时间为500min。合并相同
组分，减压蒸干，得到≥98％高含量的鼠尾草酚40.8g。

[0054] (三)HPLC检测

[0055] 分别对步骤(二)获得的鼠尾草酚进行HPLC检测，检测条件同实施例2中步骤(三)，结果鼠尾草酚出峰时间与实施例2相近似。

[0056] 实施例4从迷迭香提取物中制备高纯度鼠尾草酚

[0057] (一)正相硅胶柱分离纯化

[0058] 采用与实施例2步骤(一)相同的方法获得含量85％左右的鼠尾草酚组分。

[0059] (二)凝胶柱分离纯化

[0060] 将步骤(一)获得的含85wt％左右的鼠尾草酚组分，反复用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH‑20凝胶)进行纯化。凝胶柱的长度为150cm，湿法装柱，湿法上样。流动相用石
油醚∶氯仿∶甲醇＝5∶5∶1(体积比)进行洗脱，流动相的流速为6ml/min，层析时间为490min。
合并相同组分，减压蒸干，得到≥98％高含量的鼠尾草酚41.3g。

[0061] (三)HPLC检测

[0062] 对步骤(二)获得的鼠尾草酚进行HPLC检测，检测条件同实施例2中步骤(三)，结果鼠尾草酚出峰时间与实施例2相近似。

[0063] 实施例5从迷迭香提取物中制备高纯度鼠尾草酚

[0064] (一)正相硅胶柱分离纯化

[0065] 采用与实施例2步骤(一)相同的方法获得含量85％左右的鼠尾草酚组分。

[0066] (二)凝胶柱分离纯化

[0067] 将步骤(一)获得的含85wt％左右的鼠尾草酚组分，反复用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH‑20凝胶)进行纯化。凝胶柱的长度为150cm，湿法装柱，湿法上样。流动相用石
油醚∶氯仿∶甲醇＝2∶2∶1(体积比)进行洗脱，流动相的流速为5ml/min，层析时间为500min。
合并相同组分，减压蒸干，得到≥98％高含量的鼠尾草酚41.2g。

[0068] (三)HPLC检测

[0069] 分别对步骤(二)获得的鼠尾草酚进行HPLC检测，检测条件同实施例2中步骤(三)，结果鼠尾草酚出峰时间与实施例2相近似。

[0070] 比较例1迷迭香提取物的溶解试验

[0071] 称六份实施例1制备的迷迭香提取物，每份10g分为六组，每组分别用100ml：石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、80％乙醇、用水饱和的醋酸乙酯进行超声溶解0.5小时，过滤去掉
不溶物，滤液减压浓缩得浸膏，称量检测计算鼠尾草酚的含量。

[0072] 具体分组操作如下：

[0073] 第一组：10g迷迭香提取物，加100ml石油醚超声溶解0.5小时，过滤除去不溶物，滤液减压浓缩得浸膏3.9g，鼠尾草酚含量为14.15％，计算鼠尾草酚绝对含量为0.5519g。石油
醚不能将提取物中的鼠尾草酚完全溶出。

[0074] 第二组：10g迷迭香提取物，加100m1氯仿超声溶解0.5小时，过滤除去不溶物，滤液减压浓缩得浸膏5.0g，鼠尾草酚含量为15.10％，计算鼠尾草酚绝对含量为0.7550g。氯仿溶
解不能将提取物中的鼠尾草酚完全溶出。

[0075] 第三组：10g迷迭香提取物，加100m1醋酸乙酯超声溶解0.5小时，过滤除去不溶物，滤液减压浓缩得浸膏5.6g，鼠尾草酚含量为16.01％，计算鼠尾草酚绝对含量为0.8966g。醋
酸乙酯溶解，也不能将提取物中的鼠尾草酚完全溶出。

[0076] 第四组：10g迷迭香提取物，加100ml丙酮超声溶解0.5小时，过滤除去不溶物，滤液减压浓缩得浸膏6.0g，鼠尾草酚含量为15.87％，计算鼠尾草酚绝对含量为0.9522g。丙酮溶
解，也不能将提取物中的鼠尾草酚完全溶出。

[0077] 第五组：10g迷迭香提取物，加100ml 80％乙醇超声溶解0.5小时，过滤除去不溶物，滤液减压浓缩得浸膏6.5g，鼠尾草酚含量为15.42％，计算鼠尾草酚绝对含量为
1.0023g。80％乙醇溶解，能将提取物中的鼠尾草酚完全溶出。

[0078] 第六组：10g迷迭香提取物，加100ml用水饱和的醋酸乙酯超声溶解0.5小时，滤液减压浓缩得浸膏6.3g，鼠尾草酚含量为16.27％，计算鼠尾草酚绝对含量为1.0250g。用水饱
和的醋酸乙酯溶解，能将提取物中的鼠尾草酚完全溶出，且最大限度地除去了大极性的杂
质，回收溶剂简单容易。