一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒

摘要

本发明提供了一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，包括两条crDNA或者两条crRNA。所述crDNA包括：靶向E gene的crDNA：其序列如SEQ ID NO.3‑5中任一所示；靶向N gene的crDNA：其序列如SEQ ID NO.6‑8中任一所示。所述crRNA包括：靶向E gene的crRNA：其序列如SEQ ID NO.9‑11中任一所示；靶向N gene的crRNA：其序列如SEQ ID NO.12‑14中任一所示。本发明设计与新型冠状病毒E gene和N gene相关的crRNA，结合CRISPR‑cpf1系统进行筛查检测，此方法具有简单、速度快、灵敏度高、特异性强的特点，实用性极强。

权利要求

1.一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：用于检测新型冠状病毒的crDNA或crRNA，cpf1蛋白和荧光探针；

其中所述crDNA包括：

靶向E gene的crDNA：其序列如SEQ ID NO.3‑5中任一所示；

靶向N gene的crDNA：其序列如SEQ ID NO.6‑8中任一所示；

所述crRNA包括：

靶向E gene的crRNA：其序列如SEQ ID NO.9‑11中任一所示；

靶向N gene的crRNA：其序列如SEQ ID NO.12‑14中任一所示；

所述荧光探针选自如下探针中的一个：荧光探针1：其序列如SEQ ID NO.26所示；

荧光探针2：其序列如SEQ ID NO.27所示；

荧光探针3：其序列如SEQ ID NO.28所示。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团；所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ‑1、BHQ‑2和BHQ‑3中的一种；

或者所述荧光探针的序列的3’端标记有生物素，5’端标记的有FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种。

3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA酶抑制剂。

4.如权利要求1‑3任一所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为胶体金检测试剂盒；所述胶体金检测试剂盒包括权利要求1‑3任一所述的检测试剂以及胶体金载体，所述胶体金载体包括底板，粘合在所述底板上且依次搭接的样品垫、结合垫、层析基质和吸水垫；所述结合垫上涂有单克隆抗体包被的胶体金复合物；所述层析基质上靠近结合垫的一侧设有质控线，靠近吸水垫的一侧设有检测线；所述质控线上涂有链霉亲和素；所述检测线上涂有捕获抗体。

5.如权利要求1‑3任一所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为荧光检测试剂盒。

6.权利要求1所述的检测试剂盒在用于检测新型冠状病毒的非疾病诊断和治疗目的上的用途。

说明书

一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒。

背景技术

[0002] 目前病毒的检测方法主要包括病毒分离法、免疫学方法和分子诊断法。病毒分离法耗时长、不能大规模应用于临床快速、准确的检测；免疫学方法 (ELISA、抗原抗体检测
等)可以快速检出，但灵敏度不足，多在患病后才能检出，比较滞后，不利于筛查，也无法确
诊；现代分子生物学诊断方法特异性好、灵敏度高，目前市面上大多采用RT‑PCR方法的检测
试剂盒。新型冠状病毒作为一种新发现的病毒，适逢春运，人流高峰，传播速度快，常规的病
毒分离法、免疫学方法特异性抗体耗时的制备周期，使其无法满足临床面对众多疑似患者
的检测需求。因此，急需一种快速，有效，便携，不受场地限制，操作简便，易于基层推广的病
毒学检测方法。这样才能快速定位，精准管控，防止病毒的进一步扩散。此外，对于一线医护
人员来说，在医护工作过程中出现可疑职业暴露，也可进行及时筛查，早期干预，保护医疗
人员的战斗力和弥足珍贵的医疗资源。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，特异性强，灵敏度高，最低检测极限达到10拷贝/uL。

[0004] 本发明是这样实现的：

[0005] 本发明的目的之一在于提供一种用于检测新型冠状病毒的crDNA，所述 crDNA包括：

[0006] 靶向E gene的crDNA：其序列如SEQ ID NO.3‑5中任一所示；

[0007] 靶向N gene的crDNA：其序列如SEQ ID NO.6‑8中任一所示。

[0008] 本发明的目的之二在于提供一种用于检测新型冠状病毒的crRNA，所述 crRNA包括：

[0009] 靶向E gene的crRNA：其序列如SEQ ID NO.9‑11中任一所示；

[0010] 靶向N gene的crRNA：其序列如SEQ ID NO.12‑14中任一所示。

[0011] 本发明的目的之三在于提供一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒，含有所述 crDNA或者crRNA。

[0012] 优选地，所述试剂盒还包括cpf1蛋白和荧光探针。

[0013] 所述荧光探针选自如下探针中的一个：

[0014] 荧光探针1：其序列如SEQ ID NO.15所示；

[0015] 荧光探针2：其序列如SEQ ID NO.16所示；

[0016] 荧光探针3：其序列如SEQ ID NO.17所示；

[0017] 优选地，所述试剂盒还包括DNA酶抑制剂。

[0018] 所述新型冠状病毒核酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

[0019] S1、所需样本为病毒RNA，经RT等温扩增体系扩增得到所需DNA扩增产物；

[0020] S2、将所述的扩增产物、crRNA、cpf1蛋白、SEQ ID NO.26‑28任一所示的荧光探针和无酶水构成的检测体系进行检测。

[0021] 作为以上实施方式之一，所述试剂盒为液体试剂盒，将所述检测体系孵育后借助荧光检测仪或荧光分光光度计测定荧光值。具体地，将扩增产物、 cpf1/crRNA复合物溶液，
加入荧光探针和无酶水孵育后荧光检测仪测定荧光值。采用荧光检测机器时所述荧光探针
序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团；所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、
TRT、Cy3、Cy5、ROX、 JOE和Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、 
BHQ‑1、BHQ‑2和BHQ‑3中的一种。

[0022] 作为以上实施方式之一，所述检测试剂盒为胶体金检测试剂盒；所述胶体金检测试剂盒包括所述的检测试剂以及胶体金载体，所述胶体金载体包括底板，粘合在所述底板
上且依次搭接的样品垫、结合垫、层析基质和吸水垫；所述结合垫上涂有单克隆抗体包被的
胶体金复合物；所述层析基质上靠近结合垫的一侧设有质控线，靠近吸水垫的一侧设有检
测线；所述质控线上涂有链霉亲和素；所述检测控线上涂有捕获抗体。采用胶体金试剂盒检
测时，所述荧光探针的序列的5’端或3’端均标记有荧光基团，3’端或5’端标记有生物素。具
体地，本发明选用所述荧光探针的序列的3’端标记有生物素，5’端标记的有FAM、VIC、 HEX、
TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种。

[0023] 所述胶体金检测试剂盒使用时，将扩增产物、cpf1蛋白/crRNA复合物溶液，加入荧光探针和无酶水孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区。将所述检测体系滴加在所述试剂
盒中的样品垫上，并观察质控带、检测带；若在检测带上形成肉眼可见的有色线条，则判断
为阳性；否则为阴性。

[0024] 所述胶体金检测试剂盒将用于检测新型冠状病毒的crRNA组成的检测试剂(CRISPR/Cpf1检测体系)与RPA等温扩增合为一个步骤，并且以胶体金试纸条的形式呈现检
测结果，操作简便、时间短，无需仪器，等温反应即可，具有很强的适用范围和场所，实用性
极强。

[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

[0026] 本发明提供的用于检测新型冠状病毒的crRNA、试剂盒，设计与新型冠状病毒E gene和N gene相关的crRNA，运用此crRNA结合CRISPR‑cpf1系统进行检测的方法，此方法具
有成本低、可多次重复检测、方法简单、检测速度快、灵敏(最低检测极限达到10拷贝/uL)、
特异，可在短时间内通过荧光信号的变化检测到是否含有相应的目标核酸：

[0027] (1)在对新型冠状病毒E gene的检测中，反应进行到20‑30分钟时，阳性样本的荧光信号明显高于阴性样本。灵敏度可达到10拷贝/uL。

[0028] (2)在对新型冠状病毒N gene的检测中，反应进行到20‑30分钟时，阳性样本的荧光信号明显高于阴性样本。灵敏度可达到10拷贝/uL。

[0029] 本发明提供的用于检测新型冠状病毒的crRNA、试剂盒，可在短时间内通过显色反应检测到是否含有相应的目标核酸：

[0030] (1)在对新型冠状病毒E gene的检测中，加入检测体系3‑5min，即可通过检测线的有无区分阳性样本和阴性样本。灵敏度可达到10拷贝/uL。

[0031] (2)在对新型冠状病毒N gene的检测中，加入检测体系3‑5min，即可通过检测线的有无区分阳性样本和阴性样本。灵敏度可达到10拷贝/uL。

附图说明

[0032] 图1为本发明实施例2提供的液体检测试剂盒在新型冠状病毒E gene上的特异性检测结果；

[0033] 图2为本发明实施例2提供的液体检测试剂盒在新型冠状病毒N gene上的特异性检测结果；

[0034] 图3为本发明实施例2提供的液体检测试剂盒在新型冠状病毒E gene上的灵敏度检测结果；

[0035] 图4为本发明实施例2提供的液体检测试剂盒在新型冠状病毒N gene上的灵敏度检测结果；

[0036] 图5为本发明实施例3提供的胶体金检测试剂盒中检测试纸结构示意图；图中：1、底板；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、质控线；6、检测线；7、吸水垫；

[0037] 图6为本发明实施例3提供的胶体金检测试剂盒在新型冠状病毒E gene上的特异性检测结果；

[0038] 图7为本发明实施例3提供的胶体金检测试剂盒在新型冠状病毒N gene 上的特异性检测结果；

[0039] 图8为本发明实施例3提供的胶体金检测试剂盒在新型冠状病毒E gene上的灵敏度检测结果；

[0040] 图9为本发明实施例3提供的胶体金检测试剂盒在新型冠状病毒N gene上的灵敏度检测结果。

具体实施方式

[0041] 实施例1靶向病毒特异位点crRNA的设计及获得

[0042] 1、基于CRISPR‑cpf1系统的新型冠状病毒检测位点的发现

[0043] 我们根据CDC最新出具的《RT‑PCR检测指南》，获得新型冠状病毒特异性区域。针对这些不同区域设计crRNA并构建CRISPR/cpf1系统进行研究。结果表明，以SEQ ID NO.1‑2所
示区域序列为基于CRISPR/cpf1系统的检测区域，具有很好的检测效果。

[0044] 表1

[0045]

[0046]

[0047] 2、靶向特异性区域crRNA的设计

[0048] (1)靶向特异性区域crRNA设计原则

[0049] 由于CRISPR‑cpf1系统是一种新型的靶向DNA基因编辑系统，其中cpf1 与crRNA结合形成监测复合物，crRNA的向导区域用互补序列识别目标DNA，并且cpf1降解目标DNA链，
所述crRNA设计要求：crRNA包括蛋白锚定序列和向导序列，序列格式为：5`‑与cpf1蛋白结
合的锚定序列‑crRNA向导序列‑3`，蛋白锚定序列需要根据cpf1蛋白来确定，使其能够与选
定的cpf1蛋白匹配并结合；向导序列则与靶向DNA中的片段匹配。crRNA向导序列不能离起
始密码子(ATG)太近；长度为22‑24个核苷酸。

[0050] 2、crDNA序列的选择

[0051] 所述与cpf1蛋白结合的锚定序列TAATTTCTACTCTTGTAGAT；所述crRNA 向导序列根据SEQ ID NO.1‑2所示序列中突变位点区域设计；最后得到了如下所示的2个区域的crDNA
片段。靶向E gene的crDNA：其序列如SEQ ID NO.3‑5 中任一所示；靶向N gene的crDNA：其
序列如SEQ ID NO.6‑8中任一所示。

[0052] 表2

[0053]

[0054]

[0055] 3、crRNA的获得

[0056] 将所得的2个区域的crDNA片段分别在T7 RNA聚合酶(转录反应体系如表3所示)作用下生成RNA，回收纯化得到crRNA。

[0057] 表3

[0058]

[0059] 所得crRNA包括：靶向E gene的crRNA：其序列如SEQ ID NO.9‑11中任一所示；靶向N gene的crRNA：其序列如SEQ ID NO.12‑14中任一所示。

[0060] 表4

[0061]

[0062]

[0063] 实施例2新型冠状病毒荧光测试剂盒及检测方法

[0064] 1、试剂盒的组成

[0065] (A)2条crRNA(靶向E gene的crRNA：其序列如SEQ ID NO.9‑11中任一所示；靶向N gene的crRNA：其序列如SEQ ID NO.12‑14中任一所示)或者 2条crDNA(靶向E gene的
crDNA：其序列如SEQ ID NO.3‑5中任一所示；靶向N gene的crDNA：其序列如SEQ ID NO.6‑8
中任一所示。当试剂盒中为crDNA 时需要操作者先将crDNA片段分别在T7 RNA聚合酶作用
下生成RNA，回收纯化得到crRNA)；

[0066] (B)一条特异性荧光探针(序列见表3，如SEQ ID NO.15‑17所示的任意一种探针，所述荧光探针的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团；所述荧光基团包
括FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和 Texas Red中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、
DABCYL、MGB、BHQ‑1、 BHQ‑2和BHQ‑3中的一种)；

[0067] 表5

[0068]荧光探针 序列(5’‑3’)
探针1 HEX‑(CH2)6‑CTCACTACAGACGCACGCTA‑BHQ1(如SEQ ID NO.15所示)
探针2 HEX‑CTCACTACAGACGCACGCTA‑BHQ1(如SEQ ID NO.16所示)
探针3 HEX‑CACATCAGCAGCCTACAGCA‑BHQ1(如SEQ ID NO.17所示)

[0069] (C)cpf1蛋白、无酶水、DNA酶抑制剂；

[0070] 优选地，所述试剂盒还可包括：

[0071] (D)扩增体系：包括等温扩增引物对，其中E gene的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.18‑20所示；N gene的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.21‑23 所示；所述扩增体系还
包括逆转录酶(单链变双链)，重组酶，DNA聚合酶， ssDNA结合蛋白等。所述扩增体系的RPA
引物由本发明人设计，并于生工公司合成得到；扩增体系所需的其他组分采用购买逆转录
等温扩增试剂盒 Basic；TABAS03KIT。为了先将病毒RNA逆转录后再RPA等温扩
增，所述扩增体系还包括RT逆转录酶。

[0072] 表6

[0073]引物 序列(5’‑3’)
F1‑E CGACTACTAGCGTGCCTTTGTAAGCACAAGC(SEQ ID NO.18)
R1‑E ATATTTAGTTCGTTTAGACCAGAAGATCAGG(如SEQ ID NO.19所示)
R2‑E AGTTCGTTTAGACCAGAAGATCAGGAACTCT(如SEQ ID NO.20所示)
F1‑N CGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATC(如SEQ ID NO.21所示)
R1‑N GCCTCAGCAGCAGATTTCTTAGTGACAGTTT(如SEQ ID NO.22所示)
R2‑N CCTCAGCAGCAGATTTCTTAGTGACAGTTTGG(如SEQ ID NO.23所示)

[0074] 2、新型冠状病毒的检测方法

[0075] 采用现有的技术或者产品对样本中的病毒核酸进行提取，作为样本的 RNA。

[0076] (1)取50‑100ng待样本的RNA，加入逆转录等温扩增体系中。扩增体系如表7所示；

[0077] 表7

[0078]

[0079]

[0080] (2)将所述得到的扩增产物、与所述检测试剂：crRNA、cpf1蛋白、荧光探针和无酶水一起制成检测体系，如表8所示。

[0081] 表8

[0082]

[0083] (3)将所述检测体系孵育后荧光检测仪测定荧光值。反应结束后统计分析荧光值变化情况。与空白对照组相比，待检测样本的随着时间的延长荧光值不断增加，表明存在新
冠病毒。

[0084] 实施例3新型冠状病毒的胶体金检测试剂盒及检测方法

[0085] 1、试剂盒的组成

[0086] (1)检测试剂同实施例2，不同的是本实施例中的特异性荧光探针如SEQ ID NO.15‑17所示的任意一种探针，所述序列的3’端标记有生物素，5’端标记的有FAM、VIC、
HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的一种；本实施例中5’端标记的为FAM。

[0087] (2)所述检测试剂盒制备成胶体金检测试剂盒时，如图5所示，所述胶体金检测试剂盒包括底板1，粘合在底板1上且依次搭接的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫
7；所述硝酸纤维膜4上靠近结合垫3的一侧设有质控线5，硝酸纤维膜4上靠近吸水垫7的一
侧设有检测线6；所述结合垫3上涂有cy5单克隆抗体包被的胶体金；所述质控线5上涂有链
霉亲和素；所述检测控线6上涂有鼠抗。所述底板1为PVC板；样品垫为硝酸纤维素膜；结合垫
的材料为玻璃纤维素膜；所述吸水垫7为吸水滤纸。所述检测试纸由硬质塑料卡包装。

[0088] 2、胶体金检测试剂盒的制备方法

[0089] (1)制作颗粒大小合适的胶体金溶液

[0090] (2)用兔抗Cy5单克隆抗体包被胶体金，得到包被后的胶体金溶液；

[0091] (3)将包被后的胶体金溶液喷于结合垫上，烘干备用；

[0092] (4)在硝酸纤维膜上检测线位置喷鼠抗溶液；在质控线位置喷链霉亲和素溶液，烘干备用；

[0093] (5)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接并粘合于底板上，切成检测试纸条，将检测试纸条用硬质塑料卡包装。

[0094] 优选地，所述胶体金直径为13‑40nm。胶体金合成的影响因素诸多，每次合成尽量保证操作一致，以减少合成的胶体金批间差异。另外对每次合成的胶体金进行颜色和全光
谱扫描比较，可以大致判断合成胶体金纳米颗粒大小。配制1％(m/v)的氯金酸于棕色试剂
瓶密封保存4冰箱备用；取1mL 1％(m/v) 的氯金酸溶液与99mL的超纯水中，于棕色100mL的
容量瓶定容混匀。加入到预热干燥的250mL锥形瓶中，加热至沸腾并煮沸15min；快速加入还
原剂 1％(m/v)柠檬酸钠2.75mL。加入还原剂的过程要迅速，连续。持续加热沸腾 5min左
右，冷却至室温。该过程中溶液先变成灰色，后迅速变为黑色，3min 左右变为酒红色，为减
少蒸发，当溶液变为稳定的酒红色，沸腾5min停止加热。

[0095] 优选地，所述用FAM单克隆抗体包被胶体金。取20mL配制好的胶体金溶液于50mL锥形瓶中，一般调节胶体金最高吸收值在0.4‑0.6左右；加入480 μL 2％的K2CO3调pH，加入
1.2mL稀释至1mg/mL的SPA室温下连续搅拌 30min(标记抗体时先加入960μL 2％的K2CO3调
pH，加入鼠抗cy5抗体1.8 mL)；逐滴加入配制好的10％(m/v)的BSA 1.6mL，室温下连续搅拌
30min；逐滴加入配制好的10％(m/v)的PEG‑4 000 1.6mL，室温下连续搅拌30min；分装、离
心，12 000r/min 4℃离心30min，小心移取上清，用10mmol/L pH 8.0的Tris‑Base缓冲溶液
洗涤两次，将未标记的蛋白洗涤掉；最后一次1 000 r/min低速离心30min，去掉大的聚沉的
胶体金颗粒，之后用2mL的10mmol/L pH 8.0的Tris‑Base缓冲溶液重悬并置于4℃冰箱保
存，如果要长期保存可以加入0.05％叠氮化钠和1％BSA作为保护稳定剂。对标记后免疫胶
体金测吸收光谱，判断免疫胶体金的质量。

[0096] 优选地，所述免疫胶体金结合垫选用吸附能力为54μL/cm2的玻璃纤维膜，经0.01mol/L pH 8.0的含1％BSA的TBST处理半个小时，活化材料表面使胶体金更容易释放，
在37℃培养箱烘干后，将处理好的玻璃纤维膜裁成0.5cm×6 cm大小，每条用200μL移液器
吸取150μL免疫标记胶体金均匀涂抹，置于 37℃，湿度约40％的培养箱2h烘干。烘干后如不
立即组装试纸条，需置于装有干燥剂的铝箔袋中密封保存。

[0097] 优选地，所述硝酸纤维素膜是免疫胶体金层析试纸条中的重要材料，主要影响因素包括流速和蛋白质结合力，其中最为关键的是流速的选择。本实验选用爬速为50‑225s的
规格为2.5cm×50m Pall vivid 170，是最为常用的硝酸纤维素膜，其孔径为8μm，喷膜量为
0.6μL‑0.8μL。因此T线(链霉亲和素)和C 线(鼠抗)喷膜量定为0.8μL，T线处链霉亲和素浓
度设定为2mg/mL，C线处鼠抗浓度设定为2mg/mL。喷膜后置于37℃干燥30min，置于洁净的封
口袋中加入干燥剂后密封，室温保存备用。

[0098] 优选地，为使样品更易释放并减少免疫反应的非特异性吸附，样品垫经0.01 mol/L pH 8.0的含1％BSA的TBST处理半个小时，在37℃培养箱烘干并裁成 2.1cm×30cm的长
条，置于洁净的密封袋中。吸水垫裁成1.6cm×30cm的长条，置于洁净的密封袋中。

[0099] 3、试剂盒的使用方法

[0100] 同实施例2制备得到检测体系，将所述检测体系混匀在37℃孵育30～ 90min，同时设立阴性对照组。将所述检测体系孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区进行检测；判定
规则为：

[0101] A、当检测区显色，且质控区也显色，则待测样品检测结果为阳性；

[0102] B、当检测区不显色，且质控区显色，则待测样品检测结果为阴性；

[0103] C、当质控区不显色，则试纸条无效，需要用新的试纸条重新测定。

[0104] 具体地，所述胶体检测试剂盒的检测的原理为：如图5所示，将待测标本加入到点样孔，待测标本在毛细作用下沿着样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜向吸水滤纸端方向层析；
检测时，如果待测标本中的含有检测物新型冠状病毒，结合垫上的金标抗体复溶，复溶后的
混合物继续层析到硝酸纤维素膜上，生物素被质控线上的链霉亲和素捕获，这样检测线位
置出现标记胶体金的红色，标记金颗粒和FAM继续向前，到达检测线线区域时，与其上包被
的捕获抗体发生结合，显现出胶体金的红色线条，此为检测线；检测时，如果待测物中不含
新型冠状病毒，样品先与结合垫上的金标抗体结合并使之复溶，复溶后的混合物继续层析
到硝酸纤维素膜上，被质控线上的链霉亲和素捕获，生物素‑FAM 报告探针同时被截留，标
记金颗粒继续向前，到达检测线区域时，无法与其上包被的捕获抗体发生结合，无法显现出
胶体金的红色线条，此为检测线。

[0105] 试验例1实施例2的新型冠状病毒的荧光检测试剂盒的性能

[0106] 一、crRNA的特异性检测

[0107] 制备携带新型冠状病毒E gene和N gene序列质粒，分别利用上述靶向2 个区域的crRNA检测其特异性。将实施例2制备得到的crRNA分别在 CRISPR‑cpf1体系进行体外切割
有效性验证。

[0108] 用1‑2.5uM纯化的cpf1，2.5‑5uM crRNA，1‑5μl合成的荧光探针，2μL DNA 酶抑制剂，不同稀释浓度的目的质粒DNA，在检测缓冲液(NEBuffer 3)中37℃孵育1～2小时。同时
以空转质粒设立阴性对照。几组反应混合物同时在便携式检测仪中反应(温度设置为37℃，
动力学检测每10min检测一次共1个小时)。使用荧光定量PCR仪检测体系的荧光信号变化。

[0109] (1)E gene的特异性检测

[0110] 我们检测了靶向E gene的crRNA对目标质粒、空转质粒的检测效果，图 1为荧光值结果。结果显示，加入目标质粒、空转质粒的模板后，空转质粒没有明显的变化趋势，目标质
粒随着时间的延长荧光值不断增加。

[0111] 2、N gene的特异性检测

[0112] 我们检测了靶向N gene的crRNA对目标质粒、空转质粒的检测效果，图 2为荧光值结果。结果显示，加入目标质粒、空转质粒的模板后，空转质粒没有明显的变化趋势，目标质
粒随着时间的延长荧光值不断增加。

[0113] 综上可知，结果均显示靶标crRNA检测靶标DNA的体系荧光值变化趋势明显高于阴性对照。表明本发明的用于检测新型冠状病毒的2个crRNA可以分别特异性地检测出对应的
特异性区域。

[0114] 二、crRNA的灵敏性试验

[0115] 为了确定本方法的最小检出量，将合成的质粒标准品稀释成105、103、102、 101拷贝/μL等4个浓度梯度后作为模板进行检测。结果如图3，4所示。由结果可知，本发明具有较
广的检测范围，其最低检测限为10拷贝/μL。

[0116] 试验例2实施例3的新型冠状病毒的胶体金检测试剂盒的性能

[0117] 一、特异性检测

[0118] 制备携带新型冠状病毒Egene和Ngene序列质粒，分别利用上述靶向2个区域的crRNA检测其特异性。将实施例3制备得到的crRNA分别在 CRISPR‑cpf1体系进行体外切割
有效性验证。

[0119] 用1‑2.5uM纯化的cpf1，2.5‑5uM crRNA，1‑5μl合成的荧光探针，2μL DNA 酶抑制剂，不同稀释浓度的目的质粒DNA，在检测缓冲液(NEBuffer 3)中37℃孵育1～3小时。同时
以空转质粒设立阴性对照及空白对照。空白对照组为每个实验组相对应的没有加crRNA及
没有加cpf1的信号组。几组反应混合物同时在胶体金试纸条中分别检测。

[0120] 1、E gene的特异性检测

[0121] 我们检测了靶向E gene的crRNA对目标质粒、空转质粒的检测效果，图 6为胶体金结果。结果显示，空白对照在检测线位置没有条带；加入目标质粒后，检测线位置显示条带。

[0122] 2、N gene的特异性检测

[0123] 我们检测了靶向N gene的crRNA对目标质粒、空转质粒的检测效果，图 7为胶体金结果。结果显示，空白对照在检测线位置没有条带；加入目标质粒后，检测线位置显示条带。

[0124] 综上可知，结果均显示靶标crRNA检测靶标DNA的体系有条带显示。表明本发明的用于检测新型冠状病毒的2个crRNA可以分别特异性地检测出对应的特异性区域。

[0125] 二、灵敏性试验

[0126] 为了确定本方法的最小检出量，将合成的质粒标准品稀释成107、106、105、 104、3 2 1
10、10、10 拷贝/μL等7个浓度梯度后作为模板进行检测。结果如图8 和图9所示。由图8和
1
图9结果可知，本发明具有较广的检测范围，其最低检测限为10拷贝/μL。

[0127] 所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护。