一种龙眼核多酚-南瓜籽多肽组合物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物及其制备方法，包括，龙眼核多酚提取物和南瓜籽多肽，其中，所述龙眼核多酚在组合物中的浓度为0～10ug/mL，所述南瓜籽多肽在组合物中的浓度为0.2～1.0mg/mL。本发明中制备的龙眼核多酚与一定浓度的南瓜籽多肽复配可以降低龙眼核多酚毒性，同时，本发明中制备的龙眼核多酚与南瓜籽多肽复配赋予其可以降低细胞内黑色素含量的新功能。

权利要求

1.一种龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的制备方法，其特征在于：包括，将龙眼核多酚LEP粉末溶解于二甲基亚砜中配制为LEP高浓度溶液，浓度大于或等于10 μ g /mL；

将南瓜籽多肽PSP粉末溶解于去离子水中，配制为PSP溶液，浓度大于或等于1.0 mg/mL；

将LEP高浓度溶液与PSP溶液充分混合，制得龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物，组合物中龙眼核多酚浓度为6 8 μ g /mL，南瓜籽多肽浓度达到0.4 0.8 mg/mL，组合物中二甲基亚~ ~

砜与去离子水均匀分布；其中，

所述龙眼核多酚，其制备方法为，将洗净的龙眼核在45±5ºC条件下干燥24 h，将龙眼核粉碎并过60目筛，得龙眼核粉；料液比以g/mL计1:4加入石油醚，40℃温度下搅拌3 4 h，~

去除石油醚后，料液比以g/mL计为1：25加入体积分数为60%乙醇，70℃温度下超声处理60~

80min后，过滤，得龙眼核多酚提取液，提取液中龙眼核多酚含量为53.68  54.78mg/g；将龙~

眼核多酚提取液减压浓缩，用乙酸乙酯萃取，萃取三次，合并三次萃取液后减压浓缩，冷冻干燥得到乙酸乙酯相多酚粉末，即为所述龙眼核多酚LEP；其中，龙眼核多酚提取液的体积为200 500 mL，减压浓缩至50 mL，乙酸乙酯与减压浓缩后的龙眼核多酚提取液得体积比为~

4:1；

所述南瓜籽多肽，其制备方法为，将南瓜籽经高速粉碎机粉碎，过60目筛；料液比以g/mL计1:4加入石油醚，在40℃下搅拌4 h，抽滤，重复3次，合并滤液，于通风橱中除去残留石油醚，得脱脂南瓜籽；将脱脂南瓜籽以料液比1:30 g/mL加入至去离子水中，调节pH至9.5，在35℃下反应180 min，在1000 10000 r/min 条件下离心5 min后，收集上清液，调节pH至~

4.3后，5000 r/min离心10 min，收集沉淀，水洗至中性，冷冻干燥得南瓜籽蛋白；取南瓜籽蛋白以料液比1:5 1:40 g/mL加入至去离子水中形成南瓜籽蛋白质分散液，调节南瓜籽蛋~

白质分散液温度及pH至50℃、9.0，以酶底比2.5%加入碱性蛋白酶，酶解2 h后于沸水中灭活，调节反应液温度及pH至37℃、7.5，再以酶底比2.5%加入胰蛋白酶，酶解2 h后灭活，酶解期间滴加0.5 mol/L NaOH溶液维持溶液pH值不变；酶解结束，混合液冷却至室温，加入1 mol/L HCl调节pH至等电点4.3，离心5000 r/min 10 min收集上清液，冷冻干燥得多肽；将南瓜籽多肽配制成10 mg/mL溶液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，调节超滤压力为

0.1 0.2 MPa，常温超滤5次后，再收集通过1000 Da超滤膜的多肽溶液，冷冻干燥得多肽，简~

称为PSP。

2.如权利要求1所述龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的制备方法，其特征在于：所述超声处理，超声功率为100W，频率为40 Hz。

3.如权利要求1所述龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥，其中，冷阱温度‑30 ‑50℃，压力10 50Pa，时间3 5天。

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说明书

一种龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及到一种龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 目前关于南瓜籽多肽的制备多采用单酶酶解法，性能研究集中在抗氧化上，但是其性能较差，且评价方法为化学方法，无法评价其生物利用度以及对人体皮肤细胞的作用。

[0003] 龙眼核中多酚的提取多采用乙醇萃取，但是此类方法制备的多酚含量过低，多酚具有优越的抗氧化性能，从龙眼核中提取的多酚也不例外。但是多酚在较高浓度时毒性较
大，对人体产生一定的不良影响，限制其利用。

[0004] 因此，如何提高提取物中多酚含量、在保证其功效的同时降低其毒性是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

[0005] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部
分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

[0006] 鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

[0007] 因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物。

[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物，包括，龙眼核多酚提取物、南瓜籽多肽和溶剂，其中，所述龙眼核多酚在组合物中的
浓度为0～10ug/mL，所述南瓜籽多肽在组合物中的浓度为0.2～1.0mg/mL，所述溶剂为二甲
基亚砜和去离子水。

[0009] 作为本发明所述龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的一种优选方案，其中：所述龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物，龙眼核多酚在组合物中的浓度为6～8ug/mL，南瓜籽多肽在组
合物中的浓度为0.4～0.8mg/mL

[0010] 作为本发明所述龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的一种优选方案，其中：所述龙眼核多酚，其制备方法包括，将洗净的龙眼核在45±5℃条件下干燥24h，将龙眼核粉碎并过60
目筛，得龙眼核粉；将龙眼核粉中加入石油醚，40℃温度下搅拌3～4h，去除石油醚后加入乙
醇，70℃温度下超声处理60～80min后，过滤，得龙眼核多酚提取液，提取液中龙眼核多酚含
量为53.68～54.78mg/g；将龙眼核多酚提取液减压浓缩，用乙酸乙酯萃取，萃取三次，合并
三次萃取液后减压浓缩，冷冻干燥得到乙酸乙酯相多酚粉末，即为所述龙眼核多酚LEP。

[0011] 作为本发明所述龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的一种优选方案，其中：所述将龙眼核粉中加入石油醚，其中，料液比以g/mL计为1:4。

[0012] 作为本发明所述龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的一种优选方案，其中：所述去除石油醚后加入乙醇，其中，乙醇体积分数为60％，料液比以g/mL计为1：25。

[0013] 作为本发明所述龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的一种优选方案，其中：所述超声处理，超声功率为100W，频率为40Hz。

[0014] 作为本发明所述龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的一种优选方案，其中：所述将龙眼核多酚提取液减压浓缩，用乙酸乙酯萃取，其中，龙眼核多酚提取液的体积为200～
500mL，减压浓缩至50mL，乙酸乙酯与减压浓缩后的龙眼核多酚提取液得体积比为4:1。

[0015] 作为本发明所述龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的一种优选方案，其中：所述冷冻干燥，其中，冷阱温度‑30～50℃，压力10～50Pa，时间3～5天。

[0016] 作为本发明所述龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的一种优选方案，其中：所述所述南瓜籽多肽，其制备方法包括，将南瓜籽经高速粉碎机粉碎，过60目筛；

[0017] 料液比以g/mL计1:4加入石油醚，在40℃下搅拌4h，抽滤，重复3次，合并滤液，于通风橱中除去残留石油醚，得脱脂南瓜籽；将脱脂南瓜籽以料液比1:30g/mL加入至去离子水
中，调节pH至9.5，在35℃下反应180min，在1000～10000r/min条件下离心5min后，收集上清
液，调节pH至4.3后，5000r/min离心10min，收集沉淀，水洗至中性，冷冻干燥得南瓜籽蛋白；
取南瓜籽蛋白以料液比1:5～1:40g/mL加入至去离子水中形成南瓜籽蛋白质分散液，调节
南瓜籽蛋白质分散液温度及pH至50℃、9.0，以酶底比2.5％加入碱性蛋白酶，酶解2h后于沸
水中灭活，调节反应液温度及pH至37℃、7.5，再以酶底比2.5％加入胰蛋白酶，酶解2h后灭
活，酶解期间滴加0.5mol/L NaOH溶液维持溶液pH值不变；酶解结束，混合液冷却至室温，加
入1mol/L HCl调节pH至等电点4.3，离心5000r/min 10min收集上清液，冷冻干燥得多肽；将
南瓜籽多肽配制成10mg/mL溶液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，调节超滤压力为
0.1～0.2MPa，常温超滤5次后，再收集通过1000Da超滤膜的多肽溶液，冷冻干燥得多肽，简
称为PSP。

[0018] 本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的制备方法。

[0019] 为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的制备方法，所述制备方法包括，将龙眼核多酚LEP粉末溶解于二甲基亚砜中配制为
LEP高浓度溶液，浓度大于或等于10ug/mL；将南瓜籽多肽PSP粉末溶解于去离子水中，配制
为PSP溶液，浓度大于或等于1.0mg/mL；将LEP高浓度溶液与PSP溶液充分混合，制得龙眼核
多酚‑南瓜籽多肽组合物，其中，组合物中龙眼核多酚浓度达为0～10ug/mL，南瓜籽多肽浓
度达到0.2～1.0mg/mL，组合物中二甲基亚砜与去离子水均匀分布。

[0020] 本发明有益效果：

[0021] (1)本发明提供一种龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物，采用乙酸乙酯萃取龙眼核提取物，其多酚含量得到显著提高，且其抗氧化性能也得到提高；制备的龙眼核多酚与南瓜籽
多肽复配可以显著提高抗氧化性能，有协同增效效果。

[0022] (2)本发明中制备的龙眼核多酚与一定浓度的南瓜籽多肽复配可以降低龙眼核多酚毒性，同时，本发明中制备的龙眼核多酚与南瓜籽多肽复配赋予其可以降低细胞内黑色
素含量的新功能，达到以上效果的要求为：龙眼核多酚与南瓜籽多肽复配后的龙眼核多酚‑
南瓜籽多肽组合物中龙眼核多酚的最终浓度为0～10ug/mL；南瓜籽多肽的最终浓度为0.2
～1.0mg/mL。

附图说明

[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本
领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它
的附图。其中：

[0024] 图1为本发明实施例中龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物中龙眼核多酚浓度大于10ug/mL细胞毒性对比图。

[0025] 图2为本发明实施例中龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物中南瓜籽多肽的浓度大于1.0mg/mL细胞毒性对比图。

具体实施方式

[0026] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

[0027] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的
情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

[0028] 其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指
同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

[0029] 本发明细胞毒性测定：

[0030] 采用MTT法考察样品对人皮肤成纤维细胞的细胞活性。取处于对数生长期的HSF细3
胞，以20×10 个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μL(空白组除外)，培养箱中孵育24h
后，移除孔中培养液。以DMEM为溶液分别样品溶液，每孔加入100μL样品溶液孵育24h，以100
μL DMEM代替样品作为对照组。移除孔中溶液，使用PBS冲洗2次，每孔加入100μL 0.5mg/mL 
MTT溶液，并向不含细胞的孔中加入100μL 0.5mg/mL MTT溶液作为空白组，置于培养箱中孵
育4h。孵育结束后每孔中加入100μL DMSO，充分震荡5min，使用酶标仪测定其在490nm处的
吸光值OD，按式1计算细胞活力。

[0031] 细胞活力＝(OD样品‑OD空白)/(OD对照‑OD空白)×100％(1)

[0032] 本发明抗氧化性能测定：分别测定南瓜籽多肽、龙眼核多酚、两者复配时的DPPH·、OH·、O2·清除率，以考察多肽抗氧化性能。

[0033] 本发明美白活性：

[0034] 测定黑色素细胞内黑色素含量考察复配后美白活性。取处于对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞，以20×103个/孔的密度接种于6孔板中，每孔2mL(空白组除外)，培养箱中孵育
24h后，移除孔中培养液。以DMEM为溶液分别配制一定浓度的样品溶液，每孔加入2mL样品溶
液孵育24h，以100μL DMEM代替样品作为对照组。移除孔中溶液，使用PBS冲洗2次，收集细
胞。加入1mL 10％DMSO(使用NaOH配制)，充分震荡后封口放置30min，于470nm处检测吸光度
值，以吸光度表示黑色素含量。

[0035] 本发明中碱性蛋白酶：北京索莱宝科技有限公司，货号B8360，酶活≥200000U/g；本发明中胰蛋白酶：北京索莱宝科技有限公司，货号T8150，酶活250.N.F.U/mg；其他原料，
无特殊说明，均为普通市售。

[0036] 实施例1

[0037] 本实施例一种龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物及其制备方法，包括：

[0038] (1)将洗净的龙眼核在45±5℃条件下干燥24h，用高速粉碎机将龙眼核粉碎并过60目筛；按料液比1:4(g/mL)加入石油醚，于40℃下搅拌4h，去除石油醚，加入乙醇超声处理
60min，乙醇体积分数60％，料液比1/25(g/mL)，温度70℃，超声功率为100W，频率为40Hz，超
声处理后过滤，得龙眼核多酚提取液，提取液中龙眼核多酚含量为53.68mg/g；

[0039] 取龙眼核多酚提取液500mL，减压浓缩至50mL后，用200mL的乙酸乙酯萃取，溶剂萃取三次，合并三次萃取液后减压浓缩，冷冻干燥(冷阱温度‑30～50℃，压力10～50Pa，时间3
～5天)得到乙酸乙酯相多酚粉末，简称为LEP。

[0040] (2)将南瓜籽经高速粉碎机粉碎，过60目筛；

[0041] 料液比以g/mL计1:4加入石油醚，在40℃下搅拌4h，抽滤，重复3次，合并滤液，于通风橱中除去残留石油醚，得脱脂南瓜籽；

[0042] 将脱脂南瓜籽以料液比1:30g/mL加入至去离子水中，调节pH至9.5，在35℃下反应180min，在10000r/min条件下离心5min后，收集上清液，调节pH至4.3后，5000r/min离心
10min，收集沉淀，水洗至中性，冷冻干燥得南瓜籽蛋白；

[0043] 取南瓜籽蛋白以料液比1:40g/mL加入至去离子水中形成南瓜籽蛋白质分散液，调节南瓜籽蛋白质分散液温度及pH至50℃、9.0，以酶底比2.5％加入碱性蛋白酶，酶解2h后于
沸水中灭活，调节反应液温度及pH至37℃、7.5，再以酶底比2.5％加入胰蛋白酶，酶解2h后
灭活，酶解期间滴加0.5mol/L NaOH溶液维持溶液pH值不变；

[0044] 酶解结束，混合液冷却至室温，加入1mol/L HCl调节pH至等电点4.3，离心5000r/min 10min收集上清液，冷冻干燥得多肽；

[0045] 将南瓜籽多肽配制成10mg/mL溶液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，调节超滤压力为0.2MPa，常温超滤5次后，再收集通过1000Da超滤膜的多肽溶液，冷冻干燥得多肽，
简称为PSP。

[0046] (3)龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物的制备方法：

[0047] 将龙眼核多酚LEP粉末溶解于二甲基亚砜中配制为LEP高浓度溶液，浓度大于或等于10ug/mL；

[0048] 将南瓜籽多肽PSP粉末溶解于去离子水中，配制为PSP溶液，浓度大于或等于1.0mg/mL；

[0049] 将LEP高浓度溶液与PSP溶液充分混合，制得龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物，其中，组合物中龙眼核多酚浓度达为0～10ug/mL，南瓜籽多肽浓度达到0.2～1.0mg/mL，组合
物中二甲基亚砜与去离子水均匀分布，以上浓度均为龙眼核多酚、南瓜籽多肽在组合物中
的终浓度。

[0050] 众多文献中表明，细胞活力大于90.00％为无毒性。

[0051] 龙眼核多酚以及与南瓜籽多肽复配后细胞毒性如表1所示。

[0052] 表1

[0053]

[0054] 表中PSP、LEP浓度均为组合物中的最终浓度。从表1中可以看出，当龙眼核多酚的浓度范围在0‑10ug/mL作用于细胞24h后，细胞活力均小于80％，表明在此浓度范围内具有
一定的细胞毒性。但是，当龙眼核多酚与南瓜籽多肽以不同的比例复配时，该组合的细胞活
力相比于单独龙眼核多酚的细胞活力显著提高。因此，龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物中龙
眼核多酚的浓度范围为：0‑10ug/mL、南瓜籽多肽的浓度范围为：0.2‑1.0mg/mL可以有效提
高细胞活力、降低龙眼核多酚的细胞毒性。以0.2mg/mL南瓜籽多肽与6ug/mL龙眼核多酚为
例，6ug/mL龙眼核多酚单独作用于细胞时细胞活力为68.40％，但是当二者以组合物的形式
存在，二者在组合物中的最终浓度仍分别为0.2mg/mL、6ug/mL，细胞活力达到70.41％，相比
于单独龙眼核多酚，组合物的细胞活力得到提高，降低了细胞毒性。

[0055] 龙眼核多酚以及与南瓜籽多肽复配后抗氧化性能如表2所示。表中各组合物的配制方法为：将一定质量的龙眼核多酚LEP粉末使用二甲基亚砜配制为LEP高浓度溶液，浓度
大于或等于10ug/mL；将一定质量的南瓜籽多肽PSP粉末使用去离子水配制为PSP溶液，浓度
大于或等于1.0mg/mL；将LEP高浓度溶液与PSP溶液充分混合，制得龙眼核多酚‑南瓜籽多肽
组合物，保持组合物中龙眼核多酚浓度达为0～10ug/mL，南瓜籽多肽浓度达到0.2～1.0mg/
mL，组合物中二甲基亚砜与去离子水均匀分布。

[0056] 表2

[0057]

[0058] 表中PSP、LEP浓度均为组合物中的最终浓度。从表2中可以看出，当龙眼核多酚的浓度分别为6、8、10ug/mL时，自由基清除率分别为21.24％、35.01％、49.91％。当南瓜籽多
肽的浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL时，自由基清除率分别为5.42％、7.21％、
10.54％、15.74％、20.83％。但是，当龙眼核多酚与南瓜籽多肽以不同的比例复配时，该组
合的自由基清除能力相比于单独龙眼核多酚或者南瓜籽多肽的自由基清除能力显著提高。
以0.2mg/mL南瓜籽多肽与6ug/mL龙眼核多酚为例，单独使用时自由基清除率分别为
5.42％、21.24％，但是当二者以组合物的形式存在，二者在组合物中的最终浓度仍分别为
0.2mg/mL、6ug/mL，自由基清除率达到38.39％，并不是二者自由基清除率的加和，远远大
于，因此具有协同增效的效果。从表2中可以看出，龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物中龙眼核
多酚的浓度范围为：0‑10ug/mL、南瓜籽多肽的浓度范围为：0.2‑1.0mg/mL可以有效提高抗
氧化性能，具有一定的协同增效的作用。

[0059] 龙眼核多酚以及与南瓜籽多肽复配后美白活性如表3所示。表中各组合物的配制方法为：将一定质量的龙眼核多酚LEP粉末使用二甲基亚砜配制为LEP高浓度溶液，浓度大
于或等于10ug/mL；将一定质量的南瓜籽多肽PSP粉末使用去离子水配制为PSP溶液，浓度大
于或等于1.0mg/mL；将LEP高浓度溶液与PSP溶液充分混合，制得龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组
合物，保持组合物中龙眼核多酚浓度达为0～10ug/mL，南瓜籽多肽浓度达到0.2～1.0mg/
mL，组合物中二甲基亚砜与去离子水均匀分布。

[0060] 表3

[0061]

[0062] 表中PSP、LEP浓度均为组合物中的最终浓度。从表3中可以看出，当龙眼核多酚的浓度分别为6、8、10ug/mL时，黑色素含量相比于对照组分别为121.83％、124.21％、
126.84％，说明龙眼核多酚不具备降低细胞内黑色素含量的活性。当南瓜籽多肽的浓度分
别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL时，黑色素含量相比于对照组分别为110.32％、114.65％、
115.21％、117.65％、119.02％，说明南瓜籽多肽不具备降低细胞内黑色素含量的活性。但
是，当龙眼核多酚与南瓜籽多肽以不同的比例复配时，该组合物的黑色素含量低于100％，
表明该组合物具有降低细胞内黑色素含量的活性。以0.2mg/mL南瓜籽多肽与6ug/mL龙眼核
多酚为例，单独使用时黑色素含量分别为110.32％、121.83％，但是当二者以组合物的形式
存在，二者在组合物中的最终浓度仍分别为0.2mg/mL、6ug/mL，黑色素含量达到95.36％，孵
育了降低黑色素含量能力。从表3中可以看出，龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物中龙眼核多
酚的浓度范围为：0‑10ug/mL、南瓜籽多肽的浓度范围为：0.2‑1.0mg/mL，可以降低细胞黑色
素的分泌，起到美白效果。

[0063] 实施例2

[0064] 本实施例提高龙眼核多酚中多酚含量的一种方法，包括：

[0065] (1)将洗净的龙眼核在45±5℃条件下干燥24h，用高速粉碎机将龙眼核粉碎并过60目筛；按料液比1:4(g/mL)加入石油醚，于40℃下搅拌4h，去除石油醚，加入乙醇超声处理
60min，乙醇体积分数60％，料液比1/25(g/mL)，温度70℃，超声功率为100W，频率为40Hz，超
声处理后过滤，得龙眼核多酚提取液，提取液中龙眼核多酚含量为53.68mg/g。

[0066] (2)取龙眼核多酚提取液500mL，减压浓缩至50mL后，依次用200mL的三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每种溶剂萃取三次，合并后减压浓缩，冷冻干燥得到粉末。

[0067] (3)萃取物中多酚含量的测定如表4所示。

[0068] 表4

[0069]

[0070] 从表4中可以看出，乙酸乙酯相得到的多酚含量最高，为663.50mg/g；较粗提物相的285.62mg/g有很大的提升。三氯甲烷相和正丁醇相的多酚含量远低于乙酸乙酯相，略低
于粗提物相，分别为254.23mg/g和262.25mg/g，结果表明粗提物经乙酸乙酯萃取后多酚含
量得到显著提高。因此，本发明优选乙酸乙酯作为萃取剂。

[0071] 对照例1

[0072] (1)将洗净的龙眼核在45±5℃条件下干燥24h，用高速粉碎机将龙眼核粉碎并过60目筛；按料液比1:4(g/mL)加入石油醚，于40℃下搅拌4h，去除石油醚，加入乙醇超声处理
60min，乙醇体积分数60％，料液比1/25(g/mL)，温度70℃，超声功率为100W，频率为40Hz，超
声处理后过滤，得龙眼核多酚提取液，提取液中龙眼核多酚含量为53.68mg/g；

[0073] 取龙眼核多酚提取液500mL，减压浓缩至50mL后，用200mL的乙酸乙酯萃取，溶剂萃取三次，合并三次萃取液后减压浓缩，冷冻干燥(冷阱温度‑30～50℃，压力10～50Pa，时间3
～5天)得到乙酸乙酯相多酚粉末，简称为LEP。

[0074] (2)将南瓜籽经高速粉碎机粉碎，过60目筛；

[0075] 料液比以g/mL计1:4加入石油醚，在40℃下搅拌4h，抽滤，重复3次，合并滤液，于通风橱中除去残留石油醚，得脱脂南瓜籽；

[0076] 将脱脂南瓜籽以料液比1:30g/mL加入至去离子水中，调节pH至9.5，在35℃下反应180min，在10000r/min条件下离心5min后，收集上清液，调节pH至4.3后，5000r/min离心
10min，收集沉淀，水洗至中性，冷冻干燥得南瓜籽蛋白；

[0077] 取南瓜籽蛋白以料液比1:40g/mL加入至去离子水中形成南瓜籽蛋白质分散液，调节南瓜籽蛋白质分散液温度及pH至50℃、9.0，以酶底比2.5％加入碱性蛋白酶，酶解2h后于
沸水中灭活，调节反应液温度及pH至37℃、7.5，再以酶底比2.5％加入胰蛋白酶，酶解2h后
灭活，酶解期间滴加0.5mol/L NaOH溶液维持溶液pH值不变；

[0078] 酶解结束，混合液冷却至室温，加入1mol/L HCl调节pH至等电点4.3，离心5000r/min 10min收集上清液，冷冻干燥得多肽；

[0079] 将南瓜籽多肽配制成10mg/mL溶液，依次通过0.45μm及0.22μm的微孔滤膜，调节超滤压力为0.2MPa，常温超滤5次后，再收集通过1000Da超滤膜的多肽溶液，冷冻干燥得多肽，
简称为PSP。

[0080] (3)将龙眼核多酚LEP粉末溶解于二甲基亚砜中配制为LEP高浓度溶液，浓度大于或等于10ug/mL；

[0081] 将南瓜籽多肽PSP粉末溶解于去离子水中，配制为PSP溶液，浓度大于或等于1.0mg/mL；

[0082] 将LEP高浓度溶液与PSP溶液充分混合，制得龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物，其中，组合物中龙眼核多酚浓度大于10ug/mL，南瓜籽多肽浓度达到0.2～1.0mg/mL，组合物中
二甲基亚砜与去离子水均匀分布，以上浓度均为龙眼核多酚、南瓜籽多肽在组合物中的终
浓度。

[0083] 制得的组合物细胞毒性如图1所示。图中10.1ug/mL LEP即为10.1ug/mL的龙眼核多酚溶液。从图1中可以看出，当组合物中龙眼核多酚的最终浓度超过10.0ug/mL，无论南瓜
籽多肽的最终浓度，毒性持续提高。

[0084] 对照例2

[0085] 在对比例1的基础上，保持龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物中龙眼核多酚的浓度范围要求为：0‑10ug/mL，南瓜籽多肽的浓度范围大于1.0mg/mL，以上浓度均为龙眼核多酚、南
瓜籽多肽在组合物中的终浓度，其他条件均与对比例1相同。

[0086] 制得的组合物细胞毒性如图2所示。图中10ug/mL LEP即为10ug/mL的龙眼核多酚溶液。从图2中可以看出，当组合物中南瓜籽多肽的最终浓度超过1.0mg/mL时，组合物细胞
毒性提高。

[0087] 对照例3

[0088] 在对比例1的基础上制得的组合物，组合物抗氧化活性如表5所示。

[0089] 表5

[0090]

[0091] 表中10.1ug/mL LEP即为10.1ug/mL的龙眼核多酚溶液，从表5中可以看出，当龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物中龙眼核多酚终浓度大于10.0ug/mL时，该组合物的抗氧化性能
并没有协同增效作用。以0.2mg/mL南瓜籽多肽与10.1ug/mL龙眼核多酚为例，单独使用时自
由基清除率分别为5.42％、52.02％，但是当二者以组合物的形式存在，二者在组合物中的
最终浓度仍分别为0.2mg/mL、10.1ug/mL，自由基清除率达到60.36％，接近于二者自由基清
除率的加和，不具有显著的协同增效效果。

[0092] 对照例4

[0093] 在对比例2的基础上制得的组合物，组合物抗氧化活性如表6所示。

[0094] 表6

[0095]

[0096]

[0097] 表中10.1ug/mL LEP即为10.1ug/mL的龙眼核多酚溶液；组合物配制方法如上述方法。从表6中可以看出，当龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物中南瓜籽多肽终浓度大于10.0mg/
mL时，该组合物的抗氧化性能并没有协同增效作用。以10.1mg/mL南瓜籽多肽与6ug/mL龙眼
核多酚为例，单独使用时自由基清除率分别为22.82％、21.24％，但是当二者以组合物的形
式存在，二者在组合物中的最终浓度仍分别为10.1mg/mL、6ug/mL，自由基清除率达到
45.76％，接近于二者自由基清除率的加和，不具有显著的协同增效效果。

[0098] 对照例5

[0099] 在对比例1的基础上制得的组合物，组合物黑色素含量如表7所示。

[0100] 表7

[0101]

[0102] 图中10.1ug/mL LEP即为10.1ug/mL的龙眼核多酚溶液；组合物配制方法如上述方法。从表7中可以看出，当龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物中龙眼核多酚终浓度大于10.0ug/
mL时，细胞内黑色素含量始终大于对照组100.00％，表明超过此浓度范围不具备美白活性。
以0.2mg/mL南瓜籽多肽与10.1ug/mL龙眼核多酚为例，单独使用时细胞内黑色素含量分别
为110.32％、126.84％，但是当二者以组合物的形式存在，二者在组合物中的最终浓度仍分
别为0.2mg/mL、10.1ug/mL，细胞内黑色素含量达到124.86％，不具美白活性。

[0103] 对照例6

[0104] 在对比例2的基础上制得的组合物，组合物黑色素含量如表8所示。

[0105] 表8

[0106]

[0107]

[0108] 组合物美白活性如表8所示。从表8中可以看出，当龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物中南瓜籽多肽终浓度大于10.0mg/mL时，细胞内黑色素含量始终大于对照组100.00％，表明
超过此浓度范围不具备美白活性。以10.1mg/mL南瓜籽多肽与6ug/mL龙眼核多酚为例，单独
使用时细胞内黑色素含量分别为119.92％、121.83％，但是当二者以组合物的形式存在，二
者在组合物中的最终浓度仍分别为10.1mg/mL、6ug/mL，细胞内黑色素含量达到125.66％，
不具美白活性。

[0109] 本发明提供一种龙眼核多酚‑南瓜籽多肽组合物，采用乙酸乙酯萃取龙眼核提取物，其多酚含量得到显著提高，且其抗氧化性能也得到提高；制备的龙眼核多酚与南瓜籽多
肽复配可以显著提高抗氧化性能，有协同增效效果。本发明中制备的龙眼核多酚与一定浓
度的南瓜籽多肽复配可以降低龙眼核多酚毒性，同时，本发明中制备的龙眼核多酚与南瓜
籽多肽复配赋予其可以降低细胞内黑色素含量的新功能。本发明中制备的龙眼核多酚与一
定浓度的南瓜籽多肽复配可以降低龙眼核多酚毒性，同时，本发明中制备的龙眼核多酚与
南瓜籽多肽复配赋予其可以降低细胞内黑色素含量的新功能，龙眼核多酚以及南瓜籽多肽
单独作用于细胞时不具备此功能，在实施例1、对照例5、6中有具体说明。

[0110] 应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术
方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发
明的权利要求范围当中。