一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法。所述的三价流感病毒亚单位疫苗，每剂含H1N1、H3N2和乙B型共三种，所述的三价流感病毒亚单位疫苗为经病毒接种、病毒增殖培养、尿囊液收获、澄清、灭活、超滤浓缩、裂解和超速离心纯化、混配、过滤除菌、分装和包装制备得到的，其中，所述的灭活为：先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活。本发明方法降低了制得的三价流感病毒亚单位疫苗中游离甲醛的含量，延长了疫苗保存期，升高了疫苗免疫后抗体水平的产生。

权利要求

1.一种三价流感病毒亚单位疫苗，每剂含H1N1、H3N2和乙B型共三种，所述的三价流感病毒亚单位疫苗为经病毒接种、病毒增殖培养、尿囊液收获、澄清、灭活、超滤浓缩、裂解和超速离心纯化、混配、过滤除菌、分装和包装制备得到的，其特征在于，所述的灭活为：先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活；所述的羧甲基葡聚糖的取代度为0.5‑0.7。

2.一种权利要求1所述的三价流感病毒亚单位疫苗的制备方法，包括病毒接种、病毒增殖培养、尿囊液收获、澄清、灭活、超滤浓缩、裂解和超速离心纯化、混配、过滤除菌、分装和包装，其特征在于，所述的灭活为：先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活；所述的羧甲基葡聚糖的取代度为0.5‑0.7。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的羧甲基葡聚糖溶液的加入量与单价病毒收获液的体积比为1：0.1‑0.5。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的羧甲基葡聚糖溶液的浓度为1‑

5g/100mL。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的羧甲基葡聚糖溶液为将羧甲基葡聚糖加入注射用水中溶解配制而成的。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的甲醛的终浓度为100‑150mg/ml，所述的灭活时间为35‑45小时。

7.根据权利要求2‑6任意一项所述的制备方法，其特征在于，裂解中所采用的裂解剂为壬苯醇醚‑9。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述裂解剂的浓度为0.01‑2％。

说明书

一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

[0002] 流感是由流感病毒引起的，可造成大规模流行的人、禽畜共患的急性呼吸道传播疾病。流行性感冒病毒分甲、乙、丙三型。其中，甲型致病力最强，可感染动物和人类并引起
流行甚至是世界范围内的大流行；乙型致病力稍弱，可引起局部流行。流感病毒经常发生抗
原漂移和抗原转移，逃避机体免疫系统的防御，这也是造成大流行的原因。流感病毒具有高
度传染性，通过飞沫经空气传播。经短暂潜伏期后，急起高热寒战，1‑2日内体温可高达40
℃，伴随全身乏力、头痛、肌痛、咽痛等症状，可引起肺炎、支气管炎、心肌炎、心包炎等并发
症，造成老年人、体弱者等高危人群的大量死亡，给社会带来巨大的损失。

[0003] 市场上现有疫苗为流感全病毒灭活疫苗和流感病毒裂解疫苗，传统裂解疫苗纯化方法为：澄清灭活的单价收获液经超滤浓缩、蔗糖密度区带离心法纯化、超滤除去蔗糖、裂
解、再次蔗糖密度区带离心法纯化，再次超滤除去蔗糖，除菌过滤，加入硫柳泵作为防腐剂。
工艺复杂，步骤繁琐，消耗大量的人力物力，增加微生物污染风险。

[0004] 同时传统流感疫苗纯度不够且含有对人体有害的佐剂及防腐剂。佐剂虽然可以改善疫苗的免疫应答，但代价是反应原性增加，甚至更严重。例如，老年人接种MF59佐剂流感
疫苗后抗体水平提高了，但是接种后的局部反应更多了，在一项老年人的对照研究中，接种
含佐剂疫苗的老年人与接种无佐剂的老年人相比，疼痛增加6倍，局部发红增加2倍，乏力和
肌肉痛等全身反应也增加了。另据报道，使用了丹麦Statens血清研究所生产的氢氧化铝吸
附的百白破疫苗，导致546例注射部位出现顽固性硬结性瘙痒的严重不良反应。其中77％的
不良反应病例经皮肤试验确认为对氢氧化铝过敏。目前，国家食品药品管理局已禁止了氢
氧化铝佐剂用于狂犬病疫苗的生产。硫柳泵一直被用做许多疫苗的防腐剂，不过现在硫柳
泵引起接触性皮炎、变应性结膜炎、耳毒性等毒副作用已经开始引起科研人员的重视，现在
已经在美国爱荷华州、加利福尼亚州、英国和其他欧洲国家禁止在儿童疫苗中使用硫柳泵。

[0005] CN107537030A公开了一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，其中，该流感疫苗采用裂解剂和新的纯化方法将裂解后的病毒蛋白进一步纯化，制成三价流感病毒亚单
位疫苗，其中每剂含甲1型(H1N1)、甲3型(H3N2)、乙型共三种流感血凝素含量在80％以上，
不含佐剂，不含硫柳汞等防腐剂。本发明还提供了该流感疫苗的制备方法，包括以下步骤：
病毒接种，病毒增殖培养，尿囊液收获，澄清，超滤浓缩，灭活，裂解和超速离心纯化，凝胶过
滤层析纯化(超滤)，混配，过滤除菌，分装，包装等步骤。本发明提供的流感病毒亚单位疫苗
可以提高流感疫苗的安全性，消除了佐剂带来的不良反应，消除了硫柳汞引起的毒副作用。

[0006] 目前，在流感疫苗的生产中，用甲醛作为灭活剂进行病毒的灭活。甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质。其既可以作用于病毒含氨基的核苷酸碱基(如A，G，U)，又可作用于病
毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，不能再作用于壳蛋
白内的核酸。这样，病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活。故而为了
使病原得到充分的灭活，以免发生散毒事故发生，在疫苗的生产过程中，均采用加大甲醛浓
度及延长灭活时间等措施。这样的结果就可能造成在疫苗的保存过程中，多余的游离甲醛
醛基不断作用于病毒的抗原，使抗原在醛基的作用下逐渐降解，这样疫苗中的有效成分不
断流逝，不仅缩短了疫苗的保存期，还降低了疫苗免疫后抗体水平的产生。

[0007] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0008] 本发明的第一目的在于提供一种三价流感病毒亚单位疫苗，该疫苗中游离甲醛的含量较少，延长了疫苗的保存期，升高了疫苗免疫后抗体水平的产生。

[0009] 本发明的第二目的在于提供所述的三价流感病毒亚单位疫苗的制备方法，该方法在灭活过程中先加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活，采用该方法制得的疫苗中
游离甲醛的含量较少，延长了疫苗的保存期，升高了疫苗免疫后抗体水平的产生。

[0010] 为实现本发明的第一目的，本发明采用如下技术方案：

[0011] 一种三价流感病毒亚单位疫苗，每剂含甲1型(H1N1)、甲3型(H3N2)和乙(B)型共三种，所述的三价流感病毒亚单位疫苗为经病毒接种、病毒增殖培养、尿囊液收获、澄清、灭
活、超滤浓缩、裂解和超速离心纯化、混配、过滤除菌、分装和包装制备得到的，其中，所述的
灭活为：先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活。

[0012] 目前，在流感疫苗的生产中，用甲醛作为灭活剂进行病毒的灭活。甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质。其既可以作用于病毒含氨基的核苷酸碱基(如A，G，U)，又可作用于病
毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，不能再作用于壳蛋
白内的核酸。这样，病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活。故而为了
使病原得到充分的灭活，以免发生散毒事故发生，在疫苗生产过程中，均采用加大甲醛浓度
及延长灭活时间等措施。这样的结果就可能造成在疫苗的保存过程中，多余的游离甲醛醛
基不断作用于病毒的抗原，使抗原在醛基的作用下逐渐降解，这样疫苗中的有效成分不断
流逝，不仅缩短了疫苗的保存期，还降低了疫苗免疫后抗体水平的产生。

[0013] 本发明中，在灭活过程中采用先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活的方法，大大降低了疫苗中游离甲醛的含量，延长了疫苗的保存期，升高
了疫苗免疫后抗体水平的产生。

[0014] 进一步的，所述的羧甲基葡聚糖的取代度为0.5‑0.7。

[0015] 本发明中，所述的羧甲基葡聚糖经羧甲基修饰后，引入了带电的亲水性基团，水溶性增加，取代度越高，水溶性越高，但构象破坏严重，活性下降，适当的取代度可以在不破坏
生物活性的基础上增加水溶性，取代度小于0.75才不至于影响免疫活性。

[0016] 本发明经试验表明，羧甲基葡聚糖的取代度对所制得的疫苗中游离甲醛的含量有一定的影响。当羧甲基葡聚糖的取代度在0.5‑0.7时制得的三价流感病毒亚单位疫苗中游
离甲醛的含量明显低于羧甲基葡聚糖的取代度不在0.5‑0.7的范围时制得的三价流感病毒
亚单位疫苗中游离甲醛的含量。因此，本发明中优选所述的羧甲基葡聚糖的取代度为0.5‑
0.7。

[0017] 为实现本发明的第二目的，本发明采用如下技术方案：

[0018] 一种所述的三价流感病毒亚单位疫苗的制备方法，包括病毒接种、病毒增殖培养、尿囊液收获、澄清、灭活、超滤浓缩、裂解和超速离心纯化、混配、过滤除菌、分装和包装，其
中，所述的灭活为：先向单价病毒收获液中加入羧甲基葡聚糖溶液，再加入甲醛进行灭活。

[0019] 进一步的，所述的羧甲基葡聚糖溶液的加入量与单价病毒收获液的体积比为1：0.1‑0.5。

[0020] 进一步的，所述的羧甲基葡聚糖的取代度为0.5‑0.7。

[0021] 进一步的，所述的羧甲基葡聚糖溶液的浓度为1‑5g/100mL。

[0022] 进一步的，所述的羧甲基葡聚糖溶液为将羧甲基葡聚糖加入注射用水中溶解配制而成的。

[0023] 进一步的，所述的甲醛的终浓度为100‑150mg/ml，所述的灭活时间为35‑45小时。

[0024] 进一步的，裂解中所采用的裂解剂为壬苯醇醚‑9。

[0025] 进一步的，所述裂解剂的浓度为0.01‑2％，这里的浓度为质量百分比浓度。

[0026] 本发明中，病毒接种、病毒增殖培养、尿囊液收获、澄清、灭活、超滤浓缩、裂解和超速离心纯化、混配、过滤除菌、分装和包装的方法按照本领域常用的方法进行，如按照
CN107537030A中的方法进行。

[0027] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：

[0028] 本发明方法制得的三价流感病毒亚单位疫苗中游离甲醛的含量较少，延长了疫苗的保存期，升高了疫苗免疫后抗体水平的产生。

具体实施方式

[0029] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的
实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都
属于本发明保护的范围。

[0030] 下述实施例中，所述的羧甲基葡聚糖溶液采用如下方法配制而成：

[0031] 将羧甲基葡聚糖加入注射用水中溶解配制成浓度为1‑5g/100mL的羧甲基葡聚糖水溶液，其中羧甲基葡聚糖的取代度为0.5‑0.7。

[0032] 实施例1

[0033] 一、甲1(H1N1)型流感病毒亚单位疫苗单价原液生产方法，依次包括以下步骤：

[0034] (1)病毒接种：将甲1(H1N1)型流感病毒工作种子接种于10日龄健康鸡胚尿囊腔中；

[0035] (2)病毒增殖培养：将接种后的鸡胚转入34℃孵箱培养48小时，增殖流感病毒；

[0036] (3)尿囊液收获：筛选活鸡胚，放置2℃冷胚16小时后收获尿囊液；

[0037] (4)澄清：用离心法除去鸡胚血红细胞等大部分杂质；

[0038] (5)灭活：向单价病毒收获液中加入浓度为3g/100mL的羧甲基葡聚糖溶液，其中羧甲基葡聚糖溶液的加入量与单价病毒收获液的体积比为1：0.3，羧甲基葡聚糖的取代度为
0.6，然后加入终浓度120mg/ml的甲醛，于2℃灭活35小时；

[0039] (6)超滤浓缩：将充分灭活后的流感病毒尿囊收获液，用截留分子量1000kD的超滤膜进行超滤浓缩；

[0040] (7)裂解和超速离心纯化：将超滤浓缩液加入1.0％裂解剂壬苯醇醚‑9，混合均匀后上样，在蔗糖密度区带离心的过程中进行同步裂解4小时，以达到边裂解边分离的目的，
根据蔗糖浓度，收获10‑20％之间的裂解液；

[0041] (8)凝胶过滤层析纯化：将上一步蔗糖密度梯度离心得到的溶液经SephadexG‑25葡聚糖凝胶过滤层析系统进一步纯化得到甲1(H1N1)型流感病毒亚单位疫苗单价原液。

[0042] 二、甲3(H3N2)型流感病毒亚单位疫苗单价原液生产方法，依次包括以下步骤：

[0043] (1)病毒接种：将甲3(H3N2)型流感病毒工作种子接种于10日龄健康鸡胚尿囊腔中；

[0044] (2)病毒增殖培养：将接种后的鸡胚转入34℃孵箱培养48小时，增殖流感病毒；

[0045] (3)尿囊液收获：筛选活鸡胚，放置2℃冷胚16小时后收获尿囊液；

[0046] (4)澄清：用离心法除去鸡胚血红细胞等大部分杂质；

[0047] (5)灭活：向单价病毒收获液中加入浓度为3g/100mL的羧甲基葡聚糖溶液，其中羧甲基葡聚糖溶液的加入量与单价病毒收获液的体积比为1：0.3，羧甲基葡聚糖的取代度为
0.6，然后加入终浓度120mg/ml的甲醛，于2℃灭活45小时；

[0048] (6)超滤浓缩：将充分灭活后的流感病毒尿囊收获液，用截留分子量300kD的超滤膜进行超滤浓缩；

[0049] (7)裂解和超速离心纯化：将超滤浓缩液加入0.5％裂解剂壬苯醇醚‑9，混合均匀后上样，在蔗糖密度区带离心的过程中进行同步裂解10小时，以达到边裂解边分离的目的，
根据蔗糖浓度，收获15‑30％之间的裂解液；

[0050] (8)凝胶过滤层析纯化：将上一步蔗糖密度梯度离心得到的溶液经SephadexG‑25葡聚糖凝胶过滤层析系统进一步纯化得到甲3(H3N2)型流感病毒亚单位疫苗单价原液。

[0051] 三、乙(B)型流感病毒亚单位疫苗单价原液生产方法，依次包括以下步骤：

[0052] (1)病毒接种：将乙(B)型流感病毒工作种子接种于10日龄健康鸡胚尿囊腔中；

[0053] (2)病毒增殖培养：将接种后的鸡胚转入34℃孵箱培养72小时，增殖流感病毒；

[0054] (3)尿囊液收获：筛选活鸡胚，放置2℃冷胚16小时后收获尿囊液；

[0055] (4)澄清：用离心法除去鸡胚血红细胞等大部分杂质；

[0056] (5)灭活：向单价病毒收获液中加入浓度为3g/100mL的羧甲基葡聚糖溶液，其中羧甲基葡聚糖溶液的加入量与单价病毒收获液的体积比为1：0.3，羧甲基葡聚糖的取代度为
0.6，然后加入终浓度120mg/ml的甲醛，于2℃灭活40小时；

[0057] (6)超滤浓缩：将充分灭活后的流感病毒尿囊收获液，用截留分子量1000kD的超滤膜进行超滤浓缩；

[0058] (7)裂解和超速离心纯化：将超滤浓缩液加入1.5％裂解剂壬苯醇醚‑9，混合均匀后上样，在蔗糖密度区带离心的过程中进行同步裂解8小时，以达到边裂解边分离的目的，
根据蔗糖浓度，收获10‑30％之间的裂解液；

[0059] (8)凝胶过滤层析纯化：将上一步蔗糖密度梯度离心得到的溶液经SephadexG‑25葡聚糖凝胶过滤层析系统进一步纯化得到乙(B)型流感病毒亚单位疫苗单价原液。

[0060] 四、疫苗成品混配与制备方法，依次包括以下步骤：

[0061] (1)混配：将甲1(H1N1)、甲3(H3N2)和乙(B)型流感病毒单价原液按照血凝素浓度1：1：1的关系进行混配，各型病毒血凝素浓度控制在40‑48mg/ml之间；

[0062] (2)过滤除菌：将上一步混配后的病毒液经0.22mm滤膜过滤除菌后即得到流感病毒亚单位疫苗半成品；

[0063] (3)分装：将疫苗半成品分装到预灌封西林瓶中，每支0.5ml，每1次人用剂量为0.5ml，含各流感病毒株血凝素应在10‑20mg范围；

[0064] (4)包装：灯检合格后，按照质量标准进行贴标装盒等包装，即得三价流感病毒亚单位疫苗。

[0065] 实施例2

[0066] 具体同实施例1，所不同的是：

[0067] 一、甲1(H1N1)型流感病毒亚单位疫苗单价原液生产方法中：

[0068] 步骤(3)为：筛选活鸡胚，放置5℃冷胚16小时后收获尿囊液；

[0069] 步骤(5)为：向单价病毒收获液中加入浓度为1g/100mL的羧甲基葡聚糖溶液，其中羧甲基葡聚糖溶液的加入量与单价病毒收获液的体积比为1：0.5，羧甲基葡聚糖的取代度
为0.5，然后加入终浓度100mg/ml的甲醛，于5℃灭活35小时；

[0070] 步骤(7)中，裂解剂壬苯醇醚‑9的浓度为0.01％。

[0071] 二、甲3(H3N2)型流感病毒亚单位疫苗单价原液生产方法中：

[0072] 步骤(3)为：筛选活鸡胚，放置5℃冷胚16小时后收获尿囊液；

[0073] 步骤(5)为：向单价病毒收获液中加入浓度为3g/100mL的羧甲基葡聚糖溶液，其中羧甲基葡聚糖溶液的加入量与单价病毒收获液的体积比为1：0.5，羧甲基葡聚糖的取代度
为0.5，然后加入终浓度100mg/ml的甲醛，于5℃灭活45小时；

[0074] 三、乙(B)型流感病毒亚单位疫苗单价原液生产方法中：

[0075] 步骤(3)为：筛选活鸡胚，放置5℃冷胚16小时后收获尿囊液；

[0076] 步骤(5)为：向单价病毒收获液中加入浓度为3g/100mL的羧甲基葡聚糖溶液，其中羧甲基葡聚糖溶液的加入量与单价病毒收获液的体积比为1：0.5，羧甲基葡聚糖的取代度
为0.5，然后加入终浓度100mg/ml的甲醛，于5℃灭活40小时；

[0077] 步骤(7)中，裂解剂壬苯醇醚‑9的浓度为0.01％。

[0078] 实施例3

[0079] 具体同实施例1，所不同的是：

[0080] 一、甲1(H1N1)型流感病毒亚单位疫苗单价原液生产方法中：

[0081] 步骤(3)为：筛选活鸡胚，放置8℃冷胚16小时后收获尿囊液；

[0082] 步骤(5)为：向单价病毒收获液中加入浓度为5g/100mL的羧甲基葡聚糖溶液，其中羧甲基葡聚糖溶液的加入量与单价病毒收获液的体积比为1：0.7，羧甲基葡聚糖的取代度
为0.7，然后加入终浓度150mg/ml的甲醛，于8℃灭活35小时；

[0083] 步骤(7)中，裂解剂壬苯醇醚‑9的浓度为2％。

[0084] 二、甲3(H3N2)型流感病毒亚单位疫苗单价原液生产方法中：

[0085] 步骤(3)为：筛选活鸡胚，放置8℃冷胚16小时后收获尿囊液；

[0086] 步骤(5)为：向单价病毒收获液中以体积比1：0.3的量加入浓度为3g/100mL的羧甲基葡聚糖溶液，其中羧甲基葡聚糖的取代度为0.7，然后加入终浓度150mg/ml的甲醛，于8℃
灭活45小时；

[0087] 步骤(7)中，裂解剂壬苯醇醚‑9的浓度为2％。

[0088] 三、乙(B)型流感病毒亚单位疫苗单价原液生产方法中：

[0089] 步骤(3)为：筛选活鸡胚，放置8℃冷胚16小时后收获尿囊液；

[0090] 步骤(5)为：向单价病毒收获液中以体积比1：0.3的量加入浓度为3g/100mL的羧甲基葡聚糖溶液，其中羧甲基葡聚糖的取代度为0.7，然后加入终浓度150mg/ml的甲醛，于8℃
灭活40小时；

[0091] 步骤(7)中，裂解剂壬苯醇醚‑9的浓度为2％。

[0092] 对比例

[0093] 具体步骤同实施例1，所不同的是各型流感病毒亚单位疫苗单价原液的生产方法中灭活工艺如下：

[0094] 甲1(H1N1)型流感病毒亚单位疫苗单价原液生产方法的步骤(5)所述的灭活为：向单价病毒收获液中加入终浓度180mg/ml的甲醛，于2℃灭活80小时。

[0095] 甲3(H3N2)型流感病毒亚单位疫苗单价原液生产方法的步骤(5)所述的灭活为：向单价病毒收获液中加入终浓度180mg/ml的甲醛，于2℃灭活100小时；

[0096] 乙(B)型流感病毒亚单位疫苗单价原液生产方法的步骤(5)所述的灭活为：向单价病毒收获液中加入终浓度180mg/ml的甲醛，于2℃灭活120小时。

[0097] 试验例1、灭活工艺抗原性试验

[0098] 取不同方法(实施例1和对比例)灭活的病毒液，经PBS稀释，使血凝素含量为30μg/ml。分别接种16‑18g健康清洁级ISR小鼠10只，雌雄各半，每只腹腔注射0.2ml，同时另取10
只小鼠，分别注射PBS缓冲液作为阴性对照。21d后眼眶采血，分离血清，用过碘酸钾处理去
除非特异性抑制素，血凝抑制试验测定抗体效价，结果见表1、表2和表3。

[0099] 表1、甲1型(H1N1)灭活组抗体效价表

[0100]

[0101] 表2、甲3型(H3N2)灭活组抗体效价表

[0102]

[0103] 表3、乙(B)型灭活组抗体效价表

[0104]

[0105] 从上表可以看出，采用本发明灭活方法制得的病毒液的免疫效果优于甲醛灭活组。

[0106] 试验例2、游离甲醛含量检验

[0107] 本试验例考察了不同灭活方法以及羧甲基葡聚糖的取代度对所得的三价流感病毒亚单位疫苗中游离甲醛的含量的影响。

[0108] 试验样品：

[0109] 试验组1：采用实施例1的方法制得的三价流感病毒亚单位疫苗；

[0110] 试验组2：采用实施例2的方法制得的三价流感病毒亚单位疫苗；

[0111] 试验组3：采用实施例3的方法制得的三价流感病毒亚单位疫苗；

[0112] 对照组1：采用对比例的方法制得的三价流感病毒亚单位疫苗；

[0113] 对照组2：具体同实施例1，所不同的是羧甲基葡聚糖的取代度为0.4；

[0114] 对照组3：具体同实施例1，所不同的是羧甲基葡聚糖的取代度为0.8。

[0115] 试验方法：按照“流感裂解灭活疫苗纯化工艺的开发”[大连理工大学硕士学位论文]中记载的“游离甲醛含量的测定”方法进行测定。

[0116] 测定结果见表4所示：

[0117] 表4、游离甲醛含量检验

[0118]样品 游离甲醛含量(μg/ml)
试验组1 7.3
试验组2 7.5
试验组3 7.4
对照组1 22.7
对照组2 13.5
对照组3 13.3

[0119] 从上述试验结果可以看出，采用本发明方法制得的三价流感病毒亚单位疫苗(试验组1、试验组2和试验组3)中游离甲醛的含量明显低于采用甲醛灭活方法制得的三价流感
病毒亚单位疫苗(对照组1)，而羧甲基葡聚糖的取代度对所制得的疫苗中游离甲醛的含量
有一定的影响。当羧甲基葡聚糖的取代度在0.5‑0.7时制得的三价流感病毒亚单位疫苗(试
验组1、试验组2和试验组3)中游离甲醛的含量又明显低于羧甲基葡聚糖的取代度不在0.5‑
0.7的范围时制得的三价流感病毒亚单位疫苗(对照组2、对照组3)中游离甲醛的含量。

[0120] 试验例3、效力检验

[0121] 分别将本发明实施例1和对比例制得的三价流感病毒亚单位疫苗在(6±2)℃保存18个月，取25只4w龄SPF鸡，每组疫苗颈部皮下免疫4w龄SPF鸡10只，0.3ml/只，实施例1的作
为试验组，对比例的作为对照组，另设不免疫的SPF鸡5只作为空白对照组。该试验SPF鸡在
负压隔离器中饲养，分别于接种21d、35d后采心脏血0.5ml/只，置于灭菌小瓶中，常温静置
4h左右，待出血清后，用血凝抑制试验检测血清的HI抗体(log2)，并设阳性血清对照组和阴
性血清对照组。

[0122] 检测结果见表5和表6：

[0123] 表5、各组疫苗免疫后21d抗体检测结果

[0124]

[0125] 表6、各组疫苗免疫后35d抗体检测结果

[0126]

[0127] 从表5和表6的结果可以看出，采用本发明灭活方法的实施例1的试验组血清抗体在21天时比对照组高3个滴度，“标准”规定该疫苗的抗体水平在6log2时为合格产品，而采
用甲醛灭活的对比例的对照组显然已经不合格了；在35天时试验组抗体水平在升高，而对
照组维持原水平基本不变。该实验中阳性血清和阴性血清的抗体数据正常，说明试验成立。

[0128] 对本发明其它实施例制得的三价流感病毒亚单位疫苗也进行了上述试验，其获得的结果相似。

[0129] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可
以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。
凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的
保护范围之内。