一种分离的RNA及其DNA模板的合成方法

摘要

本发明公开了一种分离的RNA及其DNA模板的合成方法，涉及生物分子技术领域，具体而言，该分离的RNA为利于SNHG17的功能及肿瘤的调控机制提供了一种新的研究途径。

权利要求

1.一种分离的RNA，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种DNA片段，其特征在于，其能够转录如权利要求1所述的分离的RNA。

3.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求2所述的DNA片段。

4.一种宿主细胞，其特征在于，其含有如权利要求3所述的重组载体。

说明书

一种分离的RNA及其DNA模板的合成方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物分子技术领域，具体而言，涉及一种分离的RNA及其DNA模板的合成方法。

背景技术

[0002] 癌症研究主要集中在蛋白质编码基因的遗传改变，对非编码基因认识很少。近些年，随着高通量测序技术的发展，非编码RNA从“垃圾物质”变为被认为具有多种调控功能的
基因。

[0003] 长链非编码RNA(lncRNA)是非编码RNA的最重要的一类，lncRNA是长度大于200个核苷酸的RNA，根据不同功能，lncRNA包括抑癌基因和癌基因，参与多种癌症的发生发展，开
发具有重要功能的lncRNA研究靶点，对于肿瘤患者的诊断及治疗具有重要意义。

[0004] 目前对lncRNA功能研究主要在转录后调控和染色质修饰等多种生物学进展。lncRNA表达失调能够调节肿瘤的发生和转移，例如，HOTAIR、HULC、LINC00152、MALAT1、H19、
GHET1和GACAT3等已经被证明是较好的致癌基因靶点，而如LEIGC、GAS5和FER1L4。

[0005] 小核RNA(small nucleolar RNAs,snoRNAs)被认为是蛋白质合成机制中重要的组成部分。这些非编码RNA在调控细胞命运和肿瘤发生方面发挥关键作用。同时，也有报道证
明snoRNAs的宿主基因也能促进癌症的发展，它们贮存于长链非编码RNA(long non‑coding 
RNA，lncRNA)和非蛋白编码基因的内含子区，小核RNA宿主基因17(small nucleolar RNA 
host gene 17，SNHG17)是这些宿主基因中的一员。

[0006] SNHG17基因定位于20号染色体p12上，ensemble数据库显示SNHG17基因有9条转录本，主要定位在细胞核内。SNHG亚型众多，而SNHG17功能及对肿瘤的调控机制研究缺鲜有报
道，且体外转录很难合成RNA，有许多因素会导致转录失败，例如模板不纯等。

[0007] 鉴于此，提出本申请。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种分离的RNA及其DNA模板的合成方法，为SNHG17功能及对肿瘤的调控机制研究提供一种新的途径。

[0009] 第一方面，本发明实施例提供了一种分离的RNA，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

[0010] 第二方面，本发明实施例提供了一种DNA片段，其能够转录如前述实施例所述的分离的RNA。

[0011] 第三方面，本发明实施例提供了一种重组载体，其含有如前述实施例所述的DNA片段。

[0012] 第四方面，本发明实施例提供了一种宿主细胞，其含有如前述实施例所述的重组载体。

[0013] 第五方面，本发明实施例提供了一种核酸组合物，其包括用于扩增如前述实施例所述的分离的RNA的引物组合物。

[0014] 第六方面，本发明实施例提供了一种如前述实施例所述的分离的RNA的DNA模板的合成方法，其包括采用如前述实施例所述的核酸组合物对分离的RNA或含有所述分离的RNA
的载体进行扩增，以获得所述分离的RNA的体外转录的DNA模板。

[0015] 第七方面，本发明实施例提供了一种用于体外合成如前述实施例所述的分离的RNA的方法，其包括采用如前述实施例所述的分离的RNA的DNA模板的合成方法合成的DNA模
板进行体外转录。

[0016] 第八方面，本发明实施例提供了一种用于分析或诊断肿瘤的试剂盒，其包括如前述实施例所述的核酸组合物。

[0017] 第九方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的核酸组合物在制备用于分析或诊断肿瘤的试剂盒中的应用。

[0018] 本发明提供的技术方案的有益效果是：

[0019] 本发明实施例提供了一种分离的RNA，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，该分离的RNA能够用于研究SNHG17功能及肿瘤的调控机制。

[0020] 此外，本发明实施例还提供了一种用于体外转录合成如上述的分离的RNA的方法，其包括采用本发明实施例提供的分离的RNA的DNA模板的合成方法合成的DNA模板进行体外
转录。该方法能有效地在体外转录合成分离的RNA。

附图说明

[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对
范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这
些附图获得其他相关的附图。

[0022] 图1为实施例1中的NC过表达质粒和SNHG17过表达质粒的结构示意图；

[0023] 图2为实施例1中SNHG17过表达质粒的测序验证结果图；

[0024] 图3为实施例2中引物对1的扩增产物的电泳结果图；

[0025] 图4为实施例2中pEASY‑Blunt Zero Cloning Vector示意图；

[0026] 图5为实施例2中p‑zero‑SNHG17质粒的测序验证结果图；

[0027] 图6为试验例1中NC模型和SNHG17过表达模型的差异结果图；

[0028] 图7为试验例2中SNHG17对乳腺癌细胞的增殖影响结果图；

[0029] 图8为试验例2中SNHG17对乳腺癌细胞的迁移和侵袭影响结果图；

[0030] 图9为试验例3中的DNA模板的电泳结果图；

[0031] 图10为试验例3中与SNHG17 RNA结合的蛋白的筛选结果图。

具体实施方式

[0032] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建
议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产
品。

[0033] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0034] 名词定义

[0035] 本说明书中的“分离的RNA”是指一类生物聚合物，是一种分离的核糖核酸(RNA)。除特殊说明，核糖核酸的合成方式也有多种，如化学合成和体外转录等，无论是何种方式合
成，只要为本申请限定的序列，即在本申请的保护范围内。

[0036] 本说明书中的“DNA片段”可以为多种形式状态(其可以为单链分子、双链分子、线状分子或环状分子)，其包括有双股链，在转录过程中，仅有一股链作为模板转录成RNA，称
为模板链(template strand)，也称作负链或反意链；与模板链相对应的互补链称为编码链
(coding strand)，正链或有意义链。

[0037] 在癌症研究的过程中，非编码RNA在调控细胞和肿瘤发生方面发挥着至关重要的作用，然而现有关于SNHG17基因的了解甚少，其基因序列及其功能都处于初期研究阶段，对
此，本申请实施例提供了一种分离的RNA，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。该分离的RNA是
一种在肿瘤患者中高表达的一种非编码RNA，通过体外转录该片段，通过在体外转录该片
段，能够有效分析和筛选该片段或SNHG17的结合蛋白，以研究肿瘤的发生和转移的机制等，
有利于开发针对肿瘤特异性药物。

[0038] 本发明实施例还提供了一种DNA片段，其能够转录如前述实施例所述的分离的RNA。

[0039] DNA片段的序列如SEQ ID No.6所示。

[0040] 本发明实施例还提供了一种重组载体，其含有如前述实施例所述的DNA片段。

[0041] 重组载体是携带外源DNA进行宿主细胞的工具，能够运载外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和/或表达的DNA
分子。具体地，重组载体可以包括质粒载体、噬菌体载体和病毒载体。

[0042] 本发明实施例还提供了一种宿主细胞，其含有如前述实施例所述的重组载体。

[0043] 宿主细胞是指在转化和转导(感染)中接受外源基因的细胞，也称为受体细胞。宿主细胞也称为受体细胞，其包括原核受体细胞(如：大肠杆菌)、真核受体细胞(如酵母菌)和
动物细胞(也属于真核受体细胞)。

[0044] 本发明实施例还提供了一种核酸组合物，其包括用于扩增如前述实施例所述的分离的RNA的引物组合物。

[0045] 优选地，所述引物组合物包括引物对1，所述引物组合物包括引物对1、引物对2和引物对3中的任意一对或多对的组合；

[0046] 引物对1的上游引物和下游引物序列分别如SEQ ID No.2～3所示；

[0047] 所述引物对2的上游引物为启动子的碱基序列和引物对1的上游引物的碱基序列组成，下游引物的序列如SEQ ID No.3所示；

[0048] 所述引物对3的下游引物为引物对1的下游引物的碱基序列和启动子的碱基序列组成，上游引物的序列如SEQ ID No.2所示；

[0049] 所述启动子选自T3、T7和S6中的任意一种；

[0050] 优选地，所述引物对2的上游引物的序列如SEQ ID No.4所示；

[0051] 优选地，所述引物对3的下游引物的序列如SEQ ID No.5所示。

[0052] 本发明实施例还提供了一种如前述实施例所述的分离的RNA的DNA模板的合成方法，其包括采用如前述任一实施方式所述的核酸组合物对分离的RNA或含分离的RNA的载体
进行扩增，以获得所述分离的RNA的体外转录的DNA模板。需要说明的是，含分离的RNA的载
体同前述实施例中的重组载体。

[0053] 在一些实施方式中，进行扩增时，所述核酸组合物选用所述引物对2和/或所述引物对3。需要强调的是，采用上述合成方法合成的DNA目标用于体外转录，能够有效合成上述
分离的RNA，在此基础上能深度挖掘与SNHG17相互作用的蛋白，为SNHG17的功能以及转移机
制研究提供可靠的研究思路。

[0054] 本发明实施例还提供了一种用于体外转录合成前述任一实施方式所述的分离的RNA的方法，其包括采用前述实施例所述的分离的RNA的DNA模板的合成方法合成的DNA模板
进行体外转录。

[0055] 本发明实施例还提供了一种用于分析或诊断肿瘤的试剂盒，其包括如前述任一实施方式所述的核酸组合物；

[0056] 优选地，所述肿瘤包括胃癌、结直肠癌、黑色素瘤、肺癌和乳腺癌中的任意一种。

[0057] 此外，本发明实施例还提供了如前述任一实施方式所述的核酸组合物在制备用于分析或诊断肿瘤的试剂盒中的应用。

[0058] 在一些实施方式中，所述肿瘤包括胃癌、结直肠癌、黑色素瘤、肺癌和乳腺癌中的任意一种。

[0059] 下面结合具体实施例对本申请提供的技术方案作进一步说明。

[0060] 实施例1

[0061] 本实施例提供一种体外转录合成RNA的方法。

[0062] 1.分离的RNA(SNHG17)的DNA模板制备。

[0063] SNHG17过表达质粒构建

[0064] 将pHBLV‑CMV‑MCS‑EF1‑Zsgreen1‑T2A‑puro质粒作为空载体为对照组，将SNHG17 DNA片段(序列如SEQ ID No.6所示)与pHBLV‑CMV‑MCS‑EF1‑Zsgreen1‑T2A‑puro质粒连接，
进行基因重组，请参照附图1。

[0065] 构建SNHG17过表达质粒后，进行一代测序验证，结果请参照附图2，由图2可知，SNHG17过表达质粒(LV012‑h‑SNHG17)构建成功。

[0066] 用于体外转录的DNA模板

[0067] 化学合成如表1所示的引物对2和引物对3。将制备的SNHG17过表达质粒作为模板，使用引物对2和3进行PCR扩增，引物的序列如表1所示。

[0068] 表1引物对2和3的序列

[0069]

[0070] 备注：引物对2为上游引物引入了T3启动子的序列；引物对3为下游引物引入了T7启动子的序列。

[0071] PCR反应体系如表2所示，反应条件如表3所示，所有操作均在冰上进行。

[0072] 表2反应体系

[0073] 无酶双纯水 加至50μL2+
包含Mg 的10×扩增缓冲液 25μL
dNTP(10mM) 1μL
上游引物(10μM) 2μL
下游引物(10μM) 2μL
高保真DNA聚合酶 1μL
SNHG17过表达质粒 10pg‑30ng

[0074] 表3反应条件

[0075]

[0076] PCR反应后，得到的PCR产物于4℃存放，用于后续的体外转录。

[0077] 2.体外转录

[0078] 所有试剂室温融化：RNA聚合酶放置于冰上；涡旋混合10×Transcrip tion Buffer和dNTP使其融化，融化后dNTP冰上放置，10×Transcription Buffer室温放置。

[0079] 室温制备转录表4所示的反应液，轻弹EP管液体或用枪头轻柔混合，轻离心收集液体。

[0080] 表4反应液

[0081]成分 生物素标记反应
Nuclease‑free Water to 20μL
DNA template 1μL
10×Transcription Buffer 2μL
10mM ATP 1μL
10mM CTP 1μL
10mM GTP 1μL
10mM UTP 0.6μL
Labeled UTP 0.4μL
(T3,T7)Enzyme Mix 2μL

[0082] 备注：DNA template为步骤1获得的PCR产物。

[0083] 将混合后的产物37℃孵育1h，(可选)反应完毕后向混合液中加入1μL TURBO DNase，混合后37℃孵育30min；(可选)向混合液中加入1μL 0.5M EDTA。

[0084] 反应结束后对体外转录进行产物纯化，得到分离的RNA(SNHG17 RNA)，序列如SEQ ID No.1所示。

[0085] 实施例2

[0086] 本实施例提供一种体外转录合成分离的RNA的方法，其与实施例1具有部分制备方式的不同，具体如下。

[0087] 1.DNA模板制备

[0088] 通过实施例1中的SNHG17过表达质粒构建方法，得到SNHG17过表达质粒(LV012‑h‑SNHG17)。

[0089] 化学合成用于酶切的平末端PCR产物的引物对1，引物对1的序列如表5所示。

[0090] 表5引物序列

[0091]

[0092] 采用引物对1，以制备的SNHG17过表达质粒为模板进行PCR扩增，扩增时，要求引物不能磷酸化；选择平端的高保真DNA聚合酶Fast Pfu；为了保证扩增产物的完整性，扩增反
应需要5‑10min后延伸。反应结束后，电泳检测PCR产物的量和质量。如果扩增产物有多条
带，需凝胶回收目的片段。

[0093] PCR产物的电泳结果如附图3所示，PCR产物符合预期，SNHG17全长片段的PCR产物扩增成功。

[0094] 2.克隆反应体系

[0095] 将获得的SNHG17全长片段的PCR产物插入插入进商品化的T载体(pEASY‑Blunt Zero Cloning Vector，请参照附图4)中，具体包括以下步骤。

[0096] 向RNase‑Free微管中加入如表6所示的反应物，混合后，室温(20℃～37℃反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上。

[0097] 表6克隆反应体系

[0098]PCR产物 0.5‑4μL
pEASY‑Blunt Zero Cloning Vector 1μL
灭菌ddH2O 加至5μL

[0099] 克隆反应条件为：pEASY‑Blunt Zero Cloning Vector与PCR产物的摩尔比为1:7(如1Kb加20ng DNA)。载体的使用量为1μL，反应体系3‑5μL，体积不足时可以补充灭菌无酶
双纯水。克隆反应的时间约为10‑20min(SNHG17片段约2Kb)；克隆反应温度为25℃(如片段
是高GC含量，反应温度则为37℃)。

[0100] 将获得的连接产物与50μL Trans1‑T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)轻弹混匀，冰浴20‑30min；42℃水浴热激30sec，立即置于冰上2min；加250μL平
衡至室温的LB培养基，200rpm，37℃培养1h；取200μL菌液涂板，培养过夜(为得到较多克隆，
1500×g离心1min，弃掉部分上清，保留150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜)。

[0101] 克隆测序鉴定

[0102] 挑选5个白色单克隆分别至1mL LB培养基中，进行一代测序，保留符合测序结果的克隆菌，如图5所示，并提取质粒(p‑zero‑SNHG17质粒)。

[0103] 使用Not I限制性内切酶在T3启动子前位置将p‑zero‑SNHG17质粒线性化，得到SNHG17酶切产物正义链DNA(DNA模板，用于转录SNHG17RNA正义链产物)；使用Pst I限制性
内切酶在T7启动子前位置将p‑zero‑SNHG17线性化，得到SNHG17酶切产物反义链DNA(DNA模
板，用于转录SNHG17 RNA反义链产物)。

[0104] 然后，终止限制性内切酶反应：向酶切产物中加入1/20体积的0.5MEDTA；然后，依次加入1/10体积的3M醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀后‑20℃静置至少15min，离心去掉
上清，再离心去掉剩余的上清，使用dH2O或TE缓冲液重悬DNA pellet，浓度在1μg/μL(在其
他实施例中，可以在0.5‑1μg/μL)。

[0105] 加入Proteinase K 150μg/mL(在其他实施例中，可以在100‑200μg/mL内)和0.5％SDS，50℃，30min，苯酚/氯仿萃取、乙醇沉淀DNA，测浓度，‑80℃保存。

[0106] 3.RNA体外转录

[0107] RNA体外转录的步骤同实施例1中的体外转录步骤，区别在于将实施例1中的DNA模板替换为通过本实施例步骤2得到的DNA模板。最终得到体外转录的SNHG17 RNA。

[0108] 试验例1

[0109] 采用原位杂交的方式检测SNHG17 RNA在TNBC患者肿瘤组织中的过表达。

[0110] 1.原位杂交

[0111] 样本处理：本实施例以乳腺癌组织石蜡包埋样本为例。将组织样本新鲜取材置于4％多聚甲醛中固定浸泡过夜；取出标本PBS洗去固定液，切取厚度0.2cm左右样本进行脱
水。依次使用70％、80％、90％和95％乙醇进行脱水，每次浸泡60min，最后使用100％乙醇脱
水2次，每次浸泡60min。使用二甲苯进行组织透明化处理，浸泡2次，每次15min。100％乙醇
清洗15min。然后，60℃透蜡处理，后进行组织包埋，冷却后进行石蜡切片，切片厚度为8μm。

[0112] 探针制备：探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，5’端使用地高辛标记。探针序列为(5’‑3’):AGTCTCCCATGTCTGGACCCCGAATCTTG。

[0113] 原位杂交方法：将获得的样本处理补充得到的组织切片使用0.2N盐酸室温孵育5min。使用PBS洗3次，每次5min。40μg/ml蛋白酶K室温孵育20min，目的是降解组织切片中背
景蛋白。使用0.2％甘氨酸的PBS洗3次，每次5min。固定标本切片，室温孵育10min。使用PBS
洗2次，每次5min。醋酸酐和三乙醇胺溶液处理组织切片，室温孵育10min。PBS洗2次，每次
5min。在切片组织上滴入100μl预杂交液(无探针)，封口膜封住载玻片后置于湿盒中，37℃
预杂交2h，杂交液稀释的探针，终浓度为0.1‑0.2ng/μl，85℃变性5min，冷却后将杂交液‑探
针加入到切片组织上，密封，37℃杂交过夜。次日，将组织切片在5×SSC缓冲液中漂洗2次，
每次20min；随后用甲酰胺缓冲液37℃漂洗3次，每次20min；最后用TBST漂洗5次，每次
10min。

[0114] 将组织切片置于3％BSA中，室温封闭1h。加入抗地高辛一抗(1：1000)4℃孵育过夜；TBST洗漂洗4次，10min。BCIP/NBT染色液缓冲液洗涤2次，每次10min。BCIP/NBT暗处染色
4～48h。TE缓冲液(pH8.0)洗涤两次后终止反应。水洗残液，脱水、封片。

[0115] 倒置显微镜下观察，拍照。ISH使用碱性磷酸酶标记后显色阳性为蓝色。

[0116] 2.MDA‑MB‑231细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭实验方法

[0117] 细胞增殖的检测：分别在0h，12h，24h，48h和72h观察细胞增殖能力的变化。将96孔板置于培养箱内靠近水盘的位置以缓解蒸发，设置空白对照，每组设置5个复孔。在每个时
间点的每孔细胞中加入总体积10％的CCK‑8溶液，加完后需避光放置于37℃，5％CO2培养箱
中继续1‑4h。用酶标仪测定450nm处的吸光度值，记录。

[0118] 克隆形成能力的检测：细胞计数，重悬细胞，每组细胞以800个细胞分别接种于6孔板中，轻轻转动，使细胞分散均匀，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。培养1‑2周，观察培
养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃上清，PBS洗涤2次，加入4％多聚甲醛固定液固
定15‑20min。弃固定液，PBS洗2次，加入适量的0.1％结晶紫染色10‑20min。弃结晶紫液体，
PBS清洗直到肉眼可见每个孔中空白处，干燥。倒置显微镜观察及拍照，分析。

[0119] 迁移及侵袭能力的检测：准备24孔板，无基质胶的transwell小室用于检测细胞迁移，铺好基质胶的transwell小室用于检测细胞侵袭。取出放置37℃培养箱至30min。细胞计
数，无血清DMEM培养基重悬细胞，总体积200μl/孔，105个/200μl/孔细胞种24孔板。分别加
入750μl有血清的完全DMEM培养基。将transwell小室放置于第三排有血清的24孔孔室中，
37℃，5％CO2培养箱中孵育16‑24h。将培养板从培养箱中取出，移除培养基，预冷的PBS洗涤
两次，用枪头尽量吸净残余PBS液体。各组细胞室温孵育PBS稀释的3％的甲醛2min。移除甲
醛，PBS洗涤两次。100％甲醇进行细胞透化固定，室温孵育20min。移除甲醇，PBS洗涤两次，
0.1％结晶紫染色，室温孵育15min。PBS洗涤两次，用干净棉棒清除transwell内未侵袭过基
质胶的细胞。结晶紫染色洗涤后，晾干细胞，×200镜下计数迁移到小室底面的细胞。观察5
个高倍视野，计数迁移细胞平均数，每组实验设置3个复孔。

[0120] 结果如图6所示，与癌旁组织相比，乳腺癌组织中SNHG17高表达(附图中箭头所指的颗粒)。

[0121] 试验例2

[0122] 验证SNHG17 RNA对乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。

[0123] 增殖影响

[0124] 本试验例在乳腺癌细胞系MDA‑MB‑231的基础上建立对照组NC(过表达空质粒，pHBLV‑CMV‑MCS‑EF1‑Zsgreen1‑T2A‑puro)和SNHG17过表达(LV012‑h‑SNHG17)细胞模型(模
型构建方法参照实施例1)。

[0125] 使用qRT‑PCR方法检测细胞转染NC质粒和SNHG17过表达质粒后，SNHG17 RNA表达水平的变化，检测结果如图7中A所示，由图7中A可知，模型建立成功。

[0126] 随后，使用CCK8方法检测了MDA‑MB‑231增殖的变化，发现与NC组细胞相比，过表达SNHG17后，随着培养时间的延长，MDA‑MB‑231细胞增殖能力增强。此外，克隆形成实验也表
明，与NC组相比，过表达SNHG17后，MDA‑MB‑231细胞的克隆形成能力增强，如图7中B所示。

[0127] 迁移和侵袭的影响

[0128] 迁移和侵袭的影响结果请参照附图8，由图8可知，与NC组相比，过表达SNHG17后，MDA‑MB‑231细胞迁移能力和侵袭能力增强(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

[0129] 试验例3

[0130] 分析采用不同转录方法得到的(实施例1～2)SNHG17 RNA能够结合的蛋白。

[0131] 分别使用实施例1～2的方法分别进行SNHG17 RNA体外转录的DNA模板的制备，制备后进行电泳实验检测，检测结果如图9所示。

[0132] 由图9可知，1和2标记的泳道分别为实施例1中PCR扩增带有T3启动子(引物对2)的SNHG17 DNA模版(2158bp)和T7启动子(引物对3)的SNHG17 DNA模版(2158bp)，结果均符合
预期条带大小。

[0133] 图9中的3和4泳道分别为实施例2的p‑zero‑SNHG17质粒Not I酶切产物(6094bp)、p‑zero‑SNHG17质粒Pst I酶切产物(4937bp)，结果符合预期条带大小。图中5泳道为未进行
酶切处理的环状p‑zero‑SNHG17质粒，作为泳道3和4样品的对照组。

[0134] 将实施例2和3分别得到的DNA模板体外转录方式(实施例1～2)进行体外转录，得到SNHG17 RNA。

[0135] 结合蛋白筛选：

[0136] 1.MDA‑MB‑231细胞蛋白提取及RNA pull down实验

[0137] 分别使用生物素标记体外转录获得的SNHG17 RNA(实施例1～2的DNA模板转录的RNA)；3μg生物素标记的SNHG17 RNA 90℃热激2min；然后，用RNA structure buffer稀释样
品，将样品放置于冰上，冷却2min；再将样品放置室温20min，有利于样品RNA适当形成二级
结构(形成折叠的RNA)。

[0138] 培养并收集1×107个MDA‑MB‑231细胞，用细胞刮刮下或使用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞块；PBS洗2次后，向收集的细胞团块中加入2mL PBS、2mL nuclear isolation 
buffer和6mL ddH2O，震荡混匀，置于冰上20min；2500×g 4℃离心15min；收集细胞团块，使
用含有1mM PMSF和蛋白酶抑制剂的1mL RIP buffer重悬；细胞团块使用超声或持续冰上震
荡15‑20次以用来破碎细胞膜致完全裂解；裂解后，13000rpm 4℃离心10min；然后将折叠的
RNA与MDA‑MB‑231细胞核提取物裂解液在RIP缓冲液中混合，并在室温下孵育1小时。

[0139] 向各组裂解液中加入60μL Streptavidin agarose beads室温孵育1h；将含有beads的各组EP管放置于磁力架，吸附1min，弃上清；向beads中加入60μL 1×SDS loading 
buffer，99℃煮沸5min；分别取15μL样品进行SDS‑PAGE电泳检测分析。

[0140] 2.银染实验

[0141] 各组样品进行SDS‑PAGE电泳检测后，使用超纯水清洗SDS‑PAGE凝胶，清洗2遍；加入固定液，室温孵育15min，2次；乙醇清洗凝胶5min后，使用超纯水清洗2次；加入感光液孵
育1min，超纯水清洗2次；混合1％的银染增强液立即加入至凝胶中，孵育5min；超纯水快速
清洗凝胶20sec；立即加入显影液至凝胶，直至蛋白条带显色，约3min。结果如图10所示。

[0142] 图10中，1～5泳道分别代表MDA‑MB‑231核蛋白、p‑zero‑SNHG17 Pst I酶切产物(T7反义链)、p‑zero‑SNHG17 Not I酶切产物(T3正义链)、T7‑SNHG17反义链和T3‑SNHG17正
义链的结合蛋白。

[0143] 由附图10可知，与p‑zero‑SNHG17 T3正义链和p‑zero‑SNHG17 T7反义链结合MDA‑MB‑231核蛋白相比，T启动子PCR产物T3‑SNHG17正义链和T7‑SNHG17反义链结合MDA‑MB‑231
核蛋白明显增多，在25kD‑75kD蛋白区域电泳条带明显，而酶切产物结合的蛋白在此区域蛋
白丢失。

[0144] 因此，相比实施例2的方式，实施例1提供的制备DNA模板的方式转录的RNA能够结合更多的蛋白，即使用带有T启动子的PCR产物进行RNA pulldown实验可以检测到与SNHG17
作用更多的蛋白，有助于探索和研究SNHG17在乳腺癌中的功能及作用机制。

[0145] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。