可用于鉴别瘤牛和普通牛血统的基因组序列及其应用方法

摘要

本发明公开了可用于鉴别瘤牛和普通牛血统的基因组序列如SEQ ID NO.1和2所示，可用于鉴别瘤牛和普通牛以及有助于后期牛品种纯繁、改良和保种工作实施，瘤牛缺失SEQ ID NO.1基因组序列，普通牛正常；本发明还公开了鉴别瘤牛和普通牛的分子生物学方法，包括：1)从待鉴定牛的组织中分离提取DNA；2)用正向引物(SEQ ID NO.3)和反向引物(SEQ ID NO.4)进行PCR扩增；3)取扩增出的产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳；4)观察电泳结果，如果条带扩增如SEQ ID NO.2即可判断待鉴定牛为普通牛，否则为瘤牛。本发明基因组序列可以作为鉴定现有牛品种血统的有效靶点，用于鉴别瘤牛和普通牛，为牛品种的血统来源解析及杂交改良提供必要资源和方法，鉴别方法简便、准确、有效。

权利要求

1.序列如SEQ ID NO.1所示基因组序列在鉴别瘤牛和普通牛血统上的应用，瘤牛缺失所述基因组序列，普通牛正常；所述瘤牛指Nelore品种、Ndama品种和Muturu品种，所述普通牛指Holstein品种、Jersey品种、Angus品种和Hereford品种。

2.序列如SEQ ID NO.1所示基因组序列在牛品种纯繁、改良和保种上的应用，瘤牛缺失所述基因组序列，普通牛正常；所述瘤牛指Nelore品种、Ndama品种和Muturu品种，所述普通牛指Holstein品种、Jersey品种、Angus品种和Hereford品种。

3.序列如SEQ ID NO.2所示基因组序列在鉴别瘤牛和普通牛血统上的应用，瘤牛缺失所述基因组序列，普通牛正常；所述瘤牛指Nelore品种、Ndama品种和Muturu品种，所述普通牛指Holstein品种、Jersey品种、Angus品种和Hereford品种。

4.根据权利要求3所述基因组序列在鉴别瘤牛和普通牛血统上的应用，其特征在于：所述基因组序列用于鉴别瘤牛和普通牛血统时采用的PCR引物序列为：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。

5.一种鉴别瘤牛和普通牛血统的分子生物学方法，其特征在于：包括：

1）从待鉴定牛的组织中分离提取DNA；

2）以步骤1）DNA为模板，用一对引物：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示，通过聚合酶链式反应PCR扩增；

3）取适量步骤2）扩增出的产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳；

4）观察步骤3）电泳结果，如果在1092bp处出现扩增条带即可判断所述待鉴定牛为普通牛，如果未出现相应的扩增条带即可判断所述待鉴定牛为瘤牛；

所述瘤牛指Nelore品种、Ndama品种和Muturu品种，所述普通牛指Holstein品种、Jersey品种、Angus品种和Hereford品种。

6.根据权利要求5所述鉴别瘤牛和普通牛血统的分子生物学方法，其特征在于：步骤2）中所述PCR扩增采用降落PCR，PCR条件为：94 ℃预变性4分钟；94 ℃变性30s，68 ℃退火

30s，72 ℃延伸1min，以后每个循环依次降低1 ℃，共18个循环；94 ℃变性30s，50 ℃退火 

30s，72 ℃延伸1min，22个循环；72 ℃延伸10min。

说明书

可用于鉴别瘤牛和普通牛血统的基因组序列及其应用方法

技术领域

[0001] 本发明涉及物种鉴定和分子生物学领域，特别涉及可用于鉴别瘤牛和普通牛血统的基因组序列及其应用方法。

背景技术

[0002] 普通牛(Bos Taurus)和瘤牛(Bos Indicus)是牛主要的两个亚种，在世界现有牛存栏量中占据了90％以上，是世界牛奶和牛肉等重要的畜产品的主要来源，在世界养牛产
业中起到主导地位。普通牛和瘤牛在地理起源及养殖分布方面均存在明显差异。普通牛多
起源于欧洲，瘤牛则起源于印度等亚洲国家，也有研究报道非洲也是普通牛和瘤牛的起源
地。在地理分布方面，普通牛多生活在温度相对较低的北方区域，瘤牛则因其具有较强的耐
热和抗病等优良的特性，大部分分布在靠近赤道的炎热气候区域。在外部形态方面，瘤牛相
对普通牛具有更为明显的肩峰和垂皮。但由于人类的迁徙及牛品种之间的杂交和改良，出
现了大量同时拥有普通牛和瘤牛血统的牛品种，这种现象在我国尤为明显。

[0003] 牛种的保护、纯繁和杂交选育都需要清楚它们的遗传背景，特别是杂交个体很难通过外貌体型判别其血统来源。现有技术对牛属各家牛的鉴别主要是采用外貌鉴定和聚类
分析，前者是经验性的，不能确证，后者则需要专业的遗传多样性检测方法和复杂的聚类分
析方法，并且成本高，周期长。

[0004] 明确牛品种的血统组成是选择合适牛品种进行杂交改良、提高经济性能的前提条件。我国地方牛品种至少有53个，但普通牛和瘤牛的血统组成目前还不清楚，并且多元化的
品种间杂交模式已在各地形成。前期对普通牛和瘤牛的研究多集中在解析其起源进化的关
系以及对影响经济性状的变异位点挖掘等工作，对建立可以鉴定普通牛和瘤牛的血统的方
法很少报道。利用两个牛亚种基因组序列的差异，可以构建特定的PCR鉴别体系。在基因组
中存在多种遗传变异，包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)、插
入缺失(Insert and deletion，Indel)、微卫星、拷贝数变异(copy number variation，
CNV)等。CNV是在群体基因组上长度为50bp‑5Mbp的大片段变异，在基因组上分布广泛，其相
对其它基因组变异类型对表型的调控效应更为剧烈，在品种间更为保守；并且由于其为大
片段的变异，在一定程度上代表了不同牛亚种或品种间的差异基因组序列。CNV对结果的判
断更为准确，假阳性出现率更低，扩增更方便，可以较为稳定地作为鉴定牛品种或血统的靶
标。

[0005] 发明人早期利用高密度芯片对普通牛群体和瘤牛群体的基因组CNV(Copy Number Variation，拷贝数变异)进行比较，发现了瘤牛群体中存在一段高频率的54kbp的缺失，但
未针对该区域建立瘤牛和普通牛的鉴别方法。中国专利授权公告号CN101798598公开了一
组鉴别牛属各家牛的母系遗传标记，在普通黄牛的母系遗传标记的该专利序列表SEQID 
No.1所示的核苷酸序列第249bp处有一个缺失突变，记为gap249，为普通黄牛特异缺失遗传
标记；在瘤牛的母系遗传标记的该专利序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列第191bp处有
一个缺失突变，记为gap191，为瘤牛特异缺失遗传标记。该专利还公开了一种鉴别牛属各家
牛及其杂交个体的方法，从待鉴别牛种的牛血液提取牛基因组DNA，用正向引物(见该专利
序列表SEQ ID No.5所示)和反向引物(见该专利序列表SEQ ID No.6所示)在所提取的牛基
因组DNA中进行PCR扩增，PCR产物纯化回收并测序；测定的序列与母系遗传标记的序列进行
序列比对，用母系遗传标记含有的特异缺失遗传标记对待测个体的母系遗传背景进行鉴
别，从母系来源看，含特异缺失gap249的待测个体为普通黄牛，含特异缺失gap191的待测个
体为瘤牛。但是该方法鉴定普通黄牛和瘤牛是基于小片段基因组序列的缺失，相对大片段
基因组序列的缺失鉴别对条件要求更为苛刻，更容易出现假阳性，并且还需进一步测序和
序列比对才能得出结论，相对比较复杂。目前基于基因组大片段序列差异来鉴定普通牛和
瘤牛血统的方法还未见报道。

[0006] 本发明利用二代高通量测序数据，从全基因组范围内检测普通牛和瘤牛群体基因组序列的CNV分布，通过Fst鉴定两个亚种间差异的CNV，利用二代高通量测序数据中reads
(测序读长)在差异CNV区域的分布来对差异CNV进行初步验证，并用PCR方法进一步验证该
差异基因组序列的存在，同时构建可用于鉴定普通牛和瘤牛亚种和鉴定含有普通牛血统的
有效检测方法，为牛品种的血统来源解析及后续的杂交改良提供必要资源和方法。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供可用于鉴别瘤牛和普通牛血统的基因组序列，利用该基因组序列可实现瘤牛和普通牛血统的鉴定，也可以应用于牛品种纯繁、改良和保种。

[0008] 本发明还提供了鉴别瘤牛和普通牛血统的分子生物学方法，利用该方法可以简便、准确地对瘤牛和普通牛进行鉴定。

[0009] 为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0010] 一种可用于鉴别瘤牛和普通牛血统的基因组序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，此基因组序列为瘤牛和普通牛的差异基因组序列，可应用于鉴别瘤牛和普通牛血统。

[0011] 上述基因组序列在鉴别瘤牛和普通牛血统上的应用，瘤牛缺失所述基因组序列，普通牛正常。

[0012] 上述基因组序列在牛品种纯繁、改良和保种上的应用。

[0013] 一种可用于鉴别瘤牛和普通牛血统的基因组序列，其序列如SEQ ID NO.2所示，此基因组序列为鉴别瘤牛和普通牛血统所设计的人工序列，是针对普通牛基因组序列进行
PCR扩增后得到的序列。

[0014] 更进一步地，SEQ ID NO.2所示基因组序列的PCR引物序列为：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。

[0015] 一种鉴别瘤牛和普通牛的分子生物学方法，包括：

[0016] 1)从待鉴定牛的组织中分离提取DNA；

[0017] 2)以步骤1)DNA为模板，用一对引物：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示，通过聚合酶链式反应PCR扩增，扩增片段长度为1092bp，如SEQ ID NO.2
所示；

[0018] 3)取适量步骤2)扩增出的产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳；

[0019] 4)观察步骤3)电泳结果，如果条带扩增为如SEQ ID NO.2所示即可判断所述待鉴定牛为普通牛，如果没有扩增为如SEQ ID NO.2所示即可判断所述待鉴定牛为瘤牛。

[0020] 更进一步地，步骤2)中所述PCR扩增采用降落PCR，PCR条件为：94℃预变性4分钟；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，以后每个循环依次降低1℃，共18个循环；94℃
变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，22个循环；72℃延伸10min。

[0021] 本发明的有益效果在于：本发明基因组序列可以作为鉴定现有牛品种血统的有效靶点，用于鉴别瘤牛和普通牛的血统，为牛品种的血统来源解析及后续的杂交改良提供必
要资源和方法，鉴别方法简便、准确、有效。

附图说明

[0022] 图1是IGV软件对基因组数据可视化检验结果图；

[0023] 图2是4个品种22头普通牛和3个品种13头瘤牛PCR扩增产物琼脂糖电泳图。

具体实施方式

[0024] 以下实施例用于进一步说明此发明，但是不应理解为是对本发明的限制，在不违背本发明的实质和精神的前提下，任何对本发明所做的优化和替换，均属于本发明的范畴。

[0025] 若未特别声明，下列实施例中涉及的技术手段均为本科学领域技术人员普遍使用的常规技术。

[0026] 1、二代高通量测序检测CNV

[0027] 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站中检索下载获得32头普通牛(Bos Taurus)和34头瘤牛(Bos Indicus)的二代测序数据，结合发明人已有的7头普通牛二代高
通量测序数据，一共73头牛的二代高通量测序数据。

[0028] 73头牛包括4个品种39头普通牛和6个品种34头瘤牛，具体品种信息如下：

[0029] 普通牛：Muturu品种3头、N’dama品种4头、Hereford品种12头、Angus品种20头；

[0030] 瘤牛：Gir品种3头、Nelore品种6头、Ogaden品种7头、Boran品种7头、Kenana品种7头、Brahman品种4头。

[0031] 使用牛基因组(ARS‑UCD 1.2)作为参考基因组，将以上二代高通量测序数据分别映射到该参考基因组，根据每个个体reads的分布情况利用LUMPY(https://github.com/
arq5x/lumpy‑sv/)软件和CNVnator(https://github.com/abyzovlab/CNVnator/)软件进
行CNV检测，其中LUMPY通过PEM(Pair End Mapping)和SR(Split Reads)的策略确定CNV的
变异类型和断点，CNVnator使用RD的策略对CNV进行拷贝数估计。综合二者结果并质控之后
获得最终的CNV信息。

[0032] 2、CNV的FST分析

[0033] 将以上CNV信息根据个体、突变位置进行合并，合并之后将重叠部分的CNV切割为小的CNV片段，使用拷贝数作为观测值，将其分为n＝0,1,2,3,4五类，使用如下公式计算每
个片段的拷贝数在普通牛群体和瘤牛群体中的差异程度：

[0034]

[0035]

[0036]

[0037] 其中Pi为总体的拷贝数分布频率，Pj为亚群占总体个体数的比例，Pij为亚群的拷贝数分布频率，Ht为总体实际拷贝数分化程度，Hs为亚群预计拷贝数分化程度，Fst为亚群间
拷贝数分布分化程度。

[0038] 本实验将总体分为普通牛和瘤牛两个亚群，因此m＝2，n＝5。参考基因组的chr7:50070412‑50072341片段(基因组序列如SEQ ID NO.1所示)在普通牛群和瘤牛群中分化最
为明显，其中Ht＝0.535,Hs＝0.078,Fst＝0.854。

[0039]

[0040] 3、二代高通量测序数据与参考基因组比对的IGV可视化验证

[0041] 如图1所示，通过IGV(https://github.com/igvteam/igv)软件对基因组数据进行可视化检验可知：在片段(chr7:50070412‑50072341)内，瘤牛基本无reads映射到该位置，
而普通牛中大部分均有数量正常的reads映射到此处，说明在瘤牛中缺失了该区间的基因
组序列，该区间基因组序列如SEQ ID NO.1所示。

[0042] 4、PCR验证和鉴定方法的构建

[0043] 从血液或精液样品中提取出不同品种的基因组DNA。根据牛基因组的最新版本(ARS‑UCD1.2)设计了如下引物(正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所
示)，引物扩增片段长度为1092bp，如SEQ ID NO.2所示。

[0044] 根据Taq DNA聚合酶制造商的规程(Taq PCR Master Mix Kit，Qiagen，Hilden，德国)，以50μL反应体积进行PCR扩增，并在bioRad MyIQ热循环仪上扩增基因组DNA。目标区域
扩增的PCR循环如下：94℃预变性4分钟；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，以后每
个循环依次降低1℃，共18个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，22个循环；72
℃延伸10min。所有扩增的产物均在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，如图2所示。

[0045] 使用以上PCR方案检查4个品种22头普通牛(6头Holstein品种，4头Jersey品种，6头Angus品种，6头Hereford品种)和3个品种13头瘤牛(6头Nelore品种，3头Ndama品种，4头
Muturu品种)CNV的存在。结果表明，所有瘤牛均为缺失状态，而普通牛则是正常的，此可以
支持在基因组测序分析中的观察。

[0046] PCR验证结合二代高通量测序数据，共检测了6个品种61头普通牛和8个品种47头瘤牛，这些品种基本代表了主流的普通牛和瘤牛，具有品种广泛性，其差异性CNV的存在可
以用来说明普通牛和瘤牛两个群体遗传背景上的差异，检测CNV的存在与否可以用来鉴别
普通牛和瘤牛。

[0047] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或
变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或
变动仍处于本发明创造的保护范围之中。