解毒药物组合物及其用途转让专利
申请号 : CN202010148668.6
文献号 : CN111467476B
文献日 : 2021-07-27
发明人 : 王宏伟 , 其他发明人请求不公开姓名
申请人 : 山东农之安生物科技有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种解毒药物组合物,其特征在于,包含去环氧基活性多肽或其编码核酸和可选的药物学可接受载体,所述活性多肽能够使单端孢霉烯族毒素与谷胱甘肽催化反应产生谷胱甘肽化衍生物,从而去除引起毒素毒性的环氧基;
其中,所述活性多肽由选自由下述(1)或(2)组成的组中的一种氨基酸序列组成:(1) SEQ ID No:1‑35所示的氨基酸序列;
(2)与SEQ ID No:1‑2所示的氨基酸序列的序列同一性为97%以上、且来源于长穗偃麦草、且在第92~110位之间的氨基酸序列和第144~184位之间的氨基酸序列保守且仍具有原酶活性的氨基酸序列;或与SEQ ID No:25‑35所示的氨基酸序列的序列同一性为97%以上、且来源于对应的香柱菌相同物种、且在第92~110位之间的氨基酸序列和第144~184位之间的氨基酸序列保守且仍具有原酶活性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的解毒药物组合物,其特征在于,所述活性多肽的序列为由源自(1)所述氨基酸序列N端的至少209个氨基酸组成,且仍具有原多肽活性。
3.根据权利要求1或2所述的解毒药物组合物,其特征在于,进一步包含谷胱甘肽。
4.一种用于预防体外细胞中毒或解除体外细胞毒性的方法,其特征在于,包括使待处理细胞与去环氧基活性多肽或及编码核酸,或产生该活性多肽的细胞和可选的谷胱甘肽接触的步骤,其中所述待处理细胞为体外细胞;
其中,所述活性多肽由选自由下述(1)或(2)组成的组中的一种氨基酸序列组成:(1) SEQ ID No:1‑35所示的氨基酸序列;
(2)与SEQ ID No:1‑2或25‑35所示的氨基酸序列的序列同一性为97%以上、且来源于长穗偃麦、且在第92~110位之间的氨基酸序列保守且仍具有原酶活性的氨基酸序列;或与SEQ ID No:25‑35所示的氨基酸序列的序列同一性为97%以上、且来源于对应的香柱菌相同物种、且在第92~110位之间的氨基酸序列和第144~184位之间的氨基酸序列保守且仍具有原酶活性的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述待处理细胞为体外动物细胞,产生去环氧基活性多肽的细胞为酵母细胞。
6.去环氧基活性多肽在制备用于减轻或缓解单端孢霉烯族毒素引发的病况的药物中的用途,其中,所述活性多肽由选自由下述(1)或(2)组成的组中的一种氨基酸序列组成:(1) SEQ ID No:1‑35所示的氨基酸序列;
(2)与SEQ ID No:1‑2或25‑35所示的氨基酸序列的序列同一性为97%以上、且来源于长穗偃麦草、且在第92~110位之间的氨基酸序列和第144~184位之间的氨基酸序列保守且仍具有原酶活性的氨基酸序列;或与SEQ ID No:25‑35所示的氨基酸序列的序列同一性为
97%以上、且来源于对应的香柱菌相同物种、且在第92~110位之间的氨基酸序列和第144~
184位之间的氨基酸序列保守且仍具有原酶活性的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,所述病况包括食欲减退、胃肠炎症、出血、呕吐、腹泻、坏死性皮炎、运动失调、血凝不良、贫血和白细胞数量减少、免疫机能降低和流产。
说明书 :
解毒药物组合物及其用途
技术领域
背景技术
族毒素主要存在于由上述细菌污染的食品、饲料及其加工物中,例如大麦、小麦、燕麦、玉米
等谷物。
等,严重威胁人畜健康。过量摄入时则容易导致严重疾病甚至死亡。
衍生物,去环氧基后的衍生物毒素消除。然而目前并没有基于去环氧基解毒的有效药物。分
离出可高效对单端孢霉烯族毒素去环氧基的基因或酶,并由此制成药物,有望提供解毒的
有效方案。遗憾的是,目前尚未报道有明确的基因或蛋白可通过去环氧基催化单端孢霉烯
族毒素进行解毒。
发明内容
体地,本发明包括以下内容。
(GSH)催化反应产生GSH化衍生物,从而去除毒素中的环氧基。
ID No.:3‑24表示已验证具有原活性的SEQ ID No.:1的突变体序列,SEQ ID No.:25‑35表
示来源于香柱菌属 的不同物种的氨基酸序列。
基酸序列;进一步优选这些序列组成的多肽仍具有原蛋白酶活性。在某些实施方案中,活性
多肽的氨基酸序列与(1)中的氨基酸序列的序列同一性为95%以上,且均来源于香柱菌属。
酸序列,此处的氨基酸突变包括氨基酸的插入、缺失或替换。
述的氨基酸序列N端的部分连续序列,例如,具有从N端起前200至前250个氨基酸序列的多
肽,例如具有N端起前208个氨基酸序列的多肽,或具有从N端起前242个氨基酸序列的多肽。
在某些实施方案中,部分连续序列为第92‑110位之间的氨基酸序列或第144‑184位之间的
氨基酸序列,或者两者的组合。
强多肽表达或分泌的序列,其实例包括但不限于引导肽、信号肽和转动肽。在某些实施方案
中,活性多肽为全长蛋白的活性片段与其他氨基酸序列的嵌合多肽,其中其他氨基酸序列
为对应于该活性片段之外的来源于同源的其他蛋白的序列,例如结构区或功能区的序列。
例如,当来源于某物种中的蛋白酶全长由A+B两部分组成,与其相同属但不同物种的另一同
源蛋白酶全长对应的由A’+B’两部分组成,且A与A’为同源对应区域,B与B’为同源对应区域
的情况下,嵌合多肽可以由A’+B或A+B’组成。在某些实施方案中,其他氨基酸序列包含非功
能序列,例如连接臂或间隔序列。在某些实施方案中,其他氨基酸序列为具有独立功能的多
肽,其通过非功能序列,例如连接臂或间隔序列与本发明的活性多肽连接。
0.8‑0.2mol/L,更优选0.9‑0.15mol/L。
在此情况下,本发明的解毒药物组合物还可包含用于维持细胞活性的成分。此的细胞组分
是指将包含本发明的活性多肽的细胞裂解得到的混合物或由此类细胞分泌得到的混合物。
接受载体的实例包括但不限于:(1)磷酸缓冲盐溶液,pH约7.4,包含或不包含大约1mg/ml到
25mg/ml人血清白蛋白;(2)0.9%盐水(0.9%w/v氯化钠),(3)5%(w/v)葡萄糖;也可以包含
抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如Tween20。
兴趣组织中,可选地经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行施用。这样的
施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是,本文有待施用的实际剂
量可以在很大程度上取决于多种因素而变化,如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者
的一般状况、给药途径、给药方式等等。
骤。
序列:
附图说明
OD450nm。
子模式提取到DON‑GSH加合物,m/z 604.21730(对应于[M+H],Δ±5ppm)。
具体实施方式
间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围
内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立
地包括或排除在范围内。
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所
有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的
文献冲突时,以本说明书的内容为准。除非另有说明,否则“%”为基于重量的百分数。
然存在的氨基酸聚合物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物及其天然存在的化学衍生
物。此类化学衍生物包括例如翻译后修饰和降解产物,包括焦谷氨酰、异天冬氨酰、蛋白水
解的、磷酸化的、糖基化的、氧化的、异构化的和脱氨基化的变体。
一性在核苷酸水平下的量度。蛋白质序列同一性可以在比对序列时通过比较每个序列中的
给定位置的氨基酸序列来确定。类似地,核酸序列同一性可以在比对序列时通过比较每个
序列中的给定位置的核苷酸序列来确定。用于比对用以比较的序列的方法为本领域熟知
的,此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。BLAST算法计算序列同一性百分比
并且对两个序列之间的相似性执行统计分析。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物
技术信息中心(NCBI)网站公开获得。
明确说明。
族毒素具有下述通式(II)所示的结构:
氢原子、=O、羟基或由‑OCO‑R”表示的酯基,其中R”为直链或支链C1‑C10烷基,优选为CH3、
CH2CH3,还优选为直链或支链C3‑C8烷基,更优选CH2CH(CH3)2。在某些实施方案中,本发明的
单端孢霉烯族毒素包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、15‑乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15‑
ADON)、3‑乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3‑ADON)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、镰刀菌烯酮‑X(Fus‑
X)、二乙酰氧基草镰刀菌烯醇(DAS)、T‑2毒素(T‑2)、HT‑2毒素(HT‑2)。
0.5mg/ml单端孢霉烯族化合物(DON、3DON、15ADON、FUS‑X、NIV、T2、H‑T2、DAS):1mg单端孢霉
烯族化合物,加蒸馏水至2ml,过滤灭菌。
用Thermo Scientific Q Exactive 组合型四级杆Orbitrap质谱仪。UHPLC系统与配备有
电喷雾电离(ESI)源的Orbitrap联用。色谱法在反相XBridge C18,内径150×2.1mm,粒径
3.5μm(Waters,Dublin,Ireland)上进行,柱温:35℃。流速为300μLmin‑1,进样量3μL。使用
U3000液相色谱仪,流动相:A:0.1%乙酸水溶液,B:乙腈;洗脱梯度:0‑0.2min,A=90%;
0.2‑6min,A递减至10%;6~8min,A=10%;8.1min,A递增至90%;8.1~10min,A=90%。
细管温度为350℃。将AGC target设置为2×e5。负离子模式的ESI接口设置为2.9kV;鞘气,
4;辅助气体,0。该模式分辨力设置为70,000。
辨率设置为17500。
辨力设置为17500。采用归一化碰撞能,所施加的碰撞能量(15、30和45eV)取决于具体分析
物。
(EIC)进行了研究。根据二级图谱以及物质基本结构解析中性丢失,推测化学结构。
‑
355.13984(对应[M+CH3COO] 形式,Δ±5ppm);正离子模式提取到DON‑GSH加合物,m/
+
z604.21707(对应于[M+H],Δ±5ppm)。
产生的子离子质谱图,[M+H] (m/z 604.21707,Δ±5ppm)。通过对带正电([M+H])的离子进
行靶向HRMS2分析,研究了DON‑GSH环氧加合物的MS片段。DON‑GSH的离子碎裂产生m/z
+
299.0939的特征离子,对应于C14H19O5S 。该特征离子可归因于在C‑6处侧链的裂解和除S以
+
外GSH部分的损失。该片段还可以进一步裂解产生m/z281.08482(C14H17O4S),263.07425
+ +
(C14H15O3S)和231.10218(C14H15O3)。m/z 263.07425处的产物离子是HRMS2质谱图的基峰,
该产物离子在m/z 299.0939的基础上脱去两分子H2O。
得到损失脱水谷氨酸的碎片离子475.17466(C20H31O9N2S )。损失了C‑6处侧链的m/
+
z574.20717(C24H36O11N3S)离子碎片从其GSH部分损失脱水谷氨酸可得到m/z445.16389的特
+ +
征离子(C19H29O8N2S);也可得到脱去谷氨酰胺的428.13733(C19H26O8NS)。
谷氨酸得到m/z 179.04907(C5H11O3N2S);损失谷氨酰胺得到m/z162.02251(C5H9O3NS)。此
+ +
外,m/z130.05044(C5H8O3N)、m/z145.06077(C5H9O3N2)的产物离子均与GSH相关。
‑
397.15041(对应[M+CH3COO] 形式,Δ±5ppm);正离子模式提取到3‑ADON‑GSH加合物,m/z
+
646.22764(对应于[M+H],Δ±5ppm)。
碰撞解离产生的子离子质谱图,[M+H]+(m/z 646.22764,Δ±5ppm)。对带正电([M+H])的
3‑ADON‑GSH环氧加合物离子进行靶向HRMS2分析:3‑ADON‑GSH的离子碎裂会产生m/z
+
323.09539的特征离子,对应于C16H19O5S。该特征离子可归因于在C‑6处连接的侧链的裂解、
脱水以及除S以外GSH部分的损失。该片段还可以进一步裂解产生m/z,263.07425(C14H15O3S
+ +
)和231.10218(C14H15O3)。m/z 263.07425处的子离子是HRMS2质谱图的基峰,该产物离子是
在m/z 323.09539离子的基础上于C‑3处脱去CH3COOH。
6处侧链进一步断裂可产生的m/z 541.18503(C24H33O10N2S)的碎片离子;脱去1分子H2O的碎
+ +
片离子m/z 628.21707(C27H38O12N3S)损失甘氨酸可得到m/z 553.18503(C25H33O10N2S);损
+
失脱水谷氨酸可得到499.17466(C22H31O9N2S)。
‑
EIC,m/z 397.15041(对应[M+CH3COO]形式,Δ±5ppm);正离子模式提取到15‑ADON‑GSH加
+
合物,m/z 646.22764(对应于[M+H],Δ±5ppm)。
撞解离产生的子离子质谱图,[M+H]+(m/z 646.22764,Δ±5ppm)。通过对带正电([M+H])
的离子进行靶向HRMS2分析,研究了15‑ADON‑GSH环氧加合物的MS片段。15‑ADON‑GSH的离子
+
碎裂产生m/z 311.09475的特征离子,对应于C15H19O5S。该特征离子可归因于在C‑15处连接
的侧链CH3COOH的裂解和除S以外GSH部分的损失。
(C25H35O11N2S)。脱去1分子H2O的m/z 628.21707(C27H38O12N3S )损失甘氨酸可得到m/z
+ +
553.18503(C25H33O10N2S)。损失脱水谷氨酸的可得到m/z 499.17466(C22H31O9N2S)。
(C15H19O5S )的碎片离子;特征离子m/z 450.15471(C17H28O9N3S )损失甘氨酸得到m/z
+ +
375.12267(C15H23O7N2S)子离子,损失脱水谷氨酸得到m/z 321.1121(C12H21O6N2S),此外该
+
离子还可以脱去两分子H2O,形成子离子m/z 414.13295(C17H24O7N3S),该特征离子损失甘氨
+ +
酸可得到m/z 339.10091(C15H19O5N2S),损失脱水谷氨酸得到m/z 285.09035(C12H17O4N2S)。
+
该片段进一步脱水还可以产生m/z 267.07979(C12H15O3N2S)。与GSH相关的m/z 145.06077
+
(C5H9O3N2,Δ±5ppm)特征离子是质谱图的基峰。
谱图EIC,m/z 371.13366(对应[M+CH3COO] 形式,Δ±5ppm);正离子模式提取到NIV‑GSH加
+
合物,m/z 620.21199(对应于[M+H],Δ±5ppm)。
产生的子离子质谱图,[M+H] (m/z 620.21199,Δ±5ppm)。通过对带正电([M+H])的NIV‑
GSH环氧加合物离子进行靶向HRMS2分析,研究其MS片段。NIV‑GSH的离子碎裂产生m/z
+
229.08652的产物离子,对应于C14H13O3 。该产物离子可归因于在C‑6处侧链的裂解、3分子
H2O的断裂以及GSH部分的损失,该结构保留NIV的基本骨架。
损失脱水谷氨酸的子离子491.16938(C20H31O10N2S)。C‑6处侧链断裂后形成m/z 590.20142
+
(C24H36O12N3S ),该离子的GSH部分损失脱水谷氨酸可得到m/z 461.15881的子离子
+
(C19H29O9N2S)。
水谷氨酸得到m/z 179.04907(C5H11O3N2S),该离子是HRMS2质谱中最突出的产物离子。此
+ +
外,子离子m/z 130.05044(C5H8O3N)和子离子m/z 145.06077(C5H9O3N2)均与GSH相关。
+
377.12069(对应[M+Na] 形式,Δ±5ppm);正离子模式提取到Fus‑X‑GSH加合物,m/z
+
662.22255(对应于[M+H],Δ±5ppm)。
解离产生的子离子质谱图。通过对带正电([M+H] )的FusX‑GSH环氧加合物离子进行靶向
HRMS2分析,研究其MS片段。FusX‑GSH的离子碎裂产生m/z 297.07973的产物离子,对应于
+
C14H17O5S 。该产物离子可归因于在C‑4处侧链的裂解、C‑6处侧链的裂解及除S以外的GSH部
分的损失,该结构仅仅保留Fus‑X的基本骨架。
侧链断裂后形成m/z 632.21198(C26H38O13N3S)的特征离子损失脱水谷氨酸可得到m/z
+ +
503.16937(C21H31O10N2S)的子离子,损失谷氨酰胺可以得到m/z 486.14281(C21H28O10NS)。
+
其中m/z 503.16937(C24H36O12N3S)的子离子是HRMS2质谱中最突出的产物离子。
水谷氨酸得到m/z 179.04907(C5H11O3N2S),此外,子离子m/z 130.05044(C5H8O3N)和子离
+
子m/z 145.06077(C5H9O3N2)均与GSH相关。
+ +
应[M+Na]形式,Δ±5ppm);DAS‑GSH加合物,m/z 674.25894(对应于[M+H],Δ±5ppm)。
产生的子离子质谱图,[M+H] (m/z 674.25894,Δ±5ppm)。通过对带正电([M+H])的离子进
行靶向HRMS2分析,研究DAS‑GSH环氧加合物的MS片段。DAS‑GSH的离子碎裂产生m/z
+
229.12231的产物离子,对应于C15H17O2 。该产物离子可归因于C‑4、C‑15处连接的侧链
CH3COOH的裂解、脱水以及GSH部分的损失。
氨酰胺,可得到m/z 528.18977(C24H34O10NS)的子离子;也可得到损失脱水谷氨酸的子离子
+ +
545.21633(C24H37O10N2S);损失了CH3COOH可得到m/z 614.23781(C27H40O11N3S)的特征离子。
162.02251(C5H9O3NS)、m/z 179.04907(C5H11O3N2S)子离子中,失去脱水谷氨酸m/z的特征
+
离子在179.04907处(C5H11O3N2S)是质谱图的基峰。
(对应[M+Na]+形式,Δ±5ppm);HT‑GSH的加合物,m/z 732.30080(对应于[M+H]+,Δ±
5ppm)。
撞解离产生的子离子质谱图,[M+H] (m/z 732.30080,Δ±5ppm)。通过对带正电([M+H])的
HT‑GSH环氧加合物离子进行靶向HRMS2分析,研究其MS片段。HT‑GSH碎裂产生m/z
+
295.10048的产物离子,对应于C15H19O4S。该产物离子可归因于C‑8处((CH3)2CHCH2COOH)的
断裂,C‑15处CH3COOH的裂解、除S以外GSH部分的损失,该结构保留了HT‑2的基本骨架。而m/
+
z 274.10335是[M+H]形式的GSH的—SH键断裂,形成H2S的中性丢失所致。
离子,该离子损失甘氨酸可得到m/z 495.18022(C23H31O8N2S);损失脱水谷氨酸可得到m/z
+ +
441.16965(C20H29O7N2S);损失谷氨酰胺可得到m/z 424.14309(C20H26O7NS)的碎片离子。m/
z 441.16965处是质谱图的基峰。
m/z 162.02251(C5H9O3NS)、m/z 179.04907(C5H11O3N2S)离子。
+ +
应[M+Na]形式,Δ±5ppm);T2‑GSH的加合物,m/z 774.31136(对应于[M+H],Δ±5ppm)。
解离产生的子离子质谱图,[M+H] (m/z 774.31136,Δ±5ppm)。通过对带正电([M+H])的
T2‑GSH环氧加合物离子进行靶向HRMS2分析,研究其MS片段。T2‑GSH碎裂产生m/z
+
337.11105的产物离子,对应于C17H21O5S。该产物离子可归因于C‑8处、C‑15处所连接侧链的
+
断裂、除S以外GSH部分的损失,该结构保留了T‑2的基本骨架。而m/z 274.10335是[M+H] 形
式的GSH的‑SH键断裂,形成H2S的中性丢失所致。
离子,是质谱图的基峰。该离子损失甘氨酸可得到m/z537.19079(C25H33O9N2S);损失脱水谷
+ +
氨酸可得到m/z 483.18022(C22H31O8N2S);损失谷氨酰胺得到m/z 466.15366(C22H28O8NS)
的碎片离子。
(C5H9O3N2)、m/z 162.02251(C5H9O3NS)、m/z 179.04907(C5H11O 3N2S)离子。
成破坏了在单端孢霉烯的毒性中起主要作用的环氧环结构,可以大大降低毒素的毒性。
及人正常食管上皮细胞(HEEC),待细胞长至瓶壁80%~90%,每2~3d传代一次,用胰蛋白
酶消化收集细胞并传代,根据细胞生长状态,选取对数生长期细胞进行实验。
的单端孢霉烯族化合物对细胞均具有较大毒性;而单端孢霉烯族化合物DON、3‑ADON、15‑
ADON、FUS‑X、NIV、T‑2、HT‑2、DAS经反应后产生的相应衍生物,在对应相同的浓度下细胞活
力与空白对照基本一致,说明8种单端孢霉烯族化合物相应的谷胱甘肽加合物对细胞基本
没有毒性作用。
菌属存在同源基因的信息,发明人联合搜索了其他实验室的基因组数据库,获得了
11条来源于该菌属的序列。如图10所示,这些序列与长穗偃麦草十倍体的去环氧基酶基因
具有90%以上的序列同一性。另外,发明人还从长穗偃麦草二倍体中分离得到与十倍体的
去环氧基酶基因的序列同一性为98%的基因。这些基因编码的多肽序列如SEQ ID No.:2和
25‑35所示。
25ml的BMGY培养基,28℃~30℃培养至OD600为2~6。室温离心弃去上清,收集细胞,用BMMY
液体培养基重悬细胞至OD600=1左右,转移至500ml的锥形瓶中,28℃~30℃培养,每24h向
其中加入甲醇至终浓度为0.5%以保持诱导表达。在诱导48h后,分装菌液5ml到15ml离心管
中,并向其中加入多种单端孢霉烯族化合物至终浓度为25μg/ml,继续诱导48h~72h,收集
菌体,用于LC‑HRMS分析。
HRMS(方法1)DON处理转基因酵母提取的离子色谱图,正离子模式提取到DON‑GSH加合物,m/
+
z 604.21730(对应于[M+H],Δ±5ppm)。
酸序列的多肽片段。
示。
失。因此,表明该酶的功能结构域主要是N端。
施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构
与功能。