一种产β-葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌与应用

摘要

本发明属于工业微生物技术领域，涉及一种产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌与应用。本发明公开了一种产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)GXDK6，于2018年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16007。本发明所提供的菌株是首次报道的产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌株。本发明所提供的季也蒙毕赤酵母可利用五碳糖、六碳糖为唯一碳源产β‑葡萄糖苷酶。本发明所提供的季也蒙毕赤酵母可长时间发酵产香。本发明所提供的季也蒙毕赤酵母可利用有机质，耐盐，可以耐受高浓度重金属并有效的吸附重金属，并能够适应广泛的pH范围，扩大了产β‑葡萄糖苷酶的环境条件。

权利要求

1.一种产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)，其命名为季也蒙毕赤酵母GXDK6，于2018年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16007。

2.权利要求1所述的产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌作为发酵菌种制备β‑葡萄糖苷酶的应用。

3.根据权利要求2所述的产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌作为发酵菌种制备β‑葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述应用包括将季也蒙毕赤酵母菌接种至培养基中进行发酵的步骤，所述培养基含有唯一或两种以上的碳源。

4.根据权利要求3所述的产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌作为发酵菌种制备β‑葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述的碳源为五碳糖、六碳糖、麸皮、木薯粉、甘蔗渣、蔗糖、棉子糖、菊粉、麦芽糖、D‑海藻糖、木聚糖、纤维素、纤维二糖、乙醇、琥珀酸中的任意一种，所述的五碳糖为L‑阿拉伯糖或D‑木糖，所述的六碳糖为葡萄糖、D‑甘露糖、D‑甘露醇、D‑果糖、D‑山梨醇、L‑鼠李糖、L‑山梨糖或D‑半乳糖中的任意一种。

5.根据权利要求3所述的产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌作为发酵菌种制备β‑葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述培养基为YPD培养基或GBM培养基。

6.根据权利要求3所述的产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌作为发酵菌种制备β‑葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述菌种分别接种至含有麸皮、木薯粉、甘蔗渣或葡萄糖唯一碳源培养基，于pH 3.5条件下发酵2天。

7.根据权利要求3所述的产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌作为发酵菌种制备β‑葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述发酵温度为30‑37℃，发酵pH为2.5‑10.0，培养基中氯化钠重量含量为0‑12％。

8.根据权利要求7所述的产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌作为发酵菌种制备β‑葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述发酵温度为30℃，发酵pH为7。

9.根据权利要求3所述的产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌作为发酵菌种制备β‑葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述发酵时间为24‑216小时。

10.根据权利要求3所述的产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌作为发酵菌种制备β‑葡萄糖苷酶的应用，其特征在于，所述菌种接种至GBM培养基或含有葡萄糖、蔗糖、果糖和木糖任意一种碳源的培养基发酵11‑72小时，获得特殊香味代谢产物。

11.权利要求1所述的产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌用于耐受重金属Cd、Cu、Mn、Co、Ni、Cr或Zn的应用，所述Cd浓度≤11.2ppm、Cu浓度≤1000ppm、Mn浓度≤5494ppm、Co浓度≤294.6ppm、Ni浓度≤5.8ppm、Cr浓度≤259.9ppm以及Zn浓度≤654ppm。

说明书

一种产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌与应用

技术领域

[0001] 本发明属于工业微生物技术领域，涉及一种产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌与应用。

背景技术

[0002] 1837年Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了一种能够水解结合于末端非还原性的β‑D‑葡萄糖键，同时释放出β‑D‑葡萄糖和相应的配基的纤维素酶类，此酶命名为β－
葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)，又称β‑D‑葡萄糖苷葡萄糖水解酶、苦杏仁苷酶、龙胆二糖酶、纤
维二糖酶(cellobias，CB或β‑G)。β－葡萄糖苷酶在工业生产中具有非常大的应用价值。首
先β－葡萄糖苷酶是纤维素分解酶系中的重要组成成分，也是水解纤维素过程中最后一步
关键酶。其次β‑葡萄糖苷酶可作为香气改良或提升的关键酶，能比较温和而迅速地水解风
味前体物质，释放结合态的挥发性成分，并使某些特殊感官特征得到提升。除此之外，β‑葡
萄糖苷酶还在植物的害虫防御、某些癌症的诊断和治疗，以及日用化工业非离子表面活性
剂烷基糖苷生产等方面中广泛应用。该酶广泛存在于动植物、昆虫、丝状真菌、酵母菌、细菌
当中，在植物的种子和微生物中尤为普遍，与植物、动物、昆虫以及细菌相比，酵母细胞具有
易培养、生长快、胞外酶易于分离等特点，使从酵母菌中生产比活高、特性优良的β‑葡萄糖
苷酶成为优势。目前还没有报道过产β‑葡萄糖苷酶的季也蒙毕赤酵母菌株。

[0003] 在目前的研究报道中，把具有产生香味物质这个特征的酵母菌称为生香酵母。生香酵母种类众多，汉逊酵母、假丝酵母、毕赤酵母、球拟酵母等能产生明显香气(参考文献：
王益姝.生香酵母及其面团发酵过程与面包香气特征研究[D].江南大学,2016)。生香酵母
发酵产生的香气物质受菌种和培养条件等因素的影响。不同的生香酵母可产生花香、植物
香、果香、甜味、酱香、焦糊味等独特香味。这些香味成分主要为醇类、酯类、吡咯、酸类、吡
嗪、醛类、酮类、呋喃、芳香族类等物质，其中醇类和酯类是生香酵母可普遍代谢产生的主要
香气物质(参考文献：付俊淑，庄世文，徐丹丹等.酵母分离株分子鉴定及其挥发性香气成分
检测分析[J].食品与发酵工业，2010，36(02):44‑48)不同挥发成分具有的特殊香气不同，
酯类具有甜的水果味；醇类具有植物味、花香味、泥土味、金属味；醛类具有水果味、坚果味、
干酪味；酮类具有水果味、花香味；呋喃类具有温暖的甜香味、香脂味、类烟草味；吡咯和吡
啶类具有甜味、烧烤香味、焦糖味、碱性味、生鸡蛋香味、坚果味、爆米花味；吡嗪类具有坚果
味、烧烤味；含硫化合物具有洋葱味、类汽油味、卷心菜味、臭鸡蛋味(参考文献：章超桦，解
万翠.水产风味化学[M]中国轻工业出版社，2012)。生香酵母在酒业、食品、香精、香料等行
业具有广泛的用途。目前还没有报道过产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌株。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明目的是提供产β‑葡萄糖苷酶的生香菌株，提高β‑葡萄糖苷酶的生产效率以及制备香味物质，满足β‑葡萄糖苷酶以及香味物质的大规模工业化生产。

[0005] 一种产β‑葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌，其分类命名为季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)GXDK6，于2018年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员
会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16007。

[0006] 所述菌株可利用唯一或两种以上碳源的培养基发酵制备β‑葡萄糖苷酶和香味代谢产物。

[0007] 进一步的，所述的碳源包括五碳糖、六碳糖、麸皮、木薯粉、甘蔗渣、蔗糖、棉子糖、菊粉、麦芽糖、D‑海藻糖、木聚糖、D‑半乳糖、纤维素、纤维二糖、乙醇、琥珀酸，所述的五碳糖
包括L‑阿拉伯糖、D‑木糖，所述的六碳糖包括葡萄糖、D‑甘露糖、D‑甘露醇、D‑果糖、D‑山梨
醇、L‑山梨糖、L‑鼠李糖。

[0008] 进一步的，所述两种以上碳源培养基包括YPD培养基、GBM培养基。

[0009] 进一步的，所述菌种在唯一碳源、pH 3.5条件下培养2天，麸皮、木薯粉、甘蔗渣培养条件下的细胞生长量分别为葡萄糖培养条件下的细胞生长量48.8％、45.5％和51.5％。

[0010] 所述菌株生长最适温度为30‑37℃，生长最适pH为2.5‑10.0，生长培养基中氯化钠重量含量为0‑12％。

[0011] 进一步的，所述的菌株生长最适温度为30℃，生长最适pH为7。

[0012] 进一步的，所述菌种的发酵时间为5‑168小时。

[0013] 本发明提供的菌种可同化碳源包括甘露糖、D‑果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、菊粉、麦芽糖、D‑海藻糖、D‑山梨醇、山梨糖、甘露醇、木聚糖、D‑半乳糖、纤维素、L‑阿拉伯糖、D‑木
糖、纤维二糖、乙醇、L‑鼠李糖、琥珀酸，不可同化卡拉胶、可溶性淀粉、乳糖、D‑核糖、肌醇、
莽草酸、壳聚糖、羧甲基纤维素钠、水杨酸。

[0014] 本发明提供的菌株能够耐受吸附重金属Cd、Cu、Mn、Co、Ni、Cr、Zn，分别对0‑11.2、0‑1000、0‑5494、0‑294.6、0‑5.8、0‑259.9、0‑654ppm浓度的重金属环境具有极强耐受性。

[0015] 本发明提供的菌种11‑72小时发酵GBM、葡萄糖、蔗糖、果糖和木糖所得的特殊香味代谢产物种类数量分别为50‑65.00％、31.03‑64.29％、53.57‑57.14％、40.00‑56.25％、
42.31‑52.17％，特殊香气代谢产物含量分别为17.16‑29.57％、8.40‑45.79％、31.76‑
47.49％、18.67‑20.15％、22.98‑26.36％。

[0016] 进一步的，所述特殊香味代谢产物种类包括酯类、醛类、酮类、呋喃类、酸类、醇类、含硫化合物、吡嗪和吡咯，主要的香气成分包括β‑苯乙醇、3‑己烯‑1‑醇、法尼醇、α‑松油醇、
异甘醇、乙酸、丙酸、壬醛、2‑乙基己基甲酸酯、十二烷酸、2‑乙基己醛乙二醇缩醛。

[0017] 本发明第二个目的是利用筛选到的菌株作为发酵菌种制备β‑葡萄糖苷酶的应用。

[0018] 所述菌种发酵7天所得的β‑葡萄糖苷酶最适反应时间为5‑40min；最适反应pH为3+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ +
3.6‑6.0；最适反应温度为20‑70℃，酶活力最高达0.116U，Fe 、Co 、Ca 、Ni 、Mn 、Zn 、K
2+ 3+ 2+ + 2+
对酶具有激活作用，且激活效果依次减弱，Cu 、Al 、Mg 、Na 、Sr 对酶活性具有抑制作用，
且抑制效果依次减弱。

[0019] 本发明还有一个目的是利用筛选到的菌株用于制备去除重金属的吸附剂。

[0020] 本发明的有益效果：

[0021] 本发明所提供的季也蒙毕赤酵母菌株稳定，生长速度较快，安全，培养条件简单。

[0022] 本发明提供的季也蒙毕赤酵母菌株长时间发酵产香，为产香酵母的工业应用奠定基础。

[0023] 本发明所提供的季也蒙毕赤酵母菌株已完成全基因组，为研究季也蒙毕赤酵母来源的β‑葡萄糖苷酶奠定基础。

[0024] 本发明所提供的季也蒙毕赤酵母是首次报道的产β‑葡萄糖苷酶季也蒙毕赤酵母菌株。

[0025] 本发明所提供的季也蒙毕赤酵母可利用五碳糖、六碳糖为唯一碳源产β‑葡萄糖苷酶。

[0026] 本发明所提供的季也蒙毕赤酵母可利用有机质，耐盐，耐重金属，并能够适应广泛的pH范围，扩大了产β‑葡萄糖苷酶的环境条件。

[0027] 利用本发明菌种制备β‑葡萄糖苷酶，生产工艺环保，操作简单，很适合工业大规模生产。

附图说明

[0028] 图1为季也蒙毕赤酵母GXDK6菌株系统发育树图；

[0029] 图2为季也蒙毕赤酵母GXDK6菌株在GBM琼脂培养基上的菌落形态图；

[0030] 图3为季也蒙毕赤酵母GXDK6菌株在光学显微镜下的细胞形态图；

[0031] 图4为季也蒙毕赤酵母GXDK6菌株的生理生化特征图；

[0032] 图5为季也蒙毕赤酵母GXDK6菌株的β‑葡萄糖苷酶显色平板图；

[0033] 图6为季也蒙毕赤酵母GXDK6菌株的挥发性香味代谢物特征图；

[0034] 图7为季也蒙毕赤酵母GXDK6菌株的β‑葡萄糖苷酶酶活特性图。

具体实施方式

[0035] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0037] 下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0038] 本发明中，下述实施例中采用的培养基：

[0039] YPD培养基：葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母粉1％，115℃灭菌15min。

[0040] GBM培养基：酵母粉0.2％，牛肉膏0.2％，聚蛋白胨0.5％，蔗糖0.6％。固体GBM培养基加入琼脂1.5‑2％。121℃灭菌20min。

[0041] 无碳培养基：NaCl 0.05％，(NH4)2SO4 0.2％，K2HPO4 0.05％，KH2PO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.02％。

[0042] 盐度培养基：GBM培养基中，加入氯化钠，分别配置成氯化钠浓度为0‑12％的盐度培养基。

[0043] 碳源同化培养基：无碳培养基中加入唯一碳源至终浓度为2％。碳源分别为甘露糖、D‑果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、菊粉、麦芽糖、D‑海藻糖、D‑山梨醇、L‑山梨糖、甘露醇、木
聚糖、D‑半乳糖、纤维素、L‑阿拉伯糖、D‑木糖、纤维二糖、卡拉胶、可溶性淀粉、乳糖、D‑核
糖、L‑鼠李糖、肌醇、莽草酸、琥珀酸、壳聚糖、羧甲基纤维素钠，115℃灭菌15min；乙醇、水杨
酸过滤除菌。

[0044] 重金属离子耐受培养基：YPD液体培养基中，分别加入重金属离子溶液至浓度分别为0，0.1,0.5,1,3,5,10,25,50和100mmol/L，调节pH为3.5。

[0045] 有机质耐受培养基：无碳培养基分别加入麸皮、木薯粉、甘蔗渣为唯一碳源，至碳源终浓度为2％，调节pH至3.5，115℃灭菌15min。

[0046] β‑葡萄糖苷酶显色平板：酵母粉0.25％，蛋白胨0.25％，(NH4)2SO4 0.1％，KH2PO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.02％，七叶苷0.1％，琼脂粉2％，121℃，20min灭菌后加入过滤除菌
的柠檬酸铁铵溶液至三价铁终浓度为0.3％。

[0047] 木糖产酶培养基：木糖2％，(NH4)2SO4 0.1％，K2HPO4 0.7％，KH2PO4 0.3％，柠檬酸三钠0.05％，MgSO4·7H2O 0.01％，纤维二糖0.012％。

[0048] 葡萄糖产酶培养基：葡萄糖2％，(NH4)2SO4 0.1％，K2HPO4 0.7％，KH2PO4 0.3％，柠檬酸三钠0.05％，MgSO4·7H2O 0.01％，纤维二糖0.012％。

[0049] GBM产酶培养基：酵母粉0.2％，牛肉膏0.2％，聚蛋白胨0.5％，蔗糖0.6％，纤维二糖0.012％。

[0050] 产香发酵培养基：碳源(葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖)2％，NaCl 0.05％，(NH4)2SO4 0.2％，K2HPO4 0.05％，KH2PO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.02％，115℃灭菌15min。

[0051] 实施例1季也蒙毕赤酵母GXDK6分离和鉴定

[0052] (1)从广西省北海市红树林土壤沉积物中进行采样，将样品用无菌水溶解后，37℃‑1 ‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑2 ‑5
摇床震荡培养一小时，用无菌蒸馏水梯度稀释成10 、10 、10 、10 、10 ，分别取10 ～10
的稀释菌液100μL分别涂布到YPD固体培养基中，于37℃培养2～3天，挑取乳白色，微凸，湿
润，边缘整齐，规则圆形，表面光滑的单菌落进行平板划线2～3次得到单菌落。

[0053] (2)活化季也蒙毕赤酵母GXDK6

[0054] 从‑80℃取出的菌株接种划线于GBM固体培养基中，置于30℃恒温培养48h。

[0055] (3)季也蒙毕赤酵母GXDK6进行全基因组测序

[0056] 将上述分离纯化得到菌株送上海派森诺生物科技股份有限公司进行全基因组测序。

[0057] Reads总数为8,319,572条；碱基总数2,477,073,673条；模糊碱基的比例为0.001％，总碱基的GC百分含量为38.8％；碱基识别准确率在99％以上的碱基所占百分比为
94.6％；碱基识别准确率在99.9％以上的碱基所占百分比为86.73％。三代测序结果其测的
的序列长度大,没有不确定碱基。基因组序列拼接后序列的总长度为10,722,568bp，GC百分
含量为43.65％；ncRNA的预测共有tRNA和rRNA两大类；CAZy分析糖苷水解酶类的基因有57
条，糖基转移酶类的基因有57条,碳水化合物酯酶类的基因有21条，辅助活性酶类基因有13
条，不含多糖裂解酶类基因，如表1‑2所示。

[0058] 表1全基因组测序结果分析

[0059]Project Detail Project Detail
Scaffold Total(Mb) 10.72 ％Q40 99.99％
Contig Total(Mb) 10.72 tRNAs 159
Scaffolds 14 rRNAs 28
Contigs 14 Simple Repeats(bp) 31.85％
Scaffold N50(Mb) 1.67 genome％GC 43.65％
Contig 50(kb) 1675 total genes 5,175

[0060] 表2 CAZy分析结果统计

[0061] Property Number of Genes Percentage(％)GT 57 1.24
PL 0 0
CE 21 0.46
AA 13 0.28
CBM 3 0.07
GH 57 1.24

[0062] (4)季也蒙毕赤酵母GXDK6分子生物学鉴定

[0063] 以上述分离纯化得到菌株DNA为目的片段，利用通用引物

[0064] ITS1(SEQ.ID.NO.1):5’‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3’；

[0065] ITS4(SEQ.ID.NO.2):5’‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3’；

[0066] 扩增18S rRNA，将其送至上海生工进行测序，测序得到的序列去除两端引物，得到607bp的序列，测序结果如SEQ.ID.NO.3所示，在NBCI上对该组序列进行BLAST对比，筛选同
源性较高的序列，结果表明它与季也蒙毕赤酵母菌(P.guilliermondii)18S rDNA序列同源
性较高(99％以上)，通过Neighbor‑Joining法构建系统发育树，详见图1所示。

[0067] (5)季也蒙毕赤酵母GXDK6形态特征观察

[0068] 将分离纯化得到菌株于GBM固体培养基中，30℃恒温培养48h，观察其菌落形态呈乳白色不透明，圆形，中间凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有光泽，生长速度较快，如图2所
示。

[0069] 挑取单菌落于载玻片上，滴加一滴蒸馏水，盖上盖玻片，先低倍镜观察，后使用100倍镜观察其菌体特征，该菌体细胞呈卵圆，一端出芽生殖，如图3所示。

[0070] (6)季也蒙毕赤酵母GXDK6生理生化特征鉴定

[0071] 1)、制备种子液：挑取活化的单菌落于GBM液体培养基中，30℃，200rpm培养12h。

[0072] 2)、不同温度条件培养：以GBM液体培养基质量体积百分比的2％为接种量，分别于20℃、25℃、30℃、37℃、45℃、50℃，200rpm培养12h，最适生长温度30‑37℃，如图4‑A所示。

[0073] 3)、不同pH条件培养：以HCl溶液和NaOH溶液为缓冲液，分别调节液体GBM培养基pH至2.5、3.0、7.0、9.0、10.0，以GBM液体培养基质量体积百分比的2％为接种量，30℃，200rpm
培养16h，pH生长范围pH2.5‑10.0，如图4‑B所示。

[0074] 4)、不同盐度条件培养：以盐度培养基质量体积百分比的2％为接种量，30℃，200rpm培养12h，可在0‑12％条件下生长，如图4‑C所示。

[0075] 5)、碳源同化实验：以碳源同化培养基质量体积百分比的2％为接种量，30℃，200rpm培养46h，结果如下表3、图4‑F所示：

[0076] 表3碳源同化情况

[0077]碳源 结果 碳源 结果 碳源 结果
甘露糖 +++++ 甘露醇 ++++ 乳糖 ‑
D‑果糖 +++++ 木聚糖 +++ D‑核糖 ‑
葡萄糖 +++++ D‑半乳糖 +++ 卡拉胶 ‑
蔗糖 +++++ 纤维素 ++ 水杨酸 ‑
棉子糖 +++++ L‑阿拉伯糖 ++ 肌醇 ‑
菊粉 +++++ D‑木糖 ++ 莽草酸 ‑
麦芽糖 +++++ 纤维二糖 ++ 壳聚糖 ‑
D‑海藻糖 +++++ 乙醇 ++ 可溶性淀粉 ‑
D‑山梨醇 +++++ L‑鼠李糖 + 羧甲基纤维素钠 ‑
山梨糖 ++++ 琥珀酸 +    

[0078] +表示可同化碳源，–表示不可同化碳源。

[0079] 6)、重金属离子耐受培养：以重金属离子耐受培养基质量体积百分比的2％为接种量，30℃，200rpm培养18h，可在pH 3.5重金属(Cd、Cu、Mn、Co、Ni、Cr、Zn)环境下生长，分别对
0‑11.2、0‑1000、0‑5494、0‑294.6、0‑5.8、0‑259.9、0‑654ppm浓度的重金属环境具有极强耐
受性，如表4、图4‑D所示。

[0080] 表4GXDK6重金属耐受情况与污水综合排放标准

[0081]种类 GB25467‑2012污水综合排放标准 GXDK6生长的离子浓度
Cd 0‑0.1ppm 0‑11.2ppm
Cu 0‑2ppm 0‑1000ppm
Mn 0‑5ppm 0‑5494ppm
Co ‑ 0‑294.6ppm
Ni 0‑1ppm 0‑5.8ppm
Cr 0‑1.5ppm 0‑259.9ppm
Zn 0‑5ppm 0‑654ppm

[0082] 7)、有机质耐受培养：以有机质耐受培养培养基质量体积百分比的1％为接种量，30℃，200rpm培养2天，在麸皮、木薯粉、甘蔗渣的唯一培养基上生长，细胞生长量分别为葡
萄糖培养条件下的细胞生长量48.8％、45.5％和51.5％，如图4‑E所示。

[0083] 8)、产β‑葡萄糖苷酶鉴定：活化的季也蒙毕赤酵母GXDK6单菌落接种在β‑葡萄糖苷酶显色平板中；在30℃恒温培养4d。观察到菌落周围有黑色的水解圈，即说明季也蒙毕赤酵
母GXDK6可产β‑葡萄糖苷酶，如图5所示。

[0084] 结合以上分子生物学、菌株形态以及其生理生化特性，菌株鉴定为Pichia guilliermondii菌属的一个菌株，即季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)GXDK6，
2018年06月25日将其保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理
委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16007。

[0085] 实施例2气相色谱‑质谱检测挥发性香味物质

[0086] (1)发酵风味确定

[0087] 以GBM培养基、产香发酵培养基质量体积百分比的2％为接种量，30℃，200rpm，培养1‑7天，嗅闻液体发酵液的风味，液体发酵液具有甜香、果香等特殊香味。

[0088] (1)特殊香味代谢产物检测

[0089] 对菌株发酵GBM培养基11、24h和产香培养基发酵24、72h的样品进行处理，采用气相色谱‑质谱仪进行分析。GC‑MS分析条件：GC条件：进样口温度250℃，载气氦气(He)，流速
2m L/min。进样量1μL，不分流进样，色谱柱(30m×250μm×0.25μm)，升温程序：40℃恒温
4min，以10℃/min的速度升温至210℃，保持6min。MS条件：电子电离(elec‑tronic 
ionization，EI)源，电子能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，扫描范围50.00～
600.00amu。

[0090] 检测到发酵GBM、葡萄糖、蔗糖、果糖和木糖产生的特殊香味代谢产物种类数量和含量分别为50‑65.00％、31.03‑64.29％、53.57‑57.14％、40.00‑56.25％、42.31‑52.17％，
特殊香气代谢产物含量分别为17.16‑29.57％、8.40‑45.79％、31.76‑47.49％、18.67‑
20.15％、22.98‑26.36％；所述特殊香味代谢产物种类为酯类、醛类、酮类、呋喃类、酸类、醇
类、含硫化合物、吡嗪和吡咯，主要的香气成分为β‑苯乙醇、3‑己烯‑1‑醇、法尼醇、α‑松油
醇、异甘醇、乙酸、丙酸、壬醛、2‑乙基己基甲酸酯、十二烷酸、2‑乙基己醛乙二醇缩醛等。如
表5‑8、图6所示。

[0091] 表5特殊香味物质分析

[0092]

[0093] 表6不同碳源发酵主要香气成分

[0094]

[0095] 表7发酵GBM培养基(11h)特殊香气成分

[0096]

[0097]

[0098] 表8发酵GBM培养基(24h)特殊香气成分

[0099]

[0100]

[0101] 实施例3 pNP比色法测定β‑葡萄糖苷酶酶学性质

[0102] (1)pNP标准曲线绘制

[0103] 按照下表配制不同浓度的pNP标准液，每个浓度3个平行，混匀，从各浓度的pNP标准液中抽取200μL放到EP管中，分别加50μL 2mol/LNa2CO3溶液混匀，取200μL上述溶液于酶
标版中，读取每个浓度的OD410吸光值，然后把pNP浓度作为横坐标，把OD410数值作为纵坐标，
绘制pNP的标准曲线。

[0104]编号 0 1 2 3 4 5 6 7 8
蒸馏水(μL) 1000 995 990 985 980 975 970 965 960
10μmol/mLpNP(μL) 0 5 10 15 20 25 30 35 40
pNP浓度(μmol/mL) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4

[0105] (2)酶活测定

[0106] 取1ml发酵液，10000rpm离心5min。取170μL缓冲液，20μL 20mmol/L的pNPG在适宜的温度下预热2min，加入适当稀释的粗酶液10μL，反应20min后，加入50μL 2mol/L Na2CO3溶
液，混匀，终止酶反应，取200μL测OD410。发酵液沸水浴5min灭活，做空白对照。

[0107] 1)最适发酵天数：以木糖产酶培养基、葡萄糖产酶培养基、GBM产酶培养基进行发酵，分别测定1‑9天的酶活，确定最适发酵天数为7天，使用GBM产酶培养基发酵，如图7‑A所
示。

[0108] 2)最适反应时间：在最适发酵天数7天的条件下，分别反应5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min的酶活，确定最适反应时间为35min，如图7‑B所示。

[0109] 3)最适反应pH：在发酵7天、反应时间35min的条件下，分别在pH值为3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0的条件下测定酶活，确定最适反应pH5.0，如图7‑C所示。

[0110] 4)最适反应温度：在发酵7天、反应时间35min、pH5.0的条件下，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的条件下测定酶活，确定最适反应温度为50℃，如图7‑D所示。

[0111] 5)金属离子对酶活性影响：在发酵7天、反应时间35min、pH5.0、反应温度50℃的条2+ 2+ 2+ 3+ 2+ + 2+ + 2+ 2+ 3+ 2+
件下，Zn 、Cu 、Mg 、Fe 、Ca 、K、Mn 、Na 、Co 、Ni 、Al 、Sr 终浓度为1mM的条件下测定
3+ 2+ 2+ 2+ 2
酶活，确定金属离子对酶活性的影响，如图7‑E所示，与对照组相比，Fe 、Co 、Ca 、Ni 、Mn
+ 2+ +
、Zn 、K 对酶具有激活作用，且激活效果依次减弱，分别为203.1％、136.9％、108.5％、
3+ 2+ 3+
107.4％、105.6％、103.6％、101.0％，其中Fe 、Co 对酶有显著的激活作用，Fe 对酶的激
2+ + 2+ 3+ 2+ + 2+
活作用最明显，Zn 、K对酶的激活作用微乎其微；Cu 、Al 、Mg 、Na 、Sr 对酶活性具有抑
2+
制作用，且抑制效果依次减弱，分别为85.9％、95.6％、97.7％、98.2％、99.7％，其中Cu 对
2+ + 2+
酶活性具有显著的抑制作用，Mg 、Na、Sr 对酶活性的抑制作用极其微小。

[0112] 综上检测表明，该菌可作为发酵菌种制备生产β‑葡萄糖苷酶，适合推广使用。

[0113]

[0114]