多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法

摘要

本发明涉及一种多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，首先利用3D打印技术制备内含片层单元血管通道和生长因子的水凝胶，然后将内皮细胞接种至通道中培养一段时间后，得到片层单元水凝胶血管网络，接着将多个片层单元水凝胶血管网络变形组装后，采用激光雕刻或切削等方式得到具有特定形状的待修复的血管部位，最后继续培养一段时间得到多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网；其中，片层单元血管通道为平面人体动脉或静脉血管网络状结构，由多个位于同一空间层面或不同空间层面的圆柱状通道组成，相邻两个圆柱状通道的中心距小于等于5mm，水凝胶为可被内皮细胞及其分化出的细胞侵入的水凝胶。本发明的方法简单易行，具有环境普适性。

权利要求

1.多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其特征是：首先利用3D打印技术制备内含片层单元血管通道和生长因子的水凝胶，然后将内皮细胞接种至通道中培养一段时间后，得到片层单元水凝胶血管网络，接着将多个片层单元水凝胶血管网络变形组装后，采用激光雕刻或者切削的方式得到具有特定形状的待修复的血管部位，最后继续培养一段时间得到多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网；

其中，片层单元血管通道为平面人体动脉或静脉血管网络状结构，由多个位于同一空间层面或不同空间层面的圆柱状通道组成，相邻两个圆柱状通道的中心距小于等于5mm，水凝胶为可被内皮细胞及其分化出的细胞侵入的水凝胶；水凝胶为丝素水凝胶；

内含片层单元血管通道和生长因子的水凝胶的制备步骤如下：(1)利用3D打印技术构建圆柱体模型或由多个位于同一空间层面的圆柱体连接而成的复合模型，圆柱体的材质为明胶、海藻酸钠或壳聚糖；

(2)将模型置于注模容器中后进行组合，至所有的圆柱体位于同一空间层面或不同空间层面形成平面人体动脉或静脉血管网络状结构；

(3)向注模容器中注入丝素蛋白、生长因子、催化剂和交联剂的混合溶液，丝素蛋白、生长因子、催化剂和交联剂的混合溶液由含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液与生长因子溶液混合而成，含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液由丝素蛋白溶液、催化剂和交联剂混合而成；丝素蛋白溶液的浓度为5～15wt％，生长因子溶液的浓度为50～100ng/ml，丝素蛋白溶液与生长因子溶液的体积比为1～5:1；

(4)固化；

(5)去除圆柱体，并用水冲洗通道。

2.根据权利要求1所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其特征在于，圆柱体的直径为0.05～0.8mm；

圆柱体模型或复合模型的构建过程为：

首先将明胶、海藻酸钠或壳聚糖溶解配制成浓度为10～20％(w/v)的3D打印溶液，然后将3D打印溶液倒入3D打印装置的料管中，由3D打印装置对构建好的模型进行线形逐层打印，最后对打印得到的产物进行冻干处理。

3.根据权利要求2所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其特征在于，打印参数为：注射压力1.0～2.0bar，打印速度3.0～5.2mm/s，打印喷嘴直径0.26～0.8mm。

4.根据权利要求1所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其特征在于，注模容器的内表面涂有脱模剂，注模容器的材质为PDMS或PMMA。

5.根据权利要求1所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其特征在于，丝素蛋白溶液的制备过程为：在温度为27～40℃的条件下，将蚕丝纤维在浓度为

9.0～9.3M的溴化锂溶液中溶解1～3h后在水中透析除盐并浓缩。

6.根据权利要求1所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其特征在于，生长因子为VEGF、MCP‑1、bFGF、S1P和PMA中的一种以上，或者为HGF与VEGF、MCP‑

1、bFGF、S1P和PMA中的一种以上的组合。

7.根据权利要求1所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其特征在于，接种过程为：将浓度为50～150cells/ml的内皮细胞分散液灌注到通道中，震荡5～20min；培养一段时间是指培养7～14d；继续培养一段时间是指培养3～5d。

说明书

多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法

技术领域

[0001] 本发明属于水凝胶微流体血管网络技术领域，涉及一种多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法。

背景技术

[0002] 微流体目前已经实现了精确的流体操作和极小体积控制，以应对高通量生物分子分析、疾病诊断和综合细胞研究领域的挑战。以往的微流体系统以聚二甲基硅氧烷(PDMS)
作为细胞间融合、交融的媒介，由于其光学透明性、低毒性、生物惰性，使其在微流体凝胶系
统中得到广泛的生物和化学应用。但是，PDMS微流体装置存在如下缺点：

[0003] (1)PDMS微流体装置由有机硅预聚物制成，在其制备过程中受高温加工影响使得具有生物功能的组件失效；

[0004] (2)PDMS不支持细胞直接表面附着，需要进行物理和化学手段修饰，如利用细胞外基质(EMC，纤维连接蛋白、胶原蛋白等)将PDMS包被后再让细胞附着在其表面；

[0005] (3)PDMS微流体水凝胶装置通常不能进行含水试剂或细胞渗透的实验，且质量传递和功能化仅限于微通道的表面；

[0006] (4)目前的微流体水凝胶构型收到浇注模具的限制，产品造型单一，不一定能贴合人体需求。

[0007] (5)PDMS在生物体内不可降解，因此在临床试验中PDMS不能做到与生物体相融合。

[0008] 现如今，更多的生物相关的天然水凝胶材料已用于微流体制造。然而，现有的3D微流体网络水凝胶采取多层组装，导致水凝胶内部网络单一，制造过程复杂，还不具备环境普
适性，且最终的水凝胶还存有尺寸变化的现象，同时制备得到的微流体血管网络只含有通
道主干，无血管支干，进而无法形象地模拟生物体内血液流动；此外，当前多层组装的水凝
胶微流体的相邻层之间的强度及整体水凝胶的刚度也亟待解决。

[0009] 因此，研究一种网络管路形态多样、机械强度优异的水凝胶微流体血管网络的简单且具有环境普适性的制备方法，具有十分重要的意义。

发明内容

[0010] 本发明的目的是解决现有技术中水凝胶微流体血管网络产品造型单一，不贴和人体特殊器官血管的需要、不具备环境普适性以及制得的微流体血管网络组成简单、机械强
度差的问题，提供一种多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法。

[0011] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0012] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，首先利用3D打印技术制备内含片层单元血管通道和生长因子的水凝胶，然后将内皮细胞接种至通道中培养一段时
间后，得到片层单元水凝胶血管网络，接着将多个片层单元水凝胶血管网络变形组装后(组
装方式为堆叠、贴合、缠绕、裹覆，如果组装成立方体，仅用堆叠就可以，如果组装成球体，需
要用到贴合、缠绕和裹覆，变形方式为弯曲、扭转)，采用激光雕刻或者切削的方式得到具有
特定形状的待修复的血管部位，最后继续培养一段时间得到多片层单元水凝胶包被的仿生
毛细血管网；

[0013] 其中，片层单元血管通道为平面人体动脉或静脉血管网络状结构，由多个位于同一空间层面或不同空间层面的圆柱状通道组成，相邻两个圆柱状通道的中心距小于等于
5mm(具体为0.3～5mm)，水凝胶为可被内皮细胞及其分化出的细胞侵入的水凝胶。

[0014] 本发明制得的多片层单元水凝胶可以卷曲和弯曲，它可以像绷带一样绕在骨的周围，并利用其生物相容性修复骨周围的血管，以达到贴和人体特殊器官血管的需要。

[0015] 作为优选的技术方案：

[0016] 如上所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，水凝胶为丝素水凝胶，本发明水凝胶的种类包括但不仅限于此，其他种类的生物质水凝胶也在本发明
的保护范围。

[0017] 如上所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，内含片层单元血管通道和生长因子的水凝胶的制备步骤如下：

[0018] (1)利用3D打印技术构建圆柱体模型或由多个位于同一空间层面的圆柱体连接而成的复合模型，圆柱体的材质为明胶、海藻酸钠或壳聚糖；

[0019] (2)将模型置于注模容器中后进行组合，至所有的圆柱体位于同一空间层面或不同空间层面形成平面人体动脉或静脉血管网络状结构；当模型为圆柱体模型时，所述组合
是指将多个圆柱体模型铺放在同一空间层面或不同空间层面；当模型为复合模型时，其数
量为一个或两个以上，两个以上复合模型铺放在不同空间层面；当模型为圆柱体模型和复
合模型时，多个圆柱体模型铺放在同一空间层面，单个复合模型其它空间层面；

[0020] (3)向注模容器中注入丝素蛋白、生长因子、催化剂和交联剂的混合溶液(催化剂和交联剂为辣根过氧化物酶(HRP)与H2O2，或者为钌催化剂与过硫酸铵)，丝素蛋白、生长因
子、催化剂和交联剂的混合溶液由含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液与生长因子溶液混
合而成，含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液由丝素蛋白溶液、催化剂和交联剂混合而成；

[0021] (4)固化；

[0022] (5)去除圆柱体，并用水冲洗通道，圆柱体的材质为明胶时，采用加热至30℃以上后倾倒的方式去除；圆柱体的材质为壳聚糖时，采用浓度为2～5wt％的冰乙酸溶液溶解的
方式去除；圆柱体的材质为海藻酸钠时，采用浓度为2～5wt％的碳酸钠溶液溶解的方式去
除。

[0023] 如上所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，圆柱体的直径为0.05～0.8mm；

[0024] 圆柱体模型或复合模型的构建过程为：

[0025] 首先将明胶、海藻酸钠或壳聚糖溶解配制成浓度为10～20％(w/v)的3D打印溶液，然后将3D打印溶液倒入3D打印装置的料管中，由3D打印装置对构建好的模型进行线形逐层
打印，最后对打印得到的产物进行冻干处理，以避免打印产物在后续浇注过程中变形。

[0026] 如上所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，打印参数为：注射压力1.0～2.0bar，打印速度3.0～5.2mm/s，打印喷嘴直径0.26～0.8mm。

[0027] 如上所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，注模容器的内表面涂有脱模剂，注模容器的材质为PDMS或PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯，俗称有机玻璃)，注
模容器的要求为具有光学透明性且疏水，具有光学透明性便于在制备血管网络过程中观察
制备情况，疏水便于脱模。

[0028] 如上所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，丝素蛋白溶液的制备过程为：在温度为27～40℃的条件下，将蚕丝纤维(配制丝素蛋白溶液前，先将蚕
丝在浓度为0.5wt％的碳酸钠溶液中煮沸两次以除去丝胶，再在去离子水中漂洗并通过强
制空气流干燥)在浓度为9.0～9.3M的溴化锂溶液中溶解1～3h后在水中透析除盐并浓缩。

[0029] 如上所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，丝素蛋白溶液的浓度为5～15wt％，生长因子溶液的浓度为50～100ng/ml，丝素蛋白溶液与生长因子溶
液的体积比为1～5:1，由于圆柱通道的中心距不同，在同样的圆柱通道中心距和培养天数
下，过低的生长因子浓度会使得血管间可能并不互通，血管周围仅长有无数的毛细血管，生
长因子浓度过高，相邻近的通道则存在融合为一个血管通道的潜在影响。此外，搭配不同的
生长因子对内皮细胞入侵水凝胶的作用强度大小不同。

[0030] 如上所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，生长因子为VEGF(血管内皮生长因子)、MCP‑1(单核细胞趋化蛋白‑1)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因
子)、S1P(1‑磷酸鞘氨醇)和PMA(佛波醇12‑肉豆蔻酸酯13‑乙酸酯)中的一种以上，或者为
HGF(肝细胞生长因子)与VEGF、MCP‑1、bFGF、S1P和PMA中的一种以上的组合；在同样的浓度
条件下，使用不同生长因子时作用强度大小关系为：S1P>PMA>VEGF>＝MCP‑1>bFGF>HGF＝0
(HGF不能单独使用，需要配合其他生长因子使用)，上述生长因子混合使用，作用效果会增
强。

[0031] 如上所述的多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，接种过程为：将浓度为50～150cells/ml的内皮细胞分散液灌注到通道中(内皮细胞会受生长因子的
浓度梯度的影响，内皮细胞会在培养过程中分化出侵入丝素水凝胶的尖端细胞，尖端细胞
首先侵入水凝胶主体，并会伴随由内皮细胞分化出的茎细胞的迁移，然后逐渐形成丝状伪
足和管腔以及继续向梯度方向生长，最终形成人体的小动脉或小静脉以及毛细血管网)，震
荡5～20min，以使内皮细胞紧贴血管通道内壁；培养一段时间是指培养7～14d；继续培养一
段时间是指培养3～5d。

[0032] 本发明的浇筑成型仿生毛细血管网的制备方法，在现有技术的制备方法的基础上进行如下改进：

[0033] (1)首先制备片层单元水凝胶仿生毛细血管网，然后将多个片层单元水凝胶仿生毛细血管网进行选择性的对片层单元水凝胶进行变形组装，最终的片层单元水凝胶包被的
仿生毛细血管网的构型可脱离模具的限制；

[0034] (2)水凝胶搭载生长因子，利用水凝胶的多孔性和控制生长因子的浓度使血管网络主干长出支干，最终可形成三维立体交叉网络，本发明的方法所做到的支干的精度也高
于多层组装方法；

[0035] (3)本发明的浇筑成型仿生毛细血管网的制备方法，丝素水凝胶微流体仿生血管化网络制造成品无PDMS作外围支撑边界，成品可以直接植入生物体内。

[0036] 有益效果：

[0037] (1)本发明的浇筑成型仿生毛细血管网的制备方法，简单易行，成本低廉，具有环境普适性；

[0038] (2)本发明的浇筑成型仿生毛细血管网的制备方法，可以通过利用水凝胶的多孔性和控制生长因子的浓度使血管网络主干长出支干，从而更形象地模拟生物体内血液流
动；

[0039] (3)本发明利用多个片层单元水凝胶仿生毛细血管网变形组装，以达到贴和人体特殊器官血管的需要。

附图说明

[0040] 图1为实施例1制得的片层单元水凝胶血管网络三视图，其中图(a)为俯视图，图(b)为轴测图，图(c)为正视图，图(d)为左视图；

[0041] 图2为实施例1制得的片层单元水凝胶血管网络的扭转变形结构示意图三视图，其中图(a)为俯视图，图(b)为轴测图，图(c)为正视图，图(d)为左视图；

[0042] 图3为实施例1制得的片层单元水凝胶血管网络的弯曲变形结构示意图三视图，其中图(a)为俯视图，图(b)为轴测图，图(c)为正视图，图(d)为左视图。

具体实施方式

[0043] 下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术
人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限
定的范围。

[0044] 实施例1

[0045] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤如下：

[0046] (1)利用3D打印技术制备内含片层单元血管通道和生长因子的水凝胶，具体为：

[0047] (1.1)构建圆柱体模型，具体过程为：首先将明胶溶解在去离子水中配制成浓度为10％(w/v)的3D打印溶液，然后将3D打印溶液倒入3D打印装置的料管中，由3D打印装置对构
建好的模型进行线形逐层打印，最后对打印得到的产物进行冻干处理，其中，圆柱体的直径
为0.05mm；打印参数为：注射压力1.0bar，打印速度3.0mm/s，打印喷嘴直径0.26mm；

[0048] (1.2)将步骤(1.1)中得到的模型置于注模容器中后进行组合，至所有的圆柱体位于同一空间层面或不同空间层面形成平面人体动脉血管网络状结构，其中，注模容器的内
表面涂有脱模剂(5wt％Pluronic F127溶液)，注模容器的材质为PDMS；

[0049] (1.3)制备含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液：在温度为27℃的条件下，将蚕丝纤维在浓度为9.0M的溴化锂溶液中溶解3h后在水中透析除盐并浓缩得到浓度为15wt％的
丝素蛋白溶液，再向15wt％的丝素蛋白溶液中加入HRP以及H2O2，其中，含丝素蛋白、催化剂
和交联剂的溶液中HRP的浓度为20unit/ml，H2O2的浓度为0.01wt％；

[0050] (1.4)向步骤(1.2)中的注模容器中注入步骤(1.3)得到的含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液与VEGF溶液；其中，VEGF溶液的浓度为50ng/ml，步骤(1.3)的丝素蛋白溶液与
VEGF溶液的体积比为1:1；

[0051] (1.5)在37℃下加热固化20min；

[0052] (1.6)采用倾倒的方式去除圆柱体，并用水冲洗通道；

[0053] (2)将内皮细胞接种至通道中培养7d后，得到片层单元水凝胶血管网络，如图1所示，其中，相邻两个圆柱状通道的中心距为0.3mm，接种过程为：将浓度为50cells/ml的内皮
细胞分散液灌注到通道中，震荡5min；

[0054] (3)将多个片层单元水凝胶血管网络变形组装后(片层单元水凝胶血管网络扭转变形和弯曲变形后结构分别如图2和图3所示)，采用激光雕刻的方式得到具有特定形状的
待修复的血管部位，最后继续培养3d得到多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网。

[0055] 实施例2

[0056] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤如下：

[0057] (1)利用3D打印技术制备内含片层单元血管通道和生长因子的水凝胶，具体为：

[0058] (1.1)构建由2个位于同一空间层面的圆柱体连接而成的复合模型，具体过程为：首先将海藻酸钠溶解在去离子水中配制成浓度为20％(w/v)的3D打印溶液，然后将3D打印
溶液倒入3D打印装置的料管中，由3D打印装置对构建好的模型进行线形逐层打印，最后对
打印得到的产物进行冻干处理，其中，圆柱体的直径为0.12mm；打印参数为：注射压力
1.2bar，打印速度3.8mm/s，打印喷嘴直径0.45mm；

[0059] (1.2)将步骤(1.1)中得到的模型置于注模容器中后进行组合，至所有的圆柱体位于同一空间层面或不同空间层面形成平面人体静脉血管网络状结构，其中，注模容器的内
表面涂有脱模剂(5wt％Pluronic F127溶液)，注模容器的材质为PMMA；

[0060] (1.3)制备含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液：在温度为33℃的条件下，将蚕丝纤维在浓度为9.2M的溴化锂溶液中溶解2h后在水中透析除盐并浓缩得到浓度为12wt％的
丝素蛋白溶液，再向12wt％的丝素蛋白溶液中加入氯化三(2,2'‑联吡啶)钌(II)六水合物
和过硫酸铵，其中，含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液中氯化三(2,2'‑联吡啶)钌(II)六
水合物的浓度为10mM，过硫酸铵的浓度为20mM；

[0061] (1.4)向步骤(1.2)中的注模容器中注入步骤(1.3)得到的含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液与MCP‑1溶液；其中，MCP‑1溶液的浓度为65ng/ml，步骤(1.3)的丝素蛋白溶液
与MCP‑1溶液的体积比为3:1；

[0062] (1.5)在250W的光源下放置10min，确保丝素水凝胶完全固化；

[0063] (1.6)采用浓度为2wt％的碳酸钠溶液溶解的方式去除圆柱体，并用水冲洗通道；

[0064] (2)将内皮细胞接种至通道中培养10d后，得到片层单元水凝胶血管网络，其中，相邻两个圆柱状通道的中心距为0.8mm，接种过程为：将浓度为80cells/ml的内皮细胞分散液
灌注到通道中，震荡12min；

[0065] (3)将多个片层单元水凝胶血管网络变形组装后，采用切削的方式得到具有特定形状的待修复的血管部位，最后继续培养4d得到多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管
网。

[0066] 实施例3

[0067] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤如下：

[0068] (1)利用3D打印技术制备内含片层单元血管通道和生长因子的水凝胶，具体为：

[0069] (1.1)构建由3个位于同一空间层面的圆柱体连接而成的复合模型，具体过程为：首先将壳聚糖溶解在2％(w/w)的冰乙酸中配制成浓度为20％(w/v)的3D打印溶液，然后将
3D打印溶液倒入3D打印装置的料管中，由3D打印装置对构建好的模型进行线形逐层打印，
最后对打印得到的产物进行冻干处理，其中，圆柱体的直径为0.8mm；打印参数为：注射压力
2.0bar，打印速度5.2mm/s，打印喷嘴直径0.8mm；

[0070] (1.2)将步骤(1.1)中得到的模型置于注模容器中后进行组合，至所有的圆柱体位于同一空间层面或不同空间层面形成平面人体静脉血管网络状结构，其中，注模容器的内
表面涂有脱模剂(5wt％Pluronic F127溶液)，注模容器的材质为PDMS；

[0071] (1.3)制备含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液：在温度为40℃的条件下，将蚕丝纤维在浓度为9.3M的溴化锂溶液中溶解1h后在水中透析除盐并浓缩得到浓度为15wt％的
丝素蛋白溶液，再向15wt％的丝素蛋白溶液中加入HRP以及H2O2，其中，含丝素蛋白、催化剂
和交联剂的溶液中HRP的浓度为50unit/ml，H2O2的浓度为0.01wt％；

[0072] (1.4)向步骤(1.2)中的注模容器中注入步骤(1.3)得到的含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液与bFGF溶液；其中，bFGF溶液的浓度为85ng/ml，步骤(1.3)的丝素蛋白溶液与
bFGF溶液的体积比为4:1；

[0073] (1.5)在37℃下加热固化20min；

[0074] (1.6)采用浓度为5wt％的冰乙酸溶液溶解的方式去除圆柱体，并用水冲洗通道；

[0075] (2)将内皮细胞接种至通道中培养14d后，得到片层单元水凝胶血管网络，其中，相邻两个圆柱状通道的中心距为1.5mm，接种过程为：将浓度为150cells/ml的内皮细胞分散
液灌注到通道中，震荡20min；

[0076] (3)将多个片层单元水凝胶血管网络组装后，采用激光雕刻的方式得到具有特定形状的待修复的血管部位，最后继续培养5d得到多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管
网。

[0077] 实施例4

[0078] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于将VEGF溶液替换为HGF和PMA的混合溶液。

[0079] 实施例5

[0080] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤与实施例2基本相同，不同之处在于将MCP‑1溶液替换为PMA溶液。

[0081] 实施例6

[0082] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为S1P溶液。

[0083] 实施例7

[0084] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为bFGF和PMA的混合溶液。

[0085] 实施例8

[0086] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为MCP‑1和PMA的混合溶液。

[0087] 实施例9

[0088] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为S1P和VEGF的混合溶液。

[0089] 实施例10

[0090] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为S1P和MCP‑1的混合溶液。

[0091] 实施例11

[0092] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为S1P和bFGF的混合溶液。

[0093] 实施例12

[0094] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为S1P和HGF的混合溶液。

[0095] 实施例13

[0096] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为S1P和PMA的混合溶液。

[0097] 实施例14

[0098] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为生长因子的混合溶液；其中，生长因子包含HGF、
VEGF、MCP‑1、bFGF和S1P。

[0099] 实施例15

[0100] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤与实施例3基本相同，不同之处在于将bFGF溶液替换为生长因子的混合溶液；其中，生长因子包含
VEGF、MCP‑1、PMA和S1P。

[0101] 实施例16

[0102] 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3D打印制法，其制备步骤如下：

[0103] (1)利用3D打印技术制备内含片层单元血管通道和生长因子的水凝胶，具体为：

[0104] (1.1)构建圆柱体模型，具体过程为：首先将壳聚糖溶解在2％(w/w)的冰乙酸中配制成浓度为18％(w/v)的3D打印溶液，然后将3D打印溶液倒入3D打印装置的料管中，由3D打
印装置对构建好的模型进行线形逐层打印，最后对打印得到的产物进行冻干处理，其中，圆
柱体的直径为0.8mm；打印参数为：注射压力1.6bar，打印速度4.2mm/s，打印喷嘴直径
0.55mm；

[0105] (1.2)将步骤(1.1)中得到的模型置于注模容器中后进行组合，至所有的圆柱体位于同一空间层面或不同空间层面形成平面人体动脉血管网络状结构，其中，注模容器的内
表面涂有脱模剂(5wt％Pluronic F127溶液)，注模容器的材质为PDMS；

[0106] (1.3)制备含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液：在温度为36℃的条件下，将蚕丝纤维在浓度为9.1M的溴化锂溶液中溶解2.5h后在水中透析除盐并浓缩得到浓度为9wt％的
丝素蛋白溶液，再向9wt％的丝素蛋白溶液中加入氯化三(2,2'‑联吡啶)钌(II)六水合物和
过硫酸铵，其中，含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液中氯化三(2,2'‑联吡啶)钌(II)六水
合物的浓度为10mM，过硫酸铵的浓度为20mM；

[0107] (1.4)向步骤(1.2)中的注模容器中注入步骤(1.3)得到的含丝素蛋白、催化剂和交联剂的溶液与VEGF和MCP‑1的混合溶液；其中，混合溶液的浓度为100ng/ml，VEGF和MCP‑1
的体积比为1:1，步骤(1.3)的丝素蛋白溶液与VEGF和MCP‑1的混合溶液的体积比为5:1；

[0108] (1.5)在250W的光源下放置10min，确保丝素水凝胶完全固化；

[0109] (1.6)采用浓度为2.8wt％的冰乙酸溶液溶解的方式去除圆柱体，并用水冲洗通道；

[0110] (2)将内皮细胞接种至通道中培养10d后，得到片层单元水凝胶血管网络，其中，相邻两个圆柱状通道的中心距为2.8mm，接种过程为：将浓度为100cells/ml的内皮细胞分散
液灌注到通道中，震荡10min；

[0111] (3)将多个片层单元水凝胶血管网络组装后，采用切削的方式得到具有特定形状的待修复的血管部位，最后继续培养5d得到多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网。