白花蛇舌草多糖及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途

摘要

本发明属中药领域，涉及白花蛇舌草多糖，具体涉及白花蛇舌草中五个天然均一多糖及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途。本发明从清热解毒类中药白花蛇舌草中分离得到五个均一多糖HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7，经实验，结果证实所述的白花蛇舌草均一多糖对补体激活有显著的抑制作用，可进一步作为活性成分，制备新型抗补体药物。

权利要求

1.具有以下结构特征的白花蛇舌草多糖HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7在制备补体抑制药物中的用途；

(1)白花蛇舌草多糖HDP‑3的结构特征为：六种单糖组成的多糖，分子量为208kDa；总糖含量为90％；蛋白含量低于1％；糖醛酸含量为28％；单糖摩尔比为阿拉伯糖:鼠李糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖:半乳糖醛酸＝1.1:1.8:1.1:0.9:1.4:2.5；连接方式以端基半乳糖醛酸、1,4‑连接半乳糖醛酸、1,4‑连接半乳糖、端基鼠李糖为主；

(2)白花蛇舌草多糖HDP‑4的结构特征为：五种单糖组成的多糖，分子量为194kDa；总糖含量为93％；蛋白含量低于1％；糖醛酸含量为11％；单糖摩尔比甘露糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:葡萄糖:半乳糖＝2.1:1.4:1.1:2.7:2.8；连接方式以1,4‑连接半乳糖、1,4,6‑连接甘露糖、1,3,4‑连接半乳糖、1,3‑连接葡萄糖、端基半乳糖、端基甘露糖为主；

(3)白花蛇舌草多糖HDP‑5的结构特征为：六种单糖组成的多糖，分子量为742kDa；总糖含量为91％；蛋白含量为1％；糖醛酸含量为6％；单糖摩尔比为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝6.8:3.5:2.7:15.2:9.9:3.4；连接方式以端基甘露糖、1,4‑连接葡萄糖、1,4,6‑连接半乳糖为主；

(4)白花蛇舌草多糖HDP‑6的结构特征为：五种单糖组成的多糖，分子量为238kDa；总糖含量为93％；蛋白含量低于1％；单糖摩尔比为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖＝

3.6:2.4:9.0:5.3:5.7；连接方式以1,4‑连接葡萄糖、端基甘露糖和1,3‑连接半乳糖为主；

(5)白花蛇舌草多糖HDP‑7的结构特征为：五种单糖组成的多糖，分子量为166kDa；总糖含量为91％；蛋白含量低于1％；单糖摩尔比为甘露糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖＝

2.8:2.5:14.1:4.4:3.0；连接方式以端基葡萄糖和1,4‑连接葡萄糖为主。

说明书

白花蛇舌草多糖及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途

技术领域

[0001] 本发明属中药领域，涉及白花蛇舌草多糖，具体涉及白花蛇舌草中五个天然均一多糖及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途。

背景技术

[0002] 补体系统是是人体免疫系统的重要组成部分，其正常激活在消灭外来微生物、清除机体内损伤或死亡的细胞和组织、维持机体的平衡中起着重要的作用。然而在某些情况下，补体系统的异常激活会引起人体免疫系统的过度反应，造成人体自身正常组织的损伤，如风湿及类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、流感病毒引发的急性肺炎和重症非典型性肺炎(SARS)等。由此可见，抑制补体系统的异常激活时治疗上述疾病的重要途径之一。

[0003] 目前，临床上允许使用的糖皮质激素、环磷酰胺、甲胺蝶呤等传统免疫抑制剂类药物虽然对某些与补体过度激活相关的疾病有一定程度的缓解作用，但由于该类药物并非专一的补体抑制剂，长期应用会降低机体的防御机能，导致抗感染能力下降，易继发感染和使潜在病灶扩散，产生多种并发症和副作用。因此，寻找高效低毒的新型补体抑制剂为临床上治疗该类疾病的当务之急。药用植物中广泛存在具有抗补体活性的成分，这些天然活性成分大多对机体低毒，且可被机体直接消化吸收。我国中药资源丰富,有许多中药对免疫系统有明显的调节作用,是寻找抗补体类药物前体的宝贵资源。在抗击SARS期间，中医、中药对SARS的防治取得显著效果，因此从药用植物中寻找新型高效的抗补体物质具有重要意义。

[0004] 白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Wild.)是茜草科(Rubiaceae)耳属植物一年生草本白花蛇舌草的的带根全草，性味苦、甘、寒，具有清热、利湿、解毒等功效。传统上用于毒蛇咬伤、结肠炎、肠胃溃疡、肝炎、疮痈肿毒、急慢性喉炎等的治疗，现代研究发现白花蛇舌草具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化活性、调节免疫以及负性心肌等药理作用。白花蛇舌草含有环烯醚萜类、含酸化合物、蒽醌类化合物、挥发性成份、苯丙素类、香豆素及多糖类等几十种化合物，还有多种微量元素。等化学成分，其中的多糖成分是有效的免疫调节剂，可明显杀伤肿瘤细胞，还兼备抗衰老作用研究发现白花蛇舌草粗多糖具有显著的抗补体活性，CH50和AP50分别为63μg/ml，87μg/ml，但尚未见有关白花蛇舌草中抗补体活性均一多糖分离制备的报道。

[0005] 基于现有技术的现状与基础，本申请的发明人拟提供白花蛇舌草多糖及其制备方法和在制备抗补体药物中的用途。

发明内容

[0006] 本发明的目的是基于现有技术的现状与基础，提供天然药物中具有抗补体作用的活性成分，具体涉及白花蛇舌草多糖及其制备方法和在制备补体抑制药物中的用途。

[0007] 本发明对常用清热解毒类中药白花蛇舌草的水提取物进行分离获得五个均一多糖，HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7，所述的白花蛇舌草多糖的结构特征如下：

[0008] (1)白花蛇舌草多糖HDP‑3的结构特征为：六种单糖组成的多糖，分子量约为208kDa；总糖含量约为90％；蛋白含量低于1％；糖醛酸含量约为28％。单糖摩尔比为阿拉伯糖：鼠李糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝1.1:1.8:1.1:0.9:1.4:2.5；连接方式以端基半乳糖醛酸、1,4‑连接半乳糖醛酸、1,4‑连接半乳糖、端基鼠李糖为主；

[0009] (2)白花蛇舌草多糖HDP‑4的结构特征为：五种单糖组成的多糖，分子量约为194kDa；总糖含量约为93％；蛋白含量低于1％；糖醛酸含量约为11％。单糖摩尔比甘露糖：
鼠李糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖＝2.1:1.4:1.1:2.7:2.8；连接方式以1,4‑连接半乳糖、1,4,6‑连接甘露糖、1,3,4‑连接半乳糖、1,3‑连接葡萄糖、端基半乳糖、端基甘露糖为主；

[0010] (3)白花蛇舌草多糖HDP‑5的结构特征为：六种单糖组成的多糖，分子量约为742kDa；总糖含量约为91％；蛋白含量约为1％；糖醛酸含量约为6％，单糖摩尔比为甘露糖：
鼠李糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝6.8:3.5:2.7:15.2:9.9:3.4；连接方式以端基甘露糖、1,4‑连接葡萄糖、1,4,6‑连接半乳糖为主；

[0011] (4)白花蛇舌草多糖HDP‑6的结构特征为：六种单糖组成的多糖，分子量约为238kDa；总糖含量约为93％；蛋白含量低于1％。单糖摩尔比为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝3.6:2.4:9.0:5.3:5.7；连接方式以1,4‑连接葡萄糖、端基甘露糖和1,3‑连接半乳糖为主；

[0012] (5)白花蛇舌草多糖HDP‑7的结构特征为：五种单糖组成的多糖，分子量约为166kDa；总糖含量约为91％；蛋白含量低于1％，单糖摩尔比为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝2.8:2.5:14.1:4.4:3.0；连接方式以端基葡萄糖和1,4‑连接葡萄糖为主。

[0013] 本发明提供了所述的白花蛇舌草多糖HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7的制备方法，包括：

[0014] 白花蛇舌草以95％乙醇提取，滤过，残渣烘干后，用热水提取，提取液经滤过，浓缩，加入4倍体积的95％乙醇，静置，离心去上清，沉淀用水复溶，再以三氯醋酸去除蛋白，离心，上清液调至中性，浓缩，透析，冷冻干燥得粗多糖，粗多糖加蒸馏水溶解，用DEAE‑cellulose柱色谱初步分离，以蒸馏水、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mol/L的NaCl溶液洗脱，收集各流份，浓缩，透析(截留分子量14000Da)及冻干得6个次级组分：Water‑HDP、0.1M‑HDP、0.2M‑HDP、0.4M‑HDP、0.8M‑HDP及1.6M‑HDP；

[0015] 各个次级组分加入适量流动相溶解，离心，上清液用凝胶色谱Sephacryl S‑200和S‑300进行分离，收集各流份；隔管检测490nm(硫酸‑苯酚法显色后)下的吸光度值，合并流份，浓缩及冷冻干燥得到均一多糖：HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7。

[0016] 本发明中，所述的中药白花蛇舌草是茜草科耳属植物白花蛇舌草的带根全草。

[0017] 本发明进一步提供了制得的均一多糖：HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7在制备补体抑制药物中的用途。

[0018] 本发明进行了体外试验，结果证实，白花蛇舌草多糖HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7对补体经典和旁路途径激活所引发的细胞溶血均有明显的抑制，即有明显的抗补体作用；

[0019] 白花蛇舌草多糖HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7的CH50值(经典途径50％抑制溶血所需供试品的浓度)分别约为1022μg/mL、84μg/mL、115μg/mL、53μg/mL和154μg/mL；HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7的AP50值(旁路途径50％抑制溶血所需供试品的浓度)分别约为
176μg/mL、307μg/mL、74μg/mL和207μg/mL，HDP‑3无旁路补体抑制活性。

[0020] 本发明从清热解毒类中药白花蛇舌草中分离得到五个均一多糖HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7，经实验证实所述的白花蛇舌草均一多糖对补体激活有显著的抑制作用，可进一步作为活性成分，制备新型抗补体药物。

附图说明

[0021] 图1，白花蛇舌草均一多糖分离流程图。

[0022] 图2，制得五个均一多糖HDP‑3(A)、HDP‑4(B)、HDP‑5(C)、HDP‑6(D)、HDP‑7(E)的HPGPC色谱图，其中，TSK‑GELGMPWXL凝胶柱(300×7.6mm)；洗脱液：蒸馏水；流速：0.8ml/min。

具体实施方式

[0023] 实施例1制备白花蛇舌草多糖

[0024] 白花蛇舌草药材10kg粉碎，以95％乙醇提取，滤过，药渣用水溶液提取3次，浓缩，离心，上清液加入4倍体积的95％乙醇，静置，离心去上清，沉淀以水复溶，减压回收，除去乙醇；复溶液再以10％三氯醋酸去除游离蛋白，离心，上清液调至中性，透析，浓缩，冷冻干燥即得粗多糖，粗多糖120g加蒸馏水溶解，离心，上清液用DEAE‑cellulose柱色谱进行初步分离。以蒸馏水、0.1、0.2、0.4和0.8mol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱体积大于2倍柱体积(约10L)，流速为25mL/min，收集各流份，隔管检测490nm(硫酸‑苯酚法显色后)下的吸光度值。根据糖显色反应并结合HPGPC检测的结果，合并流分，浓缩，透析及冷冻干燥得6个次级组分：Water‑HDP、0.1M‑HDP、0.2M‑HDP、0.4M‑HDP、0.8M‑HDP及1.6M‑HDP；

[0025] 将0.1M‑HDP(8.26g)加蒸馏水溶解，离心，上清液用SephacrylTM S‑200凝胶色谱柱分离，用蒸馏水溶液洗脱，流速为0.5mL/min，收集各流分，隔管检测490nm(硫酸‑苯酚法显色后)下的吸光度值，根据HPGPC检测结果合并相同流分，浓缩、透析及冷冻干燥得均一多糖HDP‑3(60mg)；

[0026] 将0.2M‑HDP(5.93g)加蒸馏水溶解，离心，上清液分次用SephacrylTM S‑200色谱分离，用蒸馏水洗脱，流速为0.5mL/min，收集各流分，隔管检测490nm(硫酸‑苯酚法显色后)下的吸光度值，根据HPGPC检测结果合并相同流分，浓缩、透析及冷冻干燥得均一多糖HDP‑4(500mg)；

[0027] 将0.4M‑HDP(6.92g)加蒸馏水溶解，离心，上清液分次用SephacrylTM S‑200色谱分离，用蒸馏水洗脱，流速为0.5mL/min，收集各流分，隔管检测490nm(硫酸‑苯酚法显色后)下的吸光度值，根据HPGPC检测结果合并相同流分，浓缩、透析及冷冻干燥得均一多糖HDP‑5(1500mg)；

[0028] 将0.8M‑HDP(3.32g)加蒸馏水溶解，离心，上清液分次用SephacrylTM S‑300色谱分离，用蒸馏水洗脱，流速为0.5mL/min，收集各流分，隔管检测490nm(硫酸‑苯酚法显色后)下的吸光度值，根据HPGPC检测结果合并相同流分，浓缩、透析及冷冻干燥得均一多糖HDP‑6(60mg)；

[0029] 将1.6M‑HDP(2.04g)加蒸馏水溶解，离心，上清液分次用SephacrylTM S‑300色谱分离，用蒸馏水洗脱，流速为0.5mL/min，收集各流分，隔管检测490nm(硫酸‑苯酚法显色后)下的吸光度值，根据HPGPC检测结果合并相同流分，浓缩、透析及冷冻干燥得均一多糖HDP‑7(60mg)；

[0030] 经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)检测，真是制得的白花蛇舌草多糖HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7均为均一成分。

[0031] 实施例2白花蛇舌草多糖(HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7)的结构表征[0032] (1)分子量的测定

[0033] 采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)进行多糖样品的相对分子力量的测定，基于基本原理是均一多糖通过凝胶渗透色谱，形成对称的色谱峰，出峰时间与分子量大小相关，根据已知分子量得出的标准曲线进行计算；

[0034] 色谱条件：用TSK GMPWXL凝胶柱进行分离，流速0.8mg/mL，进样量20μL，超纯水为流动相，柱温25℃，检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)；

[0035] 实验方法：准确称取均一多糖和Dextrans系列标准品各2.0mg，用蒸馏水配置成2.0mg/mL的溶液，进样前过0.45微米的微孔滤膜后检测，记录保留时间，以标准多糖分子量的对数值(Lg)为纵坐标，保留时间为横坐标绘制标准曲线，得出相应的线性回归方程，计算均一多糖的相对分子量。HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7的相对分子量分别为
208.1kDa、194.5kDa、742.2kDa、238.7kDa和166.2kDa；

[0036] (2)总糖、糖醛酸、蛋白及硫酸基含量测定

[0037] 硫酸‑苯酚法测定HDP‑3总糖含量为90.00±3.60％，HDP‑4总糖含量为92.99±2.79％，HDP‑5总糖含量为90.61±2.72％，HDP‑6总糖含量为93.13±2.79％，HDP‑7总糖含量为91.35±2.74％；

[0038] 间羟联苯法测定检测糖醛酸含量，HDP‑3糖醛酸含量为28.45±0.85％，HDP‑4糖醛酸含量为10.80±0.32％，HDP‑5糖醛酸含量为6.51±0.20％；

[0039] 考马斯亮蓝法测定蛋白含量：HDP‑3蛋白含量为0.54±0.02％，HDP‑4蛋白含量为0.79±0.02％，HDP‑5蛋白含量为1.01±0.03％，HDP‑6蛋白含量为0.97±0.03％，HDP‑7蛋白含量为0.68±0.02％；

[0040] (3)单糖组成分析

[0041] HDP‑3、HDP‑4、HDP‑5、HDP‑6和HDP‑7分别经2mol/L TFA于110℃反应5h进行完全酸水解，得到的完全酸水解产物再在浓氨水的碱性条件与2mol/L PMP甲醇溶液反应150min进行衍生化，衍生化产物进行LC‑MS分析；

[0042] HDP‑3是由六种单糖组成的多糖单糖摩尔比为阿拉伯糖：鼠李糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖：半乳糖醛酸＝1.1:1.8:1.1:0.9:1.4:2.5；

[0043] HDP‑4是由五种单糖组成的多糖，单糖摩尔比甘露糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖＝2.1:1.4:1.1:2.7:2.8；

[0044] HDP‑5是由六种单糖组成的多糖，单糖摩尔比为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝6.8:3.5:2.7:15.2:9.9:3.4；

[0045] HDP‑6是由五种单糖组成的多糖，单糖摩尔比为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝3.6:2.4:9.0:5.3:5.7；

[0046] HDP‑7是由五种单糖组成的多糖，单糖摩尔比为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝2.8:2.5:14.1:4.4:3.0；

[0047] (4)甲基化分析

[0048] 采用改良Hakomori法分别对多糖进行甲基化(HDP‑3，HDP‑4和HDP‑5含有糖醛酸多糖的先用CMC‑NaBH4还原后再甲基化)，甲基化后的产物用0.2mol/L TFA全水解，NaBD4还原和醋酐乙酰化制成部分甲基化的阿尔迪醇乙酸酯衍生物，然后进行GC‑MS分析；

[0049] HDP‑3甲基化结果显示结构中含端基连接半乳糖醛酸，1,3‑连接鼠李糖，1,4‑连接半乳糖醛酸，端基连接鼠李糖，1,3‑连接阿拉伯糖，1,4‑连接半乳糖，1,3,5‑连接阿拉伯糖，1,3,4‑连接葡萄糖，1,3,4‑连接甘露糖，1,4,6‑甘露糖，1,3,6‑连接葡萄糖，1,4,6‑连接葡萄糖，1,4‑连接甘露糖，摩尔比为2.8:1.0:2.8:2.8:1.0:3.9:1.0:0.9:0.9:0.9:0.9:0.8:
1.0。其中，主要以端基半乳糖醛酸、1,4‑连接半乳糖醛酸、1,4‑连接半乳糖、端基鼠李糖为主；

[0050] HDP‑4甲基化结果显示结构中含：1,4,6‑连接甘露糖，1,3,4‑连接半乳糖，1,3‑连接葡萄糖醛酸，1,4‑连接葡萄糖，1,3,6‑连接半乳糖，1,3‑连接鼠李糖，端基连接鼠李糖，端基连接半乳糖，端基连接甘露糖，其摩尔比为2.0:2.2:2.0:5.7:1.0:1.2:1.1:2.2:2.0，其中，主要以1,4‑连接半乳糖、1,4,6‑连接甘露糖、1,3,4‑连接半乳糖、1,3‑连接葡萄糖、端基半乳糖、端基甘露糖为主；

[0051] HDP‑5甲基化结果显示结构中含：端基连接阿拉伯糖，端基连接鼠李糖，1,5‑连接阿拉伯糖，端基连接甘露糖，端基连接葡萄糖，1,4‑连接甘露糖，1,4‑连接葡萄糖，1,3‑连接甘露糖，1,3,4‑连接葡萄糖，1,4,6‑连接半乳糖，1,4,6‑连接葡萄糖，其摩尔比为1.0:1.8:0.8:2.8:1.0:0.8:4.0:1.0:0.9:3.9:2.0，其中，以端基甘露糖、1,4‑连接葡萄糖、1,4,6‑连接半乳糖为主；

[0052] HDP‑6甲基化结果显示结构中含：端基连接阿拉伯糖，端基连接鼠李糖，1,5‑连接阿拉伯糖，端基连接甘露糖，端基连接葡萄糖，端基连接半乳糖，1,3‑连接半乳糖，1,4‑连接甘露糖，1,4‑连接葡萄糖，1,3,5‑连接阿拉伯糖，1,3,4‑葡萄糖，1,3,4,6‑连接葡萄糖，1,3,6‑连接半乳糖，1,2,4,6‑连接葡萄糖，其摩尔比为1.7:1.8:0.9:2.0:1.0:1.0:2.0:0.8:
3.0:1.8:1.0:1.0:1.0:0.9，其中，主要以1,4‑连接葡萄糖、端基甘露糖和1,3‑连接半乳糖为主；

[0053] HDP‑7甲基化结果显示结构中含：端基连接阿拉伯糖，端基连接鼠李糖，1,3‑连接鼠李糖，端基连接葡萄糖，1,2‑连接甘露糖，1,3‑连接半乳糖，1,4‑连接葡萄糖，1,6‑连接半乳糖，1,2‑连接阿拉伯糖，1,2,4‑连接葡萄糖，1,2,6‑连接甘露糖，1,2,3,4‑连接葡萄糖，1,3,6‑连接半乳糖，1,3,4,6‑连接半乳糖，其摩尔比为0.9:1.0:1.0:5.1:1.0:1.1:2.9:0.9:
1.1:0.9:1.0:1.0:1.1:1.0，其中，主要以端基葡萄糖和1,4‑连接葡萄糖为主。

[0054] 实施例3经典途径补体抑制试验

[0055] 取3个月龄豚鼠的血清，并用2％的绵羊红细胞敏化，以巴比妥缓冲液稀释为1:100，作为本次经典途径的补体来源，将兔抗羊红细胞的抗体以巴比妥缓冲液(BBS)稀释为
1:1000作为溶血素；保存于Alsever液中的羊红细胞(SRBC)配置成2％SRBC。精密称量多糖
3mg，加入BBS缓冲液溶解，对倍稀释成8个浓度。不同浓度的多糖溶液200μL与已经稀释到1：
100的补体200μL在37℃预孵育10min后，依次加入100μL溶血素(1:1000)和100μL 2％SRBC，在37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min。每管取200μL上清于96孔板中，在405nm测定吸光度；实验同时设置多糖对照组(200μL相应浓度的多糖加
400μLBBS缓冲液)、补体对照组(以200μL BBS缓冲液代替多糖)和全溶血组(100μL 2％SRBC溶于500μL三蒸水中，将各浓度的多糖组吸光度值扣除相应多糖对照组吸光度值后计算溶血抑制率。以多糖浓度的对数作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，得到的拟合曲线计算50％抑制溶血所需供试品的浓度(CH50值)，以肝素作为阳性对照药，结果显示，所述的均一多糖对补体经典途径激活均具有显著的抑制活性(如表1所示)。

[0056] 实施例4旁路途径补体抑制试验

[0057] 取健康成年男性志愿者血清，以EGTA‑BBS缓冲液(巴比妥缓冲液，pH＝7.4，含5mM 2+
Mg 和8mM EGTA)稀释为1:10，作为旁路途径的补体来源，保存于3.8％枸橼酸钠溶液的兔红细胞以EGTA‑BBS缓冲液配置成0.5％兔红细胞，精密称量多糖约3mg，加入EGTA‑BBS缓冲液，对倍稀释成8个浓度，不同浓度的多糖溶液150μL与1:8的补体150μL在37℃预孵育10min后，加入200μL 0.5％兔红细胞，在37℃水浴30min后放入低温高速离心机，在5000rpm、4℃条件下离心10min，每管取200μL上清于96孔板中，在405nm测定吸光度，实验同时设置多糖对照组(150μL相应浓度的多糖溶液加350μL EGTA‑BBS缓冲液)、补体对照组(以150μL EGTA‑BBS缓冲液代替；

[0058] 多糖溶液和全溶血组(200μL 0.5％兔红细胞溶于300μL三蒸水中)，将各浓度的多糖组吸光度值扣除相应多糖对照组吸光度值后计算溶血抑制率，以多糖浓度的对数作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，得到的拟合曲线计算50％抑制溶血所需供试品的浓度(AP50值)，以肝素作为阳性对照药，结果如表1所示。

[0059] 表1五种白花蛇舌草均一多糖对补体激活的抑制作用

[0060]

[0061] CH50和AP50值表达为：平均值±SD(n＝3)；NA：No active。