一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用、检测引物、试剂盒

摘要

本发明涉及一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用、检测引物、试剂盒，属于基因工程及肿瘤学领域。本发明的lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，所述lncRNA标志物为KCNMA1‑AS2‑201，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。本发明的lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，利用该标志物在结直肠癌组织中呈特异性低表达，而在正常组织中没有这种特异性低表达的特点，可将其作为一个特异的分子标志物来设计合成特异性检测试剂，用于临床结直肠癌的早期辅助诊断，提高结直肠癌的诊断效率。

权利要求

1.一种检测lncRNA标志物表达量的试剂在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，其特征在于：所述lncRNA标志物为KCNMA1‑AS2‑201，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的检测lncRNA标志物表达量的试剂在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，其特征在于：根据所述的lncRNA标志物序列设计合成特异性检测试剂，用于制备结直肠癌早期诊断产品。

3.根据权利要求2所述的检测lncRNA标志物表达量的试剂在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，其特征在于：所述结直肠癌早期诊断产品为制剂。

4.根据权利要求2所述的检测lncRNA标志物表达量的试剂在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，其特征在于：所述结直肠癌早期诊断产品为芯片或试剂盒。

说明书

一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用、

检测引物、试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用、检测引物、试剂盒，属于基因工程及肿瘤学领域。

背景技术

[0002] lncRNA是一类长度大于200bp的核苷酸，不具备蛋白质编码功能，但具有广泛的基因表达调控的非编码RNA分子。lncRNA在20世纪80年代以前并不认为在生物翻译功能中扮演重要角色。然而，lncRNA作为潜在的诊断性生物标志物和治疗靶点，近年来受到了临床和实验室的广泛关注。有报道称lncRNA在不同的癌症中异常表达，可分为致癌基因或抑癌基因。lncRNAs随后被证实参与了细胞增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭等多种生物学过程，并参与了多种生物学途径。此外，它们在控制微小RNA(microRNA,miRNA)功能方面也起着关键作用，lncRNA可作为内源竞争RNA从而进一步影响靶mRNA。lncRNA生物学功能广泛，涉及染色体修饰、转录及转录后调控、翻译调控、表观调控及细胞周期调节等。

[0003] 结直肠癌(colorectal cancer,CRC)作为消化系统常见的恶性肿瘤之一，癌症死亡率高且发病趋向老龄化。全世界每年有120万以上的新病例，超过60万例死亡。在亚洲国家，结直肠癌发病率和死亡率都在迅速增长，且五年生存率仅有64.9％。早发现、早诊断、早对大幅提高癌症治愈率和延长生存期意义重大，结直肠癌的检测手段亟待发展。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，能够提高结直肠癌早期诊断的效率。

[0005] 本发明的目的还在于提供一种检测引物和包含该检测引物的试剂盒。

[0006] 为了实现以上目的，本发明的lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用所采用的技术方案是：

[0007] 一种lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，所述lncRNA标志物为KCNMA1‑AS2‑201，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

[0008] 本发明的lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，利用该标志物在结直肠癌组织中呈特异性低表达，而在正常组织中没有这种特异性低表达的特点，可将其作为一个特异的分子标志物来设计合成特异性检测试剂，用于临床结直肠癌的早期辅助诊断，提高结直肠癌的诊断效率。

[0009] 优选的，根据所述的lncRNA标志物序列设计合成特异性检测试剂，用于制备结直肠癌早期诊断产品。

[0010] 所述结直肠癌早期诊断产品为制剂、芯片或试剂盒。

[0011] 本发明根据KCNMA1‑AS2‑201序列设计合成特异性检测试剂(如引物、DNA探针等)，该试剂能基于定量PCR方法和/或高通量测序方法和/或探针杂交方法等检测样本中KCNMA1‑AS2‑201的表达水平，或者基于免疫学方法检测KCNMA1‑AS2‑201调控的靶基因的表达水平，并以此作为结直肠癌早期诊断的有效信息。

[0012] 本发明的检测引物所采用的技术方案为：

[0013] 一种检测引物，所述检测引物根据lncRNA标志物序列设计合成；所述lncRNA标志物为KCNMA1‑AS2‑201，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

[0014] 本发明的检测引物能特异性识别KCNMA1‑AS2‑201并检测组织中KCNMA1‑AS2‑201的表达量，为临床结直肠癌的早期诊断提供有效信息。

[0015] 优选的，所述检测引物的序列如下所示：

[0016] KCNMA1‑AS2‑201 Primer F：5′‑CTCCCTTATCCCACTTCC‑3′；

[0017] KCNMA1‑AS2‑201 Primer R：5′‑CTCTTGCATGGGTTCTGT‑3′。

[0018] 本发明的试剂盒所采用的技术方案为：

[0019] 一种试剂盒，包括上述的检测引物。

[0020] 本发明的试剂盒中包含上述能特异性识别KCNMA1‑AS2‑201并检测组织中KCNMA1‑AS2‑201的表达量的引物，组成简单，使用方便、定量准确，检测结果稳定可靠，可以提高临床结直肠癌早期诊断的敏感性和特异性。

[0021] 优选的，所述试剂盒还包括聚合酶链式反应试剂及其反应缓冲液、dNTP、内参引物和荧光染料。所述内参引物可以为GAPDH管家基因的特异性检测引物。所述荧光染料可以选择SYBR‑Green染料。

[0022] 优选的，所述试剂盒还包括RNA提取试剂和cDNA逆转录试剂。该试剂盒结合常用的RNA提取试剂和通用的逆转录试剂，可以特异地检测组织中KCNMA1‑AS2‑201的表达量，有效地用于结直肠癌早期辅助诊断。

[0023] 试验证明，使用常用的PCR试剂和T7启动子转录合成RNA试剂，可以特异地在细胞中提高KCNMA1‑AS2‑201的表达量，结果表明提高KCNMA1‑AS2‑301的表达可对细胞增殖产生抑制作用。本发明中与结直肠癌早期诊断相关的lncRNA标志物为临床治疗结直肠癌提供了新的药物靶点，可通过干扰该lncRNA标志物的表达抑制结直肠癌的生长和转移。

附图说明

[0024] 图1为试验例2中病例1～4以及病例7～10结直肠癌病人KCNMA1‑AS2‑201相对表达量；

[0025] 图2为试验例2中病例5～6的结直肠癌病人KCNMA1‑AS2‑201相对表达量；

[0026] 图3为试验例3中5种细胞系KCNMA1‑AS2‑201相对表达量；

[0027] 图4为试验例4中在HCT116细胞系中过表达KCNMA1‑AS2‑201结果；

[0028] 图5为试验例4中在SW1463细胞系中过表达KCNMA1‑AS2‑201结果；

[0029] 图6为试验例5中MTT法检测过表达lncRNA KCNMA1‑AS2‑201对HCT116细胞增殖的影响；

[0030] 图7为试验例5中MTT法检测过表达lncRNA KCNMA1‑AS2‑201对SW1463细胞增殖的影响。

具体实施方式

[0031] 以下结合具体实施方式本发明的技术方案作进一步的说明。

[0032] 除特殊说明的外，以下各实施例及试验例中所用细胞系、试剂等均为市售商品。结直肠癌细胞系均来自于ATCC细胞库。

[0033] 实施例1

[0034] 本实施例的lncRNA标志物在制备结直肠癌早期诊断产品中的应用，是依据lncRNA标志物KCNMA1‑AS2‑201设计合成特异性检测引物用于制备结直肠癌早期诊断的试剂盒；lncRNA标志物为KCNMA1‑AS2‑201，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；上述的特异性检测引物序列如下所示：

[0035] KCNMA1‑AS2‑201 Primer F(SEQ ID NO.1)：5’‑CTCCCTTATCCCACTTCC‑3’；

[0036] KCNMA1‑AS2‑201 Primer R(SEQ ID NO.2)：5’‑CTCTTGCATGGGTTCTGT‑3’。

[0037] 实施例2

[0038] 本实施例的检测引物为用于检测与结直肠癌早期诊断相关的lncRNA标志物的表达水平的引物，根据KCNMA1‑AS2‑201序列设计合成，引物序列如下所示：

[0039] KCNMA1‑AS2‑201 Primer F(SEQ ID NO.1)：5’‑CTCCCTTATCCCACTTCC‑3’；

[0040] KCNMA1‑AS2‑201 Primer R(SEQ ID NO.2)：5’‑CTCTTGCATGGGTTCTGT‑3’。

[0041] 本实施例的检测引物可用于检测样本中KCNMA1‑AS2‑201的表达量，作为结直肠癌早期诊断的有效信息。

[0042] 实施例3

[0043] 本实施例的试剂盒为用于结直肠癌早期诊断的lncRNA试剂盒(用于30次反应)，组成如下：

[0044]

[0045] 使用本实施例的试剂盒，结合常用的RNA提取试剂和通用的逆转录试剂，可以特异地检测组织中KCNMA1‑AS2‑201的表达量，有效地用于结直肠癌早期辅助诊断。

[0046] 试剂盒的另一实施例与实施例3的试剂盒的区别仅在于包括RNA提取试剂和通用的逆转录试剂。

[0047] 实施例3中lncRNA试剂盒的效果检查：

[0048] 选取新乡医学院第一附属医院胃肠外科2018‑2019年50例结直肠癌病例，提取新鲜组织标本中的总RNA，采用试验例3的方法检测KCNMA1‑AS2‑201的相对表达量。

[0049] 结果显示，lncRNA试剂盒能够特异、有效地扩增出KCNMA1‑AS2‑201序列。统计分析结果表明，在50例结直肠癌病人中KCNMA1‑AS2‑201相对表达量均有明显的降低，平均降低了16.131倍(P＜0.01)。因此，KCNMA1‑AS2‑201可以作为一个特异的分子标志物来提高结直肠癌的诊断效率。

[0050] 试验例1

[0051] 筛选与结直肠癌早期诊断相关的lncRNA标志物，包括以下步骤：

[0052] 1)选取胃肠外科收治的结直肠癌患者的肿瘤组织和邻近5cm以外正常结肠组织作为对照，病人肿瘤分型确定，病人未经任何放疗和化疗，使用lncRNA测序检测差异表达的lncRNA；

[0053] 2)使用Trizol，提取总RNA；

[0054] 3)总RNA质量检测，浓度及纯度采用nanodrop2000检测，完整性采用RNA专用琼脂糖电泳(或是2100生物分析仪)检测；

[0055] 4)使用Ribo‑Zero rRNA Removal Kit去除总RNA中的核糖体RNA；

[0056] 利用RNase R消化线性RNA；

[0057] 利用带有oligo‑dT的磁珠调取带有PolyA尾的RNA，以最大程度消除线性RNA；

[0058] 5)对纯化后的RNA通过离子打断的方式，打断到200‑300bp片段；

[0059] 6)第一链cDNA的合成：通过随机引物和逆转录酶的作用合成第一链cDNA；

[0060] 第二链cDNA的合成：以第一链cDNA为模板进行第二链cDNA的合成(注：第二链cDNA合成时，其中的碱基T，被替换成U，从而达到链特异性文库的目的)；

[0061] 对双链cDNA进行末端修复补平，再在3’端加个A，然后在链接酶的作用下加上测序接头；

[0062] 7)通过磁珠的方式对上述加好接头的产物进行片段的选择，去除多余的接头序列；

[0063] 8)PCR扩增富集文库片段，扩增完后进行一个片段大小的选择，文库大小在300‑400bp；

[0064] 9)文库质检：2100检测文库大小，荧光定量检测文库总浓度；

[0065] 10)文库的稀释与混合：根据文库的有效浓度、文库需要得到的数据量，将含有不同index序列的文库按比例进行混合；

[0066] 混合文库统一稀释到2nM，通过碱变性，形成单链文库；

[0067] 11)Nextseq/Hiseq上机测序：根据文库的不同，选择最佳的上样量上机，以单链文库为模板进行PCR扩增、测序引物退火、边合成边测序。

[0068] 测序结果表明，与临近正常结肠组织相比，结直肠癌组织中KCNMA1‑AS2‑201的表达水平显著降低(p＜0.01)。

[0069] 试验例2

[0070] 结直肠癌组织与正常组织中KCNMA1‑AS2‑201的表达量检测，包括以下步骤：

[0071] 1)选取胃肠外科收治的10名结直肠癌患者的肿瘤组织和邻近5cm以外正常结肠组织作为对照，病人肿瘤分型确定，病人未经任何放疗和化疗。选取的肿瘤组织应尽可能避免纤维结缔组织或坏死的瘤组织，并立刻放入液氮中。

[0072] 10例结直肠癌患者资料如表1所示。

[0073] 表1 10例结直肠癌患者资料

[0074]

[0075]

[0076] 2)提取RNA

[0077] 采用TRIzol一步法提取结直肠癌肿瘤组织和正常结肠组织的总RNA，操作按照RNA提取试剂盒(Invitrogen，USA)说明书进行。采用NanoDrop2000c分别测定波长230、260、280nm处的吸光度值，确定总RNA的纯度和浓度。琼脂糖凝胶电泳检测总RNA样品，鉴定其纯度和完整度。

[0078] 3)逆转录

[0079] 操作按照HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(康为世纪)说明书进行。

[0080] 表2去除基因组DNA体系

[0081]

[0082] 表3逆转录体系

[0083]

[0084]

[0085] 4)RT qPCR

[0086] qPCR反应体系如表4所示。

[0087] 表4 SYBR Green qPCR体系：

[0088]

[0089] qPCR反应条件如表5所示。

[0090] 表5 qPCR反应条件

[0091]

[0092] 5)RT‑qPCR结果分析

[0093] 以GAPDH管家基因作为内参，采用相对定量法，计算基因的相对表达量。基因的相‑△△ct对表达量F＝2 ，F值越小意味着相对表达量降低越多。其中△△ct＝(待测样本中目的基因的ct的平均值‑待测样本中管家基因的ct的平均值)‑(对照样本中目的基因的ct的平均值‑对照样本中管家基因的ct的平均值)。

[0094] 结果发现，在10例结直肠癌病人中KCNMA1‑AS2‑201相对表达量均有明显的降低。在病例1中KCNMA1‑AS2‑201相对表达量降低了1.442倍，在病例2中降低了2.301倍，在病例3中降低了6.406倍，在病例4中降低了16.003倍，在病例5中降低了2.880倍，在病例6中降低了1640.696倍，在病例7中降低了19.673倍，在病例8中降低了167.851倍，在病例9中降低了
29.925倍，在病例10中降低了23.905倍。10例结直肠癌病人KCNMA1‑AS2‑201相对表达量见图1和图2。

[0095] 试验例3

[0096] 5种细胞系中KCNMA1‑AS2‑201的表达量检测，包括以下步骤：

[0097] 1)选取5种细胞系，其中HT‑29、HCT‑116和CaCo2是结肠癌细胞系；SW1463是直肠癌细胞系；NCM460是正常人结肠粘膜上皮细胞系。

[0098] 5种细胞系具体信息见表6。

[0099] 表6结直肠癌和正常人结肠粘膜上皮细胞系

[0100] @ATCCNo. 名称 组织 疾病 生物
TM
HTB‑38 HT‑29 结肠 结直肠腺癌 人
TM
CCL‑247 HCT‑116 结肠 结直肠癌 人
TM
HTB‑37 CaCo‑2 结肠 结直肠腺癌 人
TM
CCL‑234 SW1463 直肠 结直肠腺癌C型 人
  NCM460 结肠 正常人结肠粘膜上皮 人

[0101] 2)提取RNA

[0102] 采用TRIzol一步法提取结直肠癌肿瘤组织和正常结肠组织的总RNA，操作按照RNA提取试剂盒(Invitrogen，USA)说明书进行。采用NanoDrop2000c分别测定波长230、260、280nm处的吸光度值，确定总RNA的纯度和浓度。琼脂糖凝胶电泳检测总RNA样品，鉴定其纯度和完整度。

[0103] 3)逆转录

[0104] 操作按照HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(康为世纪)说明书进行。

[0105] 表7去除基因组DNA体系

[0106]

[0107]

[0108] 表8逆转录体系

[0109]

[0110] 4)RT qPCR

[0111] qPCR反应体系如表9所示。

[0112] 表9 SYBR Green qPCR体系：

[0113]

[0114] qPCR反应条件如表10所示。

[0115] 表10 qPCR反应条件

[0116]

[0117]

[0118] 5)RT‑qPCR结果分析

[0119] 以GAPDH管家基因作为内参，采用相对定量法，计算基因的相对表达量。基因的相‑△△ct对表达量F＝2 ，F值越小意味着相对表达量降低越多。其中△△ct＝(待测样本中目的基因的ct的平均值‑待测样本中管家基因的ct的平均值)‑(对照样本中目的基因的ct的平均值‑对照样本中管家基因的ct的平均值)。

[0120] 结果发现，在4种结直肠癌细胞系中KCNMA1‑AS2‑201相对表达量均有明显的降低(P＜0.01)。在HT29细胞系中KCNMA1‑AS2‑201相对表达量降低了5.490倍，在SW1640细胞系中降低了4.482倍，在HCT116细胞系中降低了7.015倍，在CaCo2细胞系中降低了2.542倍。5种细胞系中KCNMA1‑AS2‑201相对表达量见图3。

[0121] 试验例4

[0122] 本试验例是在细胞系内对lncRNA KCNMA1‑AS2‑201进行过表达，具体方法为：

[0123] 1)合成目标DNA片段，包括以下步骤i)合成序列T7 promoter+KCNMA1‑AS2‑201，作为双链DNA模板，使用 High‑Fidelity 2X Master Mix kit(NEB)进行扩增。

[0124] 表11 PCR体系

[0125]

[0126] 表12 PCR程序

[0127]

[0128]

[0129] ii)纯化PCR产物

[0130] 在上一步PCR产物中加入3M NaAC和100％无水乙醇使其最终浓度分别为0.3M和70％。高速离心10min，弃上清，1ml 70％乙醇清洗沉淀。离心2min,弃上清，自然风干沉淀物，加入Nuclease free水溶解沉淀，测定浓度，1.5％琼脂糖凝胶电泳验证片段大小。

[0131] iii)使用HiScribeTMT7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)合成RNA片段。

[0132] 表13合成RNA反应体系

[0133]

[0134] 将含有上述体系的反应管至于37℃条件下孵育10hr。加入30μl Nuclease free水稀释产物。加入2μl DNase I，混合并于37℃孵育15min去除DNA。加入25μl LiCl混合均匀，放置于‑20℃孵育30min。4℃离心15分钟沉淀RNA。弃上清，加入500μl 75％乙醇清洗沉淀。风干沉淀，加入0.1mM EDTA溶解沉淀，测定RNA浓度，存放于‑80℃。

[0135] 2)过表达转染

[0136] i)使用12孔板进行转染，转染前用不含双抗的培养基铺板细胞，每孔铺1x105细胞，至融合度70％‑90％进行转染。

[0137] ii)转染

[0138] a)将10ng RNA溶于100μl无血清无双抗培养基中。

[0139] b)将2μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)溶于100μl无血清无双抗培养基中，混匀室温放置5min。

[0140] c)将A、B两管混合放置20min。

[0141] d)每孔加入200μl混合物

[0142] iii)转染24hr之后用qPCR测定相对表达量，结果如图4～5，KCNMA1‑AS2‑201过表达成功。

[0143] 试验例5

[0144] 本试验例使用MTT法测定过表达lncRNA KCNMA1‑AS2‑201对结直肠癌细胞增殖的影响，具体包括以下步骤：

[0145] i)使用96孔板，转染前用不含双抗的培养基铺板细胞，每孔铺5000‑10000个细胞，第二天待细胞贴壁后进行转染。

[0146] ii)转染

[0147] a)将1.25ng、2.5ng RNA分别溶于25μl无血清无双抗培养基中

[0148] b)将0.25μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)溶于25μl无血清无双抗培养基中，混匀室温放置5min。

[0149] c)将A、B两管混合放置20min。

[0150] d)每孔加入50μl混合物

[0151] iii)转染0hr、24hr、48hr、72hr之后，弃去培养基，加入100μl培养基和10μl 5mg/ml MTT溶液混合物，37℃孵育4hr。

[0152] iv)弃去培养基与MTT混合物，加入100μl DMSO，孵育10min。

[0153] v)酶联免疫检测仪OD540nm测定吸光度值，结果如图6～7，结果表明过表达lncRNA KCNMA1‑AS2‑201可以降低细胞增殖。