异戊烯基取代的苯酚类化合物抗金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的应用

摘要

本发明涉及医药微生物化学技术领域，具体公开了从一株毛韧革菌（Stereum hirsutum）的发酵产物中分离获得的一类、四种异戊烯基取代的苯酚类化合物用于制备抗菌药物的医药用途，具体是在制备用于抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的药物中的应用。本发明的抗细菌活性试验证实本发明的异戊烯基取代的苯酚类化合物及其衍生物能够显著抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin‑resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的生长，具有作为制备新的农用或医用抗菌和耐药细菌药物的用途。

权利要求

1.式I或式II所示的异戊烯基取代的苯酚类化合物在制备用于抑制金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的药物中的应用：

说明书

异戊烯基取代的苯酚类化合物抗金黄色葡萄球菌和耐甲氧西

林金黄色葡萄球菌的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药和微生物化学领域，特别涉及一类来源于一株毛韧革菌(Stereum hirsutum)的异戊烯基化苯酚类化合物在制备用于抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的药物中的应用。

背景技术

[0002] 微生物在地球上存在已经超过38亿年并且表现出极大的遗传性及代谢多样性的特点。为了幸存下来，它们通过不断的进化来适应不同的环境和竞争的挑战。人类也一直利用抗生素、防腐剂以及其他抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌剂来预防和控制免受感染疾病。当前，细菌、病毒、寄生虫以及其他感染疾病的耐药性是摆在世界人民面前的巨大问题。因此，开发独特的化学结构、新的作用机制的抗菌药物是各个科研机构及药物化学工作者的重要任务。日常生活中使用的抗菌药物通常是指具有杀菌或抑制病原微生物活性的药物，包括各种不同种类的抗生素，喹诺酮类等化学合成药物以及磺胺类药物，是微生物的次级代谢产物或合成类似物。对宿主毒副作用不大，但能够杀灭或抑制病原生物。从微生物中寻找具有抗菌的活性物质并进行相关的结构修饰，研制特异性强、毒副作用小的新型抗菌药物具有重要的社会效益和经济效益。

[0003] 随着临床上抗菌药物的大量使用甚至滥用，细菌耐药问题越来越棘手，面对很多感染性疾病我们束手无策，预计截止到2050年，抗生素耐药每年会引发1000万人死亡，且造成全球GDP l00万亿的严重损失。耐药菌(金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、绿脓杆菌以及肠菌)在世界范围内引起主要的问题。在这些菌群中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)引起大约一半抗生素耐药的死亡率。仅2013年，疾病与预防控制中心(CDC)报道美国超过11000人死于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染相关疾病。与细菌耐药性相比，新一代抗菌药物的研发速度却大大的落后。1998-2002年仅6种药物获得上市批准，而后的4年更是减至3种。

[0004] MRSA感染的治疗是临床十分棘手的难题之一，关键是其对许多抗生素有多重耐药，万古霉素是目前临床上治疗MRSA唯一疗效肯定的抗生素，应用已超过30年。一旦MRSA突破抗生素的封锁线，将面临无药可治。因此，探寻新的抗菌作用靶点及有效抑制剂是药物化学需要重点关注的一个方向，对于新型抗菌药物的研发需要长期不断的进行研究。

[0005] 微生物来源的抗生素，一直是临床一线药物。高等真菌也是微生物的重要组成部分，是活性天然产物的来源。初步估计，地球上高等真菌共计15万种，目前被描述的还不及10％，而进行过化学成分探究的种类占比微乎其微。韧革菌属(Stereum)是高等真菌中一个重要的类群，也是药用高等真菌的主要来源之一。该属真菌常与金耳、银耳、黑木耳有伴生或者部分共生关系，是金耳、银耳和黑木耳栽培过程中常见“杂菌”。但现有技术中对其进行的药物开发研究工作非常有限。

发明内容

[0006] 针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供四种异戊烯基取代的苯酚类化合物在制备用于抑制金黄色葡萄球菌和/或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的药物中的应用。

[0007] 所述四种异戊烯基取代的苯酚类化合物为式I、式II、式Ⅲ和式Ⅳ所示的化合物：

[0008]

[0009] 所述四种化合物或其可药用盐在如下(A1)-(A2)任一中的应用也属于本发明的保护范围：

[0010] (A1)作为金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长抑制剂；

[0011] (A2)制备金黄色葡萄球菌和治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的药物。

[0012] 本发明的再一个目的是提供一种治疗金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的药物，其有效成分为式I、式II、式Ⅲ或式Ⅳ化合物，或这些化合物的可药用盐，至少含有一种药学上可接受的载体。

[0013] 以上所述药物均可为片剂、粉剂、胶囊、口服液、乳剂、膏剂、霜剂、注射剂、混悬剂、酊剂、颗粒剂或气雾剂。上述各剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

[0014] 在本发明中，以上所有的所述的治疗金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染具体体现在：抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。

[0015] 实验证明，式I、式II、式Ⅲ和式Ⅳ化合物在抗金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性检测中显示出明显的抑制作用，具有作为制备新型医用抗细菌药物的潜在用途。

[0016] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

[0017] 1、目前临床使用的抗金黄色葡萄球菌主要是环肽类、大环内酯类和青霉素类。本发明所涉及结构与目前临床使用的抗金黄色葡萄球菌制剂的骨架类型完全不同，它们是是一种异戊烯基取代的苯酚类化合物。基于此类化合物进一步开发成的专属性抗金黄色葡萄球菌药物可完全避开现有上市药物专利，为市场提供更多选择。

[0018] 2、本发明是首次揭示异戊烯基取代的苯酚类化合物还具有抗金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性，将来可使科学界将目光投入到从毛韧革菌中寻找具有抑制金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的先导化合物。

[0019] 3、本发明拟保护其用途的四个化合物，均可通过微生物发酵手段来获取。全部生产过程无化学污染，绿色环保。

附图说明

[0020] 图1为具体实施方式中制备的式Ⅰ化合物的氢谱图(600MHz,CDCl3)；

[0021] 图2为具体实施方式中制备的式Ⅰ化合物的碳谱图(150MHz,CDCl3)；

[0022] 图3为实施例1中试验的式Ⅰ-Ⅳ化合物的抗SA和MRSA的MIC50直观比较图。

具体实施方式

[0023] 为使本申请的发明目的、发明内容呈现得更加清楚，下面申请人将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。

[0024] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0025] 下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0026] 毛韧革菌(Stereum hirsutum)：中南民族大学药用真菌与民族药研究组，保藏编号HP01，一般与食用菌茶银耳形成共生关系，也是文献“Depsideα-Glucosidase Inhibitors from a Culture ofthe Mushroom Stereum hirsutum”(Planta Medica,2014年80期)中报道的菌株。公众可从该研究组购买获得。

[0027] 权利要求书和说明书发明内容中所述四种化合物的获得方式分别如下：

[0028] 式Ⅰ化合物的分离纯化过程，土豆葡萄糖液体培养基共70L，土豆葡萄糖液体培养基PD(Potato Dextrose)组成：每升蒸馏水中溶有葡萄糖(20g)、土豆(200g)、KH2PO4(3g)、MgSO4(1.5g)维生素B1(0.05mg)；培养条件：摇床培养，在恒温24℃，转速150rpm条件下暗培养发酵30天；然后借助布氏漏斗将70L毛韧革菌液体过滤分成发酵液和固态菌丝体，再利用旋转蒸发仪及真空泵和低温冷却循环泵(下同，减压浓缩装置)将滤液减压蒸馏至5升浓缩液(不含乙醇仅含水)，该浓缩液和乙酸乙酯按照体积比1：1，在20升的分液漏斗摇晃萃取然后静置，分取上层乙酸乙酯层，下层水液继续和乙酸乙酯按照体积比1：1萃取，如此萃取三次得总乙酸乙酯层；上述过滤得菌丝体放入锥形瓶中，加入95％乙醇(v/v，乙醇/水＝95：5)浸没，放入50升的超声波提取仪中，超声提取1小时，布氏漏斗过滤得乙醇提取液，菌丝体继续加入乙醇，超声，如此共提取三次，布氏漏斗过滤得三次菌丝体提取得乙醇溶液，该乙醇溶液减压浓缩至不含乙醇的水浓缩液2升，该浓缩液和乙酸乙酯按照体积比1：1，在10升的分液漏斗中，摇晃分液漏斗然后静置，分取上层乙酸乙酯层，下层水液继续和乙酸乙酯按照体积比1：1萃取，如此萃取三次得总乙酸乙酯层；合并发酵液和菌丝体的乙酸乙酯萃取液，并减压浓缩除去乙酸乙酯得粗浸膏36g；粗浸膏加适量甲醇作为溶剂溶解转移至蒸发皿，加入54g反相硅胶(型号Rp-18)吸附样品，在水浴锅上(恒温60℃)烘干，研磨成粉状，接着将吸附着样品的反相硅胶装入样品柱(200mL的塑料管)中，经中压液相色谱(型号德国Büchi)，洗脱剂为甲醇/水(v/v,20：80、40：60、60：40，80：20，100：0，每个梯度各冲5000mL)，每500mL接一瓶，减压浓缩转移至2mL的小瓶中，然后将所有小瓶的样品用毛细管在硅胶板G254(青岛海洋化工有限公司)上点板，在200mL的展开缸中展开，展开剂为石油醚/丙酮(v/v)＝3:2，溶剂到顶后取出晾干，在紫外灯下(254nm)观察化合物的荧光后，使用香草醛-浓硫酸-乙醇液均匀喷洒硅胶板后，在电炉上加热显色，将相同或类似的组分合并，最后合并成15个组分(A-O)；组分B(2.5g)经正相硅胶柱，梯度洗脱剂为石油醚/丙酮(v/v,5：1、3：2、2：1，1：1，每个梯度各冲500mL)，进一步划分为7个小组分B1-B7，接着组分B4过甲醇凝胶柱(型号LH-20)分成5个组分B4a-B4e。最后，组分B4d转入1mL的液相小瓶，由半制备高效液相(型号美国安捷伦1260)分离纯化得该化合物，条件：Zorbax SB-C18柱子(粒径5μm,规格9.4mm×150mm,流速为8mL·min-1)，流动相乙腈和水(v/v,80:20-100:0，25min)，检测器是DAD，在10.5分钟接峰，即为式Ⅰ化合物。

[0029] 式Ⅰ化合物的结构鉴定：制备所得的式Ⅰ化合物的溶液减压浓缩蒸干，加0.5mL的氘代氯仿溶解，用200μL移液枪转移至核磁管中，在核磁共振仪(德国布鲁克Avance III 600MHz)上检测氢谱和碳谱(如图1和2)

[0030] 式Ⅱ化合物参考文献“The Chemical Constituents ofthe Fungus Stereum sp.,发表杂志为Chemistry&Biodviersity，2006年3期215页Experimental Part部分”自制；

[0031] 式Ⅲ和式Ⅳ化合物参考文献“Depsideα-Glucosidase Inhibitors from a Culture ofthe Mushroom Stereum hirsutum,发表杂志Planta Medica,2014年80期922页Extraction and isolation部分”自制。

[0032] 实施例1：采用国家临床试验中心推荐的麦氏比浊法对式Ⅰ-Ⅳ化合物进行抗金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性检测

[0033] (1)液体和固体培养基的配置

[0034] 营养肉汤培养基配制方法：称取营养肉汤干粉(Scientific Research Special公司，下同)18g溶解在1000mL的蒸馏水中，分装于锥形瓶中，121℃，0.15MPa高温高压下灭菌15min，备用。

[0035] 营养琼脂培养基配制方法：称取琼脂干粉15g(广东环凯微生物科技有限公司)和营养肉汤干粉18g溶解在1000mL蒸馏水中，加热溶解后，分装于锥形瓶中，121℃，0.15MPa高温高压下灭菌15min后，立刻将灭菌营养琼脂培养基分装于无菌平皿中，备用。

[0036] (2)菌悬液的制备

[0037] 金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus subsp.aureus ATCC29213(简称SA)，及耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC43300(简称MRSA)均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)。将金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行菌株分别扩大培养，平板划线法接种在步骤(1)所得琼脂平皿中，37℃培养18h，用接种环取出单个菌落2个，100mL灭菌肉汤中接种，120r/min、37℃恒温摇床培养至对数生长期，酶标仪测定对数生长期细菌的吸光度值，用新鲜灭菌的肉汤将菌液稀释至吸光度值为0.1(条件为酶标仪测定625nm下的OD值)，使用吸光度值为0.1菌液，与步骤(1)所得的新鲜灭菌营养肉汤培养基按一定比例进行稀释，稀释菌液至浓度约为1×108CFU/mL(按照麦氏比浊法计算接种量)。

[0038] (3)生长曲线的测定

[0039] 将对数生长期的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分别接种在无菌营养肉汤中，恒温隔水式培养箱37℃，120rpm/min计时培养，分别在1、2、3、4、5......40h测得细菌每小时的吸光度(酶标仪测定625nm的OD值)。

[0040] (4)抗金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性化合物初筛

[0041] 取96孔培养板，取待测样品用二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)溶解并稀释至浓度为256μg/mL；各孔加入等体积的金黄色葡萄球和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌液，菌液终浓度为5×105CFU/mL(按照麦氏比浊法计算接种量)；化合物终浓度为128μg/mL，37℃培养
24h，在625nm处酶标仪测定其吸光值。实验同时设置培养基空白对照、细菌对照(阴性对照)以及10μg/mL的青霉素G钠或10μg/mL的万古霉素(均购自Biosharp公司)阳性药对照。每份样品均平行操作3次，结果取平均值。所有的操作均在无菌条件下进行，其中在128μg/mL的浓度下，式Ⅰ-Ⅳ化合物的抑菌率均在70％以上(表1)。

[0042] 按以下公式计算其抑菌率(％)：

[0043] 抑菌率(％)＝(1–样品OD值/细菌对照OD值)×100％

[0044] (5)式Ⅰ-Ⅳ化合物抗金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性体外评估[0045] 首先将金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分别接种到灭菌肉汤培养基中，培养18h。取96孔板，各孔加入等量的测试菌液悬液，终浓度为5×105CFU/mL(按照麦氏比浊法计算接种量)，最后加入不同浓度的样品母液(各化合物样品均采用二甲基亚砜DMSO溶解)，配置成8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL的溶液。同时设溶剂对照(1％DMSO)、细菌对照(阴性对照)和阳性对照(万古霉素或青霉素G钠)，同时设置对照培养板(不加菌液，空白对照)，试验平行3次。将96孔板置37℃恒温培养24h，在625nm处酶标仪测定其吸光OD值(所有操作均在无菌条件下进行)，按Reed&Muench法，计算MIC50值，结果见表1。

[0046] 实验结果

[0047] 表1.式Ⅰ-Ⅳ化合物(128μg/mL)对SA和MRSA的抑菌率简称和各自MIC50

[0048]