一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用

摘要

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种针对人白介素‑2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用。本发明用单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人白介素‑2兔单克隆抗体A和B，并证明了这两个抗体可以识别人白介素‑2蛋白表面的不同抗原决定簇，可以用于开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒；利用该抗体开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等优点，检测灵敏度为1pg/ml(1ng/L)。该方法学的建立，提供了一种能够在血清、细胞培养基样品中稳定检测极微量水平人白介素‑2蛋白的试剂盒，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。

权利要求

1.一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于：所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体A或兔单克隆抗体B；

所述兔单克隆抗体A轻链上互补决定区CDR1、CDR2及CDR3的序列分别为SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述兔单克隆抗体A重链上互补决定区CDR1，CDR2及CDR3的序列分别为SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；

所述兔单克隆抗体B轻链上互补决定区CDR1、CDR2及CDR3的序列分别为SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述兔单克隆抗体B重链上互补决定区CDR1，CDR2及CDR3的序列分别为SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于：所述兔单克隆抗体A轻链可变区序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述兔单克隆抗体B轻链可变区序列为SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于：所述兔单克隆抗体A重链可变区序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述兔单克隆抗体B重链可变区序列为SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于：所述兔单克隆抗体A轻链序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述兔单克隆抗体A重链氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

所述兔单克隆抗体B轻链序列为SEQ ID NO:11所示氨基酸；所述兔单克隆抗体B重链序列为SEQ ID NO:12所示氨基酸。

5.如权利要求1-4任一所述的针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体在建立非诊断目的的高灵敏度的人白介素-2的酶联免疫检测方法中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述酶联免疫检测方法为双抗夹心法酶联免疫检测方法。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述双抗夹心法酶联免疫检测方法中，捕获抗体为兔单克隆抗体A，检测抗体为经生物素标记的兔单克隆抗体B。

8.如权利要求1-4任一所述的针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体在制备用于检测人白介素-2的试剂或试剂盒中的应用，所述人白介素-2包括重组表达的人IL-2蛋白，或细胞分泌的人IL-2蛋白，或人血清中的IL-2蛋白。

说明书

一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] 人白介素-2蛋白(IL-2，以下简称“IL-2”)，又名T细胞生长因子(T cell growth factor,TCRF)，由133个氨基酸组成，分子量大小为15.4KDa。IL-2由含153个氨基酸的前体蛋白合成。与成熟的IL-2相比，前体蛋白在N端(即氨基末端)用于20个氨基酸的疏水分泌信号肽序列；分泌到胞外后，该信号肽会被切除，产生成熟的IL-2蛋白。IL-2蛋白在58和105为半胱氨酸之间拥有一对二硫键，对于IL-2的生物活性至关重要。

[0003] 在人体内，IL-2蛋白主要由T淋巴细胞在受到抗原物质或者是丝裂原刺激后合成并分泌；此外，B淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)及单核-巨噬细胞也能够产生IL-2。这些免疫细胞除了能产生IL-2蛋白之外，还能对IL-2蛋白产生一定的生物学反应，比如T淋巴细胞在体外的生长需要一定量的IL-2蛋白持续刺激、T淋巴细胞和巨噬细胞在受到IL-2的刺激作用下能够诱导并增强其细胞毒作用等。

[0004] 由于IL-2能诱导和增强细胞毒活性，因此IL-2在某些疾病、特别是肿瘤治疗的研究上得到了广泛的应用。例如，单独使用IL-2或与LAK细胞等联合使用在肿瘤治疗方面取得了一定的疗效。IL-2还被应用于病毒感染、免疫缺陷病及自身免疫病的治疗。但IL-2在治疗过程中，还会引起一些不良反应，如发热、呕吐、毛细血管渗漏综合征以及水盐代谢紊乱和肾、肝、心、肺功能异常等，因此，在应用IL-2进行临床治疗的过程中，检测患者血清中IL-2水平的变化具有非常重要的临床意义。

[0005] 另外，IL-2产生或表达异常与临床疾病有密切关系，通过测定人外周血、尿液或人激活淋巴细胞培养上清液中的IL-2水平，可作为对肿瘤、心血管病、肝病、红斑狼疮、麻风病、艾滋病等疾病诊断、预后及观察的方法，并且还能够用于对器官移植后有无排斥反应的早期诊断。在正常人的血清中，IL-2蛋白水平的参考范围为3.5～6.5ng/L(ELISA方法)，属于一个比较低的水平，因此开发一种高灵敏度的IL-2蛋白检测方法学，具有非常重要的意义。

发明内容

[0006] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

[0007] 本发明是这样实现的，一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体，其特征在于：所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体A或兔单克隆抗体B；

[0008] 所述兔单克隆抗体A轻链上互补决定区CDR1、CDR2及CDR3的序列分别为SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；

[0009] 所述兔单克隆抗体B轻链上互补决定区CDR1、CDR2及CDR3的序列分别为SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。

[0010] 进一步地，所述兔单克隆抗体A重链上互补决定区CDR1，CDR2及CDR3的序列分别为SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；

[0011] 所述兔单克隆抗体B重链上互补决定区CDR1，CDR2及CDR3的序列分别为SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

[0012] 进一步地，所述兔单克隆抗体A轻链可变区序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

[0013] 所述兔单克隆抗体B轻链可变区序列为SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；

[0014] 进一步地，所述兔单克隆抗体A重链可变区序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

[0015] 所述兔单克隆抗体B重链可变区序列为SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；

[0016] 进一步地，所述兔单克隆抗体A轻链序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述兔单克隆抗体A重链氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

[0017] 所述兔单克隆抗体B轻链序列为SEQ ID NO:11所示氨基酸；所述兔单克隆抗体B重链序列为SEQ ID NO:12所示氨基酸。

[0018] 进一步地，所述兔单克隆抗体A和B，轻链恒定区为κ链，重链恒定区为IgG1型。

[0019] 进一步地，所述兔单克隆抗体A及兔单克隆抗体B结合于人IL-2表面的不同抗原决定簇。

[0020] 如上述的针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体在建立高灵敏度的人白介素-2的酶联免疫检测方法中的应用。

[0021] 进一步地，所述酶联免疫检测方法为双抗夹心法酶联免疫检测方法。

[0022] 进一步地，所述双抗夹心法酶联免疫检测方法中，捕获抗体为兔单克隆抗体A，检测抗体为经生物素标记的兔单克隆抗体B。

[0023] 如上述的针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体在制备用于检测人白介素-2的试剂或试剂盒中的应用，所述人白介素-2包括重组表达的人IL-2蛋白，或细胞分泌的人IL-2蛋白，或人血清中的IL-2蛋白。

[0024] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：

[0025] 本发明用来制备人IL-2兔单克隆抗体的免疫原是利用大肠杆菌在体外重组表达的、经验证具有生物活性的人IL-2全长蛋白；制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术。

[0026] 本发明用单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人白介素-2兔单克-10隆抗体A和B，抗体A和重组表达人IL-2结合的亲和常数为8.99X 10 M，抗体B和重组表达人IL-2结合的亲和常数为2.93X 10-10M。并证明了这两个抗体可以识别人白介素-2蛋白表面的不同抗原决定簇，可以用于开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒；利用该抗体开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等优点，检测灵敏度为1pg/ml(1ng/L)。该方法学的建立，提供了一种能够在血清、细胞培养基样品中稳定检测极微量水平人白介素-2蛋白的试剂盒，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。

附图说明

[0027] 图1是构建含兔单克隆抗体重链不变区(图1a)和轻链不变区(图1b)哺乳动物细胞(如CHO、HEK293等)的母本质粒示意图；

[0028] 图2是人IL-2兔单克隆抗体A和B的亲和力测定；

[0029] 图3是基于人IL-2兔单克隆抗体A和B建立的酶联免疫检测方法的标准曲线；

[0030] 图4是基于人IL-2兔单克隆抗体A和B建立的酶联免疫检测方法对细胞分泌的人IL-2水平的检测；

[0031] 图5是基于人IL-2兔单克隆抗体A和B建立的酶联免疫检测方法的血清峰值恢复实验；

[0032] 图6是基于人IL-2兔单克隆抗体A和B建立的酶联免疫检测方法的特异性实验(抗干扰实验)；

[0033] 图7是人IL-2兔单克隆抗体A和B的热稳定性测定。

具体实施方式

[0034] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0035] 本发明中涉及的蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

[0036] 本发明披露了一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用，具体如下各实施例所示。

[0037] 实施例1人IL-2兔单克隆抗体的制备

[0038] 1、动物免疫：为了获得识别人IL-2蛋白的兔单克隆抗体，该发明以上海近岸生物技术有限公司生产的重组人IL-2蛋白为免疫原，免疫新西兰大白兔。每只大白兔免疫200ug，首次免疫将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，间隔3周取100ug免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次，三次免疫后用ELISA方法测定血清效价，取血清效价高的兔子，用
200ug免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。

[0039] 2、利用本领域公用标准流程分离脾脏细胞。

[0040] 3、B淋巴细胞分选：方法参见申请人的在前中国发明专利，申请号为CN201910125091.4，名称为《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》。

[0041] 4、编码兔单克隆抗体基因的克隆

[0042] 培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后，采用常规方法提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法，天然配对的兔单克隆抗体轻重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列。

[0043] 5、单克隆抗体的生产和纯化

[0044] 为了获得多株识别人IL-2蛋白的兔单克隆抗体，该发明将所获得的兔单克隆抗体重链、轻链基因进行克隆后表达，具体步骤如下：

[0045] 1)所使用的哺乳动物表达载体见图1。其中，pRB322Ori和f1Ori是在E.Coli中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV Promotor为在真核生物中的启动子，SV40_PA_terminator是加尾信号，Heavy chain constant(图1a)和Light chain constant(图1b)分别为兔重链不变区和轻链不变区序列。

[0046] 2)将含含兔单克隆抗体重链不变区(图1a)和轻链不变区(图1b)哺乳动物细胞表达母本质粒分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理；

[0047] 3)利用尾部带有和载体一致同源序列的PCR引物，重链基因引物序列为：5’-tgaattcgagctcggtacccATGGAGACTGGGCTGCGCTG-3’和5’-gtagcctttgaccaggcagcCGCCTGAGTTCCACGACACC-3’；轻链基因基扩增引物为：5’-tgaattcgagctcggtaccc ATGGACACGAGGGCCCCCAC-3’和5‘-acacacacgatggtgactgGTTTCTCGTAGTCTGCTTTGC-3’，对所获得的兔单克隆抗体轻重链可变区基因(VH和VL)进行扩增；PCR反应体系为：95℃3min,然后按下列条件进行25个循环反应，95℃1min，56℃1min，68℃0.5min；最后95℃10min。

[0048] 4)对扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将重链和轻链可变区基因构建到相应的哺乳动物表达载体中去；

[0049] 5)经测序验证之后，将含有相应兔单克隆抗体轻、重链基因的表达质粒一起转染到293细胞中去；

[0050] 6)转染72-96小时后，离心除去细胞，对获得的培养上清用protein A亲和凝胶树脂进行纯化；

[0051] 7)纯化后即获得重组兔抗人IL-2单克隆抗体，经鉴定之后分装，并于-20℃低温保存备用。

[0052] 实施例2抗体筛选及鉴定

[0053] 获得多株人IL-2兔单克隆抗体后，首先对抗体进行初步鉴定和筛选，包括抗体亲和力的鉴定以及抗原识别表位的鉴定，具体如下：

[0054] 1)抗体亲和力的鉴定：对所获得的人IL-2兔单克隆抗体进行抗体亲和力的初步鉴定，使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得抗体的亲和力进行初步测定。其中使用到的材料为重组人IL-2蛋白，使用浓度为527nM，使用所获得抗体的浓度为333nM；通过比较各个抗体的亲和力，从中选择亲和力较好的抗体。

[0055] 2)抗原识别表位的鉴定：对本发明中所获得的人IL-2兔单克隆抗体与人IL-2蛋白抗原识别表位进行鉴定。使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得抗体进行配对反应来测试其识别的抗原表位决定簇；其中使用到的材料为重组人IL-2蛋白，使用浓度为527nM，使用所获得抗体的浓度为333nM；通过分析两种抗体之间的配对数据，从中选择识别不同抗原表位决定簇的两个抗体。

[0056] 根据多株人IL-2兔单克隆抗体的亲和力及抗原识别表位的初步鉴定和筛选结果，获得两株本发明中所述的具有高亲和力的兔单克隆抗体A和B；并利用GE公司的Biacore 3000生物分子相互作用分析仪对所最终选定的抗体亲和力进行精确测定(见图2)；其中使用所选定抗体的浓度为333nM；并且通过条件摸索之后将重组人IL-2蛋白稀释5个不同浓度，分别为64，32，16，8，4nM；最终获得人IL-2兔单克隆抗体A的亲和力为8.99X 10-10M；人-10
IL-2兔单克隆抗体B的亲和力为2.93X 10 M。

[0057] 本实施例中所获得的兔单克隆抗体A轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:1；重链氨基酸序列为SEQ ID NO:2；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

[0058] 本实施例中所获得的兔单克隆抗体B的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:11；重链氨基酸序列为SEQ ID NO:12；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:14；轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。

[0059] 实施例3基于抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B建立双抗夹心法酶联免疫检测方法[0060] 双抗夹心法酶联免疫检测方法的具体步骤：(1)使用碳酸盐缓冲液(pH9.4,0.05M)将捕获抗体，抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A进行包被，4℃孵育过夜；洗涤液洗板；(2)用含有5％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH7.2,0.05M)进行封闭；(3)将标准样品(重组人IL-2蛋白)、待测样品，用含1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液稀释后，加入到酶标板中，常温条件孵育1小时，然后用洗涤液洗板；(3)将用含1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液稀释的经长链生物素(NHS-LC-biotin)标记的抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体B加入到板中，常温条件孵育1小时，然后用洗涤液洗板；(4)加入用含1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液稀释的亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)，常温条件孵育1小时，然后用洗涤液洗板；(5)加入TMB显色液，常温显色10分钟，加草酸终止显色，然后分别于450nm和630nm下测定吸光值，OD450减去OD630为校正后的吸光值。

[0061] 生物素标记处理方法：将抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体B配成1mg/ml的溶液；用DMSO将NHS-LC-biotin配成浓度为60mg/ml的溶液；取200ul 1mg/ml的抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体B溶液，加入10ul 60mg/ml的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30分钟后，加入50ug 500mM ph9.0的Tris溶液中止反应；最后加入大量pH7.4的1X PBS缓冲液，用排阻极限为
30KD的离心柱离心，用于除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡。

[0062] 双抗夹心法酶联免疫检测方法的条件摸索：通过正交试验方法，综合考虑背景及重组蛋白的光吸收值，选择抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A的包被浓度为5ug/ml，生物标记的抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体B的检测浓度为5ug/ml。

[0063] 双抗夹心法酶联免疫检测方法的灵敏度：加入的样品为重组人IL-2蛋白，样品用含1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液稀释，浓度分别为500pg/ml,250pg/ml,125pg/ml,62.5pg/ml,31.25pg/ml,15.625pg/ml,7.813pg/ml,3.906pg/ml,1.953pg/ml,0.977pg/ml,0.488pg/ml,0.244pg/ml,0.122pg/ml,0.061pg/ml,0pg/ml，加样量为25ul/孔。以人IL-2蛋白浓度的对数值(Log10)为横坐标，吸光值的校正值(OD450-OD630)为纵坐标作图(见图3)。以吸光值平均值大于三倍空白对照吸光值平均值的最低人IL-2蛋白浓度为双抗夹心法酶联免疫检测方法的灵敏度。实验结果显示所建立的基于抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B建立双抗夹心法酶联免疫检测方法的检测灵敏度达到1pg/ml。

[0064] 实施例4抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B性能检测

[0065] 1、人外周血淋巴细胞(PBMC)分泌人IL-2蛋白检测试验

[0066] 文献表明在经相关刺激因子(PMA和PHA)刺激之后，人外周血淋巴细胞(PBMC)能够分泌人IL-2蛋白，因此对于PBMC培养上清中分泌人IL-2蛋白的测定，可以证明本专利中的抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体可以识别天然状态的IL-2蛋白。

[0067] 按照文献报道，在6孔细胞培养板中，每个孔中种入400X 106个PBMC，培养24小时后，在上清中加入25ng/ml PMA和1ug/ml PHA；对照孔为不加PMA和PHA刺激。继续培养24小时后收集上清，用实施例3中所建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法，来检测细胞培养上清中的人IL-2蛋白水平。

[0068] 结果如图4所示，结果显示，基于抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B建立双抗夹心法酶联免疫检测方法可以识别PBMC经刺激之后，分泌的内源性人IL-2蛋白。

[0069] 2、血清峰值恢复实验

[0070] 该实验是用于检测分析方法或免疫测定法准确性，有助于解决分析物的损失百分比，并可以检测干扰物质对测定的影响。

[0071] 在本实施例中，将已知量的标准品人IL-2蛋白加入到从不同人身上获得的血清中，并通过实施例3中基于抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B的双抗夹心法酶联免疫检测方法来测定其浓度，并通过实际检测浓度和理论计算浓度的差异，来计算人IL-2蛋白的血清回收率。

[0072] 结果如图5所示，根据图5中的结果计算所得，基于抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B的双抗夹心法酶联免疫检测方法，对人IL-2蛋白在血清中的回收率为90-120％(平均回收率为106％)，证明该检测方法检测准确性高、抗干扰能力强。

[0073] 3、对抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B特异性的检测

[0074] 本实施例中，用五种与人IL-2蛋白相近的白介素蛋白(人IL-1beta、人IL-4、人IL-9、人IL15和人IL-25蛋白)对抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B特异性的检测，采用的方法为双抗夹心法酶联免疫检测方法，所有标准品蛋白的浓度均为10ng/ml。

[0075] 结果如图6所示，结果显示，基于抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B的双抗夹心法酶联免疫检测方法对于其他白介素蛋白均无任何交叉反应，证明抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B对于人IL-2蛋白具有高度的特异性。

[0076] 4、对抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B热稳定性的测试

[0077] 本实施例中，抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B被放置于37℃保温箱中，并于第3、5、7和14天分别取样，然后通过双抗夹心法酶联免疫检测方法对人IL-2标准品蛋白进行检测；比较经37℃处理不同时间的抗体样品和未经37℃处理的抗体样品，建立标准曲线，对抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B的热稳定性进行检测。

[0078] 结果如图7所示，结果显示，本发明中的两株兔抗IL-2单克隆抗体在37℃下处理14天后，对检测灵敏度和线性范围的影响小于1％，证明抗人IL-2蛋白兔单克隆抗体A和B热稳定性强。

[0079] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。