特异性识别牛妊娠相关糖蛋白4的核酸适配体及其应用转让专利
申请号 : CN202010143889.4
文献号 : CN111500583B
文献日 : 2021-09-10
发明人 : 刘长彬 , 卢春霞
申请人 : 新疆农垦科学院
摘要 :
本发明提供了一种特异性结合牛妊娠相关糖蛋白4的核酸适配体，所述核酸适配体序列包含SEQ ID No.1序列中任一种。本发明的核酸适配体还可以是各种同源性较高的类似序列或由本发明序列得到的衍生物。本发明还提供核酸适配体的应用。本发明的核酸适配体是通过磁珠‑SELEX技术筛选得到，不仅能结合bPAG4靶标蛋白，还有选择性结合bPAG同类蛋白，而与其他蛋白不发生特异性结合，可用于从复杂体系中捕获bPAG蛋白，适用于bPAG蛋白的检测、分离纯化及牛早孕快速诊断。
权利要求 :
1.一种特异性识别牛妊娠相关糖蛋白4的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列由SEQ IDNo .1所示的DNA序列构成，其中，SEQ IDNo .1所示的DNA序列为
5’‑TTGAAGTGACTCCGCACTGGGTGGGTGGGAGGGTCGTGCGGCTGGTCATAGCAGGT‑3’。
2.根据权利要求1所述特异性识别牛妊娠相关糖蛋白4的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰为磷酸化、氨基化、羧基化、巯基化或同位素化。
3.根据权利要求1所述特异性识别牛妊娠相关糖蛋白4的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、生物素、链霉亲和素、地高辛或纳米发光材料。
4.一种如权利要求1所述核酸适配体在制备检测和分离纯化牛妊娠相关糖蛋白的产品中的应用。
5.一种如权利要求1所述核酸适配体在制备牛早期妊娠诊断产品中的应用。
说明书 :
特异性识别牛妊娠相关糖蛋白4的核酸适配体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种特异性识别牛妊娠相关糖蛋白4（bPAG4）的核酸适配体，尤其涉及该核酸适配体在妊娠相关糖蛋白（bPAG）检测和家畜早期
妊娠诊断中的应用。
妊娠诊断中的应用。
背景技术
[0002] 牛妊娠相关糖蛋白 ( bovine pregnancy‑associated glycoproteins，bPAG) 属于天冬氨酸蛋白酶家族，与胃蛋白酶、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E有50%以上的相同氨基酸
序列。bPAG种类较多，至少包括22种bPAG蛋白，由胎盘滋养层细胞表达产生（Xie 等，1994；
Hughes 等，2000），在胚胎附植后进入母体血液，在整个妊娠期的表达和分泌呈现时空特异
性（Green 等，2000； Wooding 等，2005；Telugu 等；2009），常作为一种标志物用于家畜早
期妊娠诊断（Zoli 等 1992；Friedrich 等，2010；Reese 等，2018）。
序列。bPAG种类较多，至少包括22种bPAG蛋白，由胎盘滋养层细胞表达产生（Xie 等，1994；
Hughes 等，2000），在胚胎附植后进入母体血液，在整个妊娠期的表达和分泌呈现时空特异
性（Green 等，2000； Wooding 等，2005；Telugu 等；2009），常作为一种标志物用于家畜早
期妊娠诊断（Zoli 等 1992；Friedrich 等，2010；Reese 等，2018）。
[0003] 目前，基于免疫分析方法对血液或奶样中PAG的检测，已成为国际上应用最广泛的早期妊娠检测方法（Dufour 等，2017；Kaya 等，2016；Commun 等，2016）。可对授精后28d的
家畜进行早期妊娠诊断，诊断准确率达到90%以上（年Ricci 等，2015；张春刚等人，2015；
Karen 等，2015）。目前商品化的PAG检测试剂盒已应用于生产，如美国爱德士（IDEXX）公司
开发的基于酶联免疫反应原理的牛快速可视检测试剂盒，可检测牛血清或EDTA血浆中的
PAG，但国内市场上销售的快速检测试剂盒价格颇高，限制了在国内大规模推广使用。因此，
鉴于目前免疫分析方法中抗体制备周期长，成本高等问题，急需发展一种新型的识别分子，
以克服抗体在制备和使用中的不足，将对家畜早孕检测技术产生重大的意义。
家畜进行早期妊娠诊断，诊断准确率达到90%以上（年Ricci 等，2015；张春刚等人，2015；
Karen 等，2015）。目前商品化的PAG检测试剂盒已应用于生产，如美国爱德士（IDEXX）公司
开发的基于酶联免疫反应原理的牛快速可视检测试剂盒，可检测牛血清或EDTA血浆中的
PAG，但国内市场上销售的快速检测试剂盒价格颇高，限制了在国内大规模推广使用。因此，
鉴于目前免疫分析方法中抗体制备周期长，成本高等问题，急需发展一种新型的识别分子，
以克服抗体在制备和使用中的不足，将对家畜早孕检测技术产生重大的意义。
[0004] 近些年，核酸适配体（Aptamer）作为新型识别分子逐渐成为研究热点，其本质是一段单链寡核苷酸折叠成发夹、茎环、假结体及G‑四链体等二级或三级结构，通过氢键、范德
华力等与靶分子相互作用而形成稳定的复合物，其空间结构的多样性几乎可以与所有种类
的靶分子（细胞因子、蛋白、生物毒素、金属离子、小分子物质、细胞、微生物等）发生结合。与
传统的抗体相比，具有适应范围广；高亲和力和高特异性，不受免疫条件和免疫原性限制；
制备简单，可体外人工合成；变性与复性可逆，稳定性高；易于改造、标记和保存等优点。因
此，核酸适配体作为一种理想的分子探针在分析检测、疾病诊断及治疗等领域得到广泛应
用。
华力等与靶分子相互作用而形成稳定的复合物，其空间结构的多样性几乎可以与所有种类
的靶分子（细胞因子、蛋白、生物毒素、金属离子、小分子物质、细胞、微生物等）发生结合。与
传统的抗体相比，具有适应范围广；高亲和力和高特异性，不受免疫条件和免疫原性限制；
制备简单，可体外人工合成；变性与复性可逆，稳定性高；易于改造、标记和保存等优点。因
此，核酸适配体作为一种理想的分子探针在分析检测、疾病诊断及治疗等领域得到广泛应
用。
[0005] 目前，还未见到家畜妊娠相关糖蛋白核酸适配体的研究报道。
发明内容
[0006] 要解决的技术问题：针对现有技术的不足，本发明提出了一种特异性结合bPAG4蛋白的核酸适配体及其应用，本发明对bPAG4蛋白具有高的结合能力，并且能选择性识别bPAG
蛋白家族成员。
蛋白家族成员。
[0007] 技术方案：一种特异性识别牛妊娠相关糖蛋白4（bPAG4）的核酸适配体，所述核酸适配体序列包括SEQ IDNo .1所示的DNA序列构成，其中，SEQ IDNo .1所示的DNA序列为
[0008] 5’‑TTGAAGTGACTCCGCACTGGGTGGGTGGGAGGGTCGTGCGGCTGGTCATAGCAGGT‑3’。
[0009] 优选的，所述核酸适配体序列可被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、羧基化、巯基化或同位素化，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质。
[0010] 优选的，所述核酸适配体序列上可连接荧光标记物、放射性物质、生物素、链霉亲和素、地高辛、纳米发光材料或酶，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要
的性质。
的性质。
[0011] 一种特异性识别牛妊娠相关糖蛋白4（bPAG4）的核酸适配体，所述核酸适配体序列包括以下三种序列中的任意一种：
[0012] （1）与SEQ ID No .1所示DNA序列具有60％以上同源性，且能够特异性结合bPAG的DNA序列，优选地，同源性可以为70％以上，80％以上，90％以上，或者99％以上；
[0013] （2）在严格条件下与SEQ ID No .1所示DNA序列杂交的DNA序列；
[0014] （3）由SEQ ID No .1 所示DNA序列转录的RNA序列。
[0015] 一种特异性识别牛妊娠相关糖蛋白4（bPAG4）的核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物包括：
[0016] （1）将SEQ ID NO. 1所示核酸适配体序列任意一条缺失、增加或替换一个或多个碱基，得到与该核酸适配体相同功能的核酸适配体衍生物；
[0017] （2）将SEQ ID NO. 1所示核酸适配体序列任意一条的分子骨架进行修饰，得到与该核酸适配体相同功能的核酸适配体衍生物；
[0018] ( 3 )由SEQ ID NO. 1所示的核酸适配体编码的肽核酸，得到与所述核酸适配体相同功能的核酸适配体衍生物。
[0019] 上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备检测和分离纯化牛妊娠相关糖蛋白的应用。
[0020] 上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在牛早期妊娠诊断产品中的应用。
[0021] 有益效果：本发明具有以下有益效果：
[0022] （1）利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX)，以以磁珠为分离介质，bPAG4为靶蛋白，通过9轮筛选获得与靶标高亲和性、高特异结合的适配体，可特异性结合bPAG4蛋
白，亲和力极高，解离常数达到11.7nM，且可选择性识别bPAG蛋白家族成员，但对其他蛋白
几乎没有结合；
白，亲和力极高，解离常数达到11.7nM，且可选择性识别bPAG蛋白家族成员，但对其他蛋白
几乎没有结合；
[0023] （2）本发明筛选获得的核酸适配体具有良好的亲和力和特异性，可人工合成，成本低、生产周期短，易于化学修饰；
[0024] （3）可将本发明的适配体制备成分子探针、检测试剂等用于bPAG蛋白的检测、分离纯化及牛早孕诊断。
[0025] 附图说明：
[0026] 图1 为每轮筛选获得的ssDNA文库与bPAG4蛋白结合能力分析图；
[0027] 图2为每轮筛选获得的ssDNA文库的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0028] 图3为本发明筛选的核酸适配体与bPAG4蛋白亲和力检测数据图；
[0029] 图4为本发明筛选的核酸适配体的为二级结构图；
[0030] 图5为本发明的核酸适配体特异性实验结果。
具体实施方式
[0031] 以下结合具体实施例对发明进一步阐述，以便本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定而不用来限制本发明的范围。
[0032] 以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。
[0033] 实施例1：bPAG4核酸适配体的筛选
[0034] 1、合成随机单链DNA(ssDNA)文库和引物：
[0035] 随机单链DNA(ssDNA)文库：
[0036] 5’‑ CTACGGTGCCTTGAAGTGAC‑N36‑CATAGCAGGTCACTTCCAGG‑3’，其中，N36 代表36个随机核苷酸，该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
[0037] 上游引物： 5’‑FAM‑ CTACGGTGCCTTGAAGTGAC‑3’，
[0038] 下游引物： 5’‑ 20A‑spacer18‑CCTGGAAGTGACCTGCTATG‑3’，
[0039] 其中，下游引物中，20A表示由20个腺苷酸（A）组成的polyA尾，Spacer 18表示18原子的六乙二醇间臂，上述引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0040] 将随机单链DNA文库、5’端引物、3’端引物分别用DPBS缓冲液（NaCl：8 g/L，KCl：0.2 g/L，Na2HPO4：1.15 g/L，KH2PH4：0.2 g/L；PH 7 .4）溶解，于‑20℃保存备用。
[0041] 2、磁珠‑bPAG4蛋白（MB‑bPAG4）偶联
[0042] 取羧基化的磁珠50 μL，10mM PBS（ph7.4）洗涤，取0.1M NHS+0.4M EDC混合溶液（v/v，1:1）50 μL加入到磁珠中，震荡反应20 min；活化完毕，磁分离，PBS洗涤，加入NaAC（10
mM, pH5.0）和bPAG4蛋白（0.5 mg/mL），震荡反应60 min；偶联结束，磁分离，PBS洗涤后，加
入100 μL的乙醇胺（1.0M, pH8.5)，震荡反应20 min；磁分离，PBS洗涤，磁珠重悬于PBS中，4
℃保存备用。磁珠‑牛血清白蛋白（MB‑BSA）的偶联同以上方法。MB‑bPAG4作为正筛靶标，MB‑
BSA作为反筛靶标。
mM, pH5.0）和bPAG4蛋白（0.5 mg/mL），震荡反应60 min；偶联结束，磁分离，PBS洗涤后，加
入100 μL的乙醇胺（1.0M, pH8.5)，震荡反应20 min；磁分离，PBS洗涤，磁珠重悬于PBS中，4
℃保存备用。磁珠‑牛血清白蛋白（MB‑BSA）的偶联同以上方法。MB‑bPAG4作为正筛靶标，MB‑
BSA作为反筛靶标。
[0043] 3、筛选
[0044] 3.1 孵育与分离：用PBS溶解1OD随机单链DNA文库，使其浓度为5μM，PCR仪中95℃变性10分钟，冰水浴5 min，瞬离，室温备用。取变性好的200 μL文库加入到MB‑BSA磁珠中，
震荡孵育60 min。磁分离，上清加入到MB‑PAG4中，震荡孵育60 min，磁分离，弃上清，加入
PBS，沸水煮10 min，磁分离，收集上清。
震荡孵育60 min。磁分离，上清加入到MB‑PAG4中，震荡孵育60 min，磁分离，弃上清，加入
PBS，沸水煮10 min，磁分离，收集上清。
[0045] 3.2 PCR扩增：将步骤3.1中获得的文库加入到2 mL PCR mix中，混匀，分装成每管100 μL，进行PCR扩增。PCR扩增程序：95℃ 1 min、60℃ 1 min、72℃ 1 min，25个循环，72℃
5 min，25℃ 2 min。
5 min，25℃ 2 min。
[0046] 3.3 PCR产物浓缩：收集PCR产物，加如5倍体积的正丁醇，涡旋混匀，7500 rpm离心5 min，弃上相正丁醇，下层为扩增的dsDNA产物。
[0047] 3.4 制备FAM标记的单链DNA（长短链法）：将浓缩的PCR产物加入等体积的2×TBE/尿素变性缓冲液，PCR仪中 95℃变性10min，然后加入到8% 聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）的上样
孔中，300V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使带有PolyA的单链DNA与FAM标记的单链DNA
分开。取下PAGE胶，于紫外灯下，用干净的刀片切下带荧光的条带，装入0.5 mL碎胶离心管，
放入2 mL离心管中，14000 rpm离心1 min，弃碎胶离心管，加入PBS，沸水煮10 min，上清转
移至15 mL离心管中，依照步骤（3）浓缩单链DNA。然后装入3KD的透析袋，在PBS中4℃透析过
夜，经NanoDrop‑2000c超微量分光光度计测定核酸浓度后，作为下一轮筛选的起始文库。
孔中，300V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使带有PolyA的单链DNA与FAM标记的单链DNA
分开。取下PAGE胶，于紫外灯下，用干净的刀片切下带荧光的条带，装入0.5 mL碎胶离心管，
放入2 mL离心管中，14000 rpm离心1 min，弃碎胶离心管，加入PBS，沸水煮10 min，上清转
移至15 mL离心管中，依照步骤（3）浓缩单链DNA。然后装入3KD的透析袋，在PBS中4℃透析过
夜，经NanoDrop‑2000c超微量分光光度计测定核酸浓度后，作为下一轮筛选的起始文库。
[0048] 4、多轮筛选
[0049] 将上述步骤3.4中得到的ssDNA作为起始文库替代步骤3.1中的随机核酸文库，重复筛选9轮。筛选过程中用 Thermo Scientific™ Varioskan™ Flash多功能微孔板检测
仪检测每轮得到的ssDNA文库对靶标蛋白bPAG4的结合能力。
仪检测每轮得到的ssDNA文库对靶标蛋白bPAG4的结合能力。
[0050] 5、每轮ssDNA文库与靶蛋白的结合力测定
[0051] 按步骤2制备MB‑bPAG4，将每一轮获得的FAM标记的ssDNA文库用PBS缓冲液稀释至浓度为0.5μM，90 ℃变性10 min，冰水浴5min，然后分别与MB‑bPAG4孵育60min，磁分离，用
PBS缓冲液清洗2次，200μL PBS缓冲液重新悬浮磁珠，使用Thermo Scientific ™
Varioskan™ Flash多功能微孔板检测仪 (λEx=492nm, λEm=518nm)检测每轮ssDNA文库与
靶标的结合情况。结果如图1所示，当荧光值不再增加时，表示适配体已得到富集，停止筛
选。然后，将每轮ssDNA文库经8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳及Bio‑Rad凝胶成像仪检测，结果如
图2所示，在76 bp处有单一的1 9轮的目的ssDNA电泳条带。
~
PBS缓冲液清洗2次，200μL PBS缓冲液重新悬浮磁珠，使用Thermo Scientific ™
Varioskan™ Flash多功能微孔板检测仪 (λEx=492nm, λEm=518nm)检测每轮ssDNA文库与
靶标的结合情况。结果如图1所示，当荧光值不再增加时，表示适配体已得到富集，停止筛
选。然后，将每轮ssDNA文库经8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳及Bio‑Rad凝胶成像仪检测，结果如
图2所示，在76 bp处有单一的1 9轮的目的ssDNA电泳条带。
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[0052] 6、克隆与测序
[0053] 将第9 轮筛选得到的核酸适配体富集库用无修饰的引物扩增，PCR 产物经纯化后用pGEM‑T 载体(Takara Biotech.Co., Ltd) 克隆，并转化到E.Coli DH5α中。经“蓝‑白斑
筛选”，随机挑选30个阳性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司合成测序，对测序成
功的核酸适配体序列采用GLUSTALX 软件对其进行同源性分析，将其分为5个家族。基于最
低自由能原则，从每个家族中选出1条序列为代表，送往上海生工合成并标记5'FAM基团，进
一步对其亲和力和特异性分析。
筛选”，随机挑选30个阳性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司合成测序，对测序成
功的核酸适配体序列采用GLUSTALX 软件对其进行同源性分析，将其分为5个家族。基于最
低自由能原则，从每个家族中选出1条序列为代表，送往上海生工合成并标记5'FAM基团，进
一步对其亲和力和特异性分析。
[0054] 实施例2、核酸适配体的亲和力分析
[0055] 取实施例1合成的若干条核酸适配体，每条核酸适配体均用10mM PBS配制成一系列梯度浓度（0nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1600 nM, 3200 nM, 6400 nM）的
适配体溶液；按步骤4依次分析每条核酸适配体与MB‑bPAG4的结合情况，利用GraphPad
Prism 7.0 软件拟合结合曲线，计算各核酸适配体的解离常数Kd 值。图3为SEQ IDNo .1所
示的核酸适配体与靶标蛋白bPAG4的饱和结合曲线，该适配体与bPAG4蛋白具有高的亲和
力，解离常数为11.7 nM。采用在线Mfold 对SEQ IDNo .1所示的适配体序列进行二级结构
预测分析，结果见图4。
适配体溶液；按步骤4依次分析每条核酸适配体与MB‑bPAG4的结合情况，利用GraphPad
Prism 7.0 软件拟合结合曲线，计算各核酸适配体的解离常数Kd 值。图3为SEQ IDNo .1所
示的核酸适配体与靶标蛋白bPAG4的饱和结合曲线，该适配体与bPAG4蛋白具有高的亲和
力，解离常数为11.7 nM。采用在线Mfold 对SEQ IDNo .1所示的适配体序列进行二级结构
预测分析，结果见图4。
[0056] 实施例3：核酸适配体的特异性分析
[0057] 按步骤2分别制备MB‑bPAG1、MB‑bPAG4、MB‑bPAG9、MB‑BSA和MB‑OVA，将SEQ IDNo .1所示的核酸适配体序列用10mM PBS稀释至浓度为0.5 μM，按步骤4分析核酸适配体与各
蛋白偶联磁珠的结合情况，未连接任何蛋白的磁珠为阴性对照。检测结果见图5，SEQ IDNo
.1所示的核酸适配体优先结合靶标蛋白bPAG4，与同类家族蛋白也与较高的结合能力，而与
其他BSA和OVA蛋白则不结合。
蛋白偶联磁珠的结合情况，未连接任何蛋白的磁珠为阴性对照。检测结果见图5，SEQ IDNo
.1所示的核酸适配体优先结合靶标蛋白bPAG4，与同类家族蛋白也与较高的结合能力，而与
其他BSA和OVA蛋白则不结合。
[0058] 以上实施例仅为本发明的具体实施方式，但并不能理解为对本发明专利范围的限制。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案
及发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
及发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。