一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法及其应用

摘要

本申请提供一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法及其应用，包括以下步骤：(1)免洗免疫分析试剂的制备；(2)免洗免疫分析检测。本申请首次将单体碱性磷酸酶分裂为两个半酶，并和免疫检测抗体对分别进行融合表达，从而避免了传统的免洗平台进行化学偶联的方法，表达产物纯度高，均一性好，本申请中该单体酶进行拆分后没有活性，但是在抗体对识别抗原将半酶拉到足够近后，两个半酶就会结合拥有单体酶的活性，并能成功催化底物，同时本申请避免了传统免疫检测清洗的过程，极大的降低了检测时对仪器的依赖，该检测方法稳定性好，反应时间快，操作方便。

权利要求

1.一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）免洗免疫分析试剂的制备

将单体碱性磷酸酶phoX基因分裂成N‑phoX和C‑phoX两个半酶基因，获取与待检测物相匹配的抗体载体，即Antibody_1‑A、Antibody_2‑B；

将半酶基因N‑phoX克隆到Antibody_1的表达载体Antibody_1‑A上，融合表达在重链的C段，转染到CHO细胞中，表达纯化获得半酶N‑phoX‑Antibody_1；

将半酶基因C‑phoX克隆到Antibody_2的表达载体Antibody_2‑B上，融合表达在重链的C段，转染到CHO细胞中，表达纯化获得半酶C‑phoX‑Antibody_2；

将N‑phoX‑Antibody_1和C‑phoX‑Antibody_2等比例混合，即得免洗免疫分析试剂；

（2）免洗免疫分析检测

将步骤（1）中获得的免洗免疫分析试剂加入到待检测样品中，反应1小时，然后加入反应底物，检测光强度，根据待检测物的标准曲线测定样品中待检测物的含量;所述半酶N‑phoX的氨基酸序列为SEQ ID NO：1;所述半酶C‑phoX的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

2.如权利要求1所述的一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法，其特征在于，所述免洗免疫分析试剂的反应底物为对硝基苯磷酸盐和4‑MUP中的一种。

3.如权利要求1所述的一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法，其特征在于，所述待检测物为小分子化合物，脂类和蛋白质。

4.利用权利要求1‑3任一项所述的一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法在药物开发领域的应用。

说明书

一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法及其应用

技术领域

[0001] 本申请涉及免疫检测技术领域，尤其涉及一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法及其应用。

背景技术

[0002] 目前，免洗的免疫分析平台主要有以下四个平台。

[0003] 第一个平台为荧光偏振免疫分析(FPIA:Fluorescent  polarization immunoassay)，该平台不是基于三明治夹心法，而是采用竞争法，只采用一株抗体进行检
测。因此，特异性较差 ，容易有非特异性的检测【Smith  DS ,Eremin 
SA.Anal.Bioanal.Chem.391(5),1499–1507(2008).】。

[0004] 第二个平台为荧光共振能量转移(FRET:Fluorescence resonance energy transfer)，该检测方法利用在三明治系统中从供体到受体的光子能量转移来检测抗体和
抗原结合反应【Lam AJ,St‑Pierre F,.Nat.Meth.9(10),1005–1012(2012).】。该方法的成
本较贵，另外和抗体结合只能采用化学偶联的方法，并且偶联效率较低，均一性较差。

[0005] 第三个平台为发光氧通道免疫分析(LOCI:Luminescent oxygen‑channeling immunoassay),商品名为AlphaLISA，德国PerkinElmer公司专利，使用供体和受体珠(直径
250‑350纳米)。当供体珠被680nm光激发时，它们释放出活性的单线态氧。这种活化的单线
态氧在溶液中迅速衰变回基态。然而，如果受体珠在附近，单重态氧分子可以将其能量转移
到受体珠中的化学发光化合物，从而触发受体珠在615nm处发光。【Ullman EF,Kirakossian 
H,.Clin.Chem.42(9),1518–1526(1996).】。和FRET一样，和抗体结合只能采用化学偶联的
方法，并且偶联效率较低，均一性较差。

[0006] 第四个平台为DNA proximity平台，将DNA探针偶联到抗体上，利用抗体对识别抗原后，可以实现将抗体上偶联的DNA探针杂交，并利用DNA可以扩增的优势来放大检测信号
【Assarsson ELM,Holmquist G,.PLoS ONE 9(4),e95192(2014)】。同样，该方法采用化学偶
联的方法有明显的缺点，另外，DNA扩增对环境要求极高，容易出现假阳性的结果。

[0007] 采用分裂酶的方法进行蛋白和蛋白相互作用是目前基础研究领域常用的方法。比如HRP分裂酶【Martell,J.D.Nature Biotechnology.VOLUME 34,NUMBER 7(2016)】，beta半
乳糖苷酶【FABIO ROSSI,.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.94,pp.8405–8410,(1997)】和荧
光素酶luciferase【Ann‑Marie Broome,.Mol Pharm.7(1):60–74(2010).】。

[0008] 碱性磷酸酶是化学发光免疫方法学中常用的酶，碱性磷酸酶有化学和动力学上稳定的底物可用。碱性憐酸酶作为信号酶，具有较广的特异性底物，当酶被固定后，其酶活可
以迅速利用比色和终点突光检测法测定。因此，被广泛应用于医学、免疫学和分析生物技
术。目前常见的基因重组碱性磷酸酶来自大肠杆菌phoA基因表达，其活性结构是二聚体结
构，因此很难进行酶分裂法。

发明内容

[0009] 本申请为解决上述技术问题而提供一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法及其制备方法。

[0010] 本申请所采取的技术方案是：一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

[0011] (1)免洗免疫分析试剂的制备

[0012] 将单体碱性磷酸酶phoX基因分裂成N‑phoX和C‑phoX两个半酶基因，获取与待检测物相匹配的抗体载体，即Antibody_1‑A、Antibody_2‑B；

[0013] 将N‑phoX克隆到Antibody_1的表达载体Antibody_1‑A上，融合表达在重链的C段，转染到CHO细胞中，表达纯化获得半酶N‑phoX‑Antibody_1；

[0014] 将半酶基因C‑phoX克隆到Antibody_2的表达载体上，融合表达在重链的C段，转染到CHO细胞中，表达纯化获得半酶C‑phoX‑Antibody_2；

[0015] 将N‑phoX‑Antibody_1和C‑phoX‑Antibody_2等比例混合，即得免洗免疫分析试剂；

[0016] (2)免洗免疫分析检测

[0017] 将步骤(1)中获得的免洗免疫分析试剂加入到待检测样品中，反应1小时，然后加入反应底物，检测光强度，根据待检测物的标准曲线测定样品中待检测物的含量。

[0018] 进一步的，所述半酶N‑phoX的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

[0019] 进一步的，所述半酶C‑phoX的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

[0020] 进一步的，所述免洗免疫分析试剂的反应底物为对硝基笨磷酸盐、酚酞磷脂酶和4‑MUP中的一种。

[0021] 进一步的，所述待检测物为小分子化合物、脂类和蛋白质。

[0022] 利用上述的任意一种基于半酶的免洗免疫分析检测方法在临床诊断和药物开发领域的应用。

[0023] 本申请具有的优点和积极效果是：本申请首次将单体碱性磷酸酶分裂为两个半酶，并和免疫检测抗体对分别进行融合表达，从而避免了传统的免洗平台进行化学偶联的
方法，表达产物纯度高，均一性好，本申请中该单体酶进行拆分后没有活性，但是在抗体对
识别抗原将半酶拉到足够近后，两个半酶就会结合拥有单体酶的活性，并能成功催化底物，
同时本申请避免了传统免疫检测清洗的过程，极大的降低了检测时对仪器的依赖，该检测
方法稳定性好，反应时间快，操作方便。

[0024] 除了上面所描述的本申请解决的技术问题、构成技术方案的技术特征以及由这些技术方案的技术特征所带来的优点之外，本申请所能解决的其他技术问题、技术方案中包
含的其他技术特征以及这些技术特征所带来的优点，将在下文中作进一步详细的说明。

附图说明

[0025] 图1是本申请实施例提供的phoX单体碱性磷酸酶拆分示意图；

[0026] 图2是本申请实施例提供的免洗免疫检测示意图；

[0027] 图3是本申请实施例提供的pcDNA3.1‑FKBP载体构建成功的电泳图；

[0028] 图4是本申请实施例提供的pcDNA3.1‑FRB载体构建成功的电泳图；

[0029] 图5是本申请实施例提供的对照组phoX的剂量‑反应曲线图；

[0030] 图6是本申请实施例提供的N‑phoX‑FKRB和C‑phoX‑FRB混合组的剂量‑反应曲线图；

[0031] 图7是本申请实施例二提供的性能指标考核中剂量‑反应曲线验证的第一次测定曲线；

[0032] 图8是本申请实施例二提供的性能指标考核中剂量‑反应曲线验证的第二次测定曲线；

[0033] 图9是本申请实施例二提供的性能指标考核中剂量‑反应曲线验证的第三次测定曲线；

[0034] 图10是本申请实施例提供的健康人血清与性肿瘤病例血清剂量‑反应曲线图。

具体实施方式

[0035] 下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了
便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。

[0036] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

[0037] 实施例一N‑phoX、C‑phoX和N‑phoX/C‑phoX混合酶的活性检测

[0038] (1)phoX、N‑phoX‑FKRB、C‑phoX‑FRB和N‑phoX/C‑phoX混合酶的制备

[0039] S1、将Pasteurella multocida中的phoX基因瞬时转染CHO细胞，收集分泌的上清，即得单体碱性磷酸酶phoX。

[0040] S2、将Pasteurellamultocida中的phoX基因分裂成N‑phoX和C‑phoX两个半酶基因，如图1所示，并优化两个半酶基因。

[0041] S3、如图3所示，将优化后合成的N‑phoX基因克隆到pcDNA3.1‑FKBP中，C‑phoX基因克隆到pcDNA3.1‑FRB中，接着瞬时转染CHO细胞，收集分泌的上清，即获得N‑phoX‑FKRB半
酶。

[0042] S4、如图4所示，将优化后合成的C‑phoX基因克隆到pcDNA3.1‑FRB中，接着瞬时转染CHO细胞，收集分泌的上清，即获得C‑phoX‑FRB半酶。

[0043] 本实施例中，在雷帕霉素的作用下，将介导FKBP蛋白和FRB蛋白结合【Choi,J.,Chen,J.Science 273,239–242(1996).】，FKBP蛋白和FRB蛋白结合将导致N‑phoX和C‑phoX
结合，从而拥有完整碱性磷酸酶phoX的活性。

[0044] (2)phoX、N‑phoX‑FKRB、C‑phoX‑FRB和N‑phoX/C‑phoX混合酶活性的检测

[0045] S5、将phoX、N‑phoX‑FKRB、C‑phoX‑FRB稀释至10pg/ml，100pg/ml,1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml备用

[0046] S6、用稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)将雷帕霉素配置1mMol/L备用

[0047] S7、将各组样本加入空白反应杯，加样方式如表1所示：

[0048] 表1

[0049]

[0050] (3)加样后37℃反应1小时，每个反应杯中加入50微升碱性磷酸酶的底物(购买自ThermoFisher T2142)，用中生百克BHP9504化学放光仪检测光强度。结果如表2所示：

[0051] 表2

[0052]

[0053] 根据表2绘制对照组、N‑phoX‑FKRB和C‑phoX‑FRB混合组剂量‑反应曲线，如图5和图6所示。

[0054] 结果由表2，以及图5和图6所示，N‑phoX‑FKRB和C‑phoX‑FRB混合组的酶活性基本和对照组一致且不同浓度有线性关系，而单独的N‑phoX‑FKRB及C‑phoX‑FRB没有活性。

[0055] 实施例二VEGF免洗检测试剂的制备

[0056] 1、N‑phoX‑VEGF1和C‑phoX‑VEGF2的制备

[0057] 将N‑phoX基因克隆到pcDNA3.1‑VEGF1‑H载体(实验室保存的VEGF标记抗体表达载体)的C端，得到pcDNA3.1‑VEGF1‑H_N‑phoX，质粒大提，去内毒素，与pcDNA3.1‑VEGF1‑L共转
染CHO细胞，连续补料培养10天后，将收集的所有上清浓缩，ProteinA亲和纯化，即得抗体N‑
phoX‑VEGF1。

[0058] 将C‑phoX基因克隆到pcDNA3.1‑VEGF2‑H载体(实验室保存的VEGF标记抗体表达载体)的C端，得到pcDNA3.1‑VEGF2‑H_C‑phoX。质粒大提，去内毒素，与pcDNA3.1‑VEGF2‑L共转
染CHO细胞，连续补料培养10天后，将收集的所有上清浓缩，ProteinA亲和纯化，即得抗体C‑
phoX‑VEGF2。

[0059] 2、VEGF免洗检测试剂性能指标考核

[0060] 参照YY/T1175‑2010肿瘤标志物定量测定试剂(盒)化学发光法行业标准对VEGF免洗检测试剂性能指标验证。

[0061] (1)VEGF免洗检测试剂的性能验证指标

[0062] a、最低检测限：应不高于40pg/mL。

[0063] b、剂量‑反应曲线的线性：

[0064] 在线性区间40pg/mL～800pg/mL内，剂量‑反应曲线线性相关系数(r)应不小于0.9900。

[0065] c、准确度

[0066] 以VEGF免洗检测试剂检测国际标准品，准确度应在90％～110％范围内。

[0067] d、精密度

[0068] 精密度(CV)应不大于10％。

[0069] e、特异性

[0070] 20g/ml的人成纤维细胞生长因子2(FGF2)，30ng/ml的表皮生长因(EGF)，检测表观值应不大于50pg/ml。

[0071] (2)实验配置

[0072] S1、校准品配置

[0073] 将VEGF抗原(久丰润达，20190306，0.15mg/ml)用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释6个梯度(0pg/ml、50pg/ml、200pg/ml、800pg/ml、1600pg/ml、3200pg/ml)。

[0074] S2、国际标准品(NIBSC 02/286)配置

[0075] 将用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释6个梯度(0pg/ml、50pg/ml、200pg/ml、800pg/ml、1600pg/ml、3200pg/ml)。

[0076] S3、质控品配置

[0077] 将VEGF抗原(购自久丰润达，20190306，0.15mg/ml)用抗原稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释成QC1(200pg/ml±10％),QC2(1750pg/ml±10％)。

[0078] S4、特异性样本配置

[0079] 将FGF2(NIBSC 91/550)和EGF(NIBSC 90/712)用稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)分别稀释成20μg/ml和30ng/ml。

[0080] S5、将N‑phoX‑VEGF1用稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)稀释至10ng/ml。

[0081] S6、将C‑phoX‑VEGF2用稀释液(0.5mol PBS+1％BSA)分别稀释至10ng/ml。

[0082] (3)加样操作

[0083] 分别取上述配置的S1‑S4的VEGF校准品、国际标准品，质控品及标本各50μl加入相应空白发光板板孔内，再加上述步骤S5和S6配置好的N‑phoX‑VEGF1和C‑phoX‑VEGF2各50ul
加入各孔，振荡器振荡30秒钟，使其充分混合均匀，然后盖上封板膜，置37℃温育60分钟，最
后每孔加入底物液100ul(购买自ThermoFisher T2142)，用中生百克BHP9504化学发光仪检
测化学发光强度(RLU)。

[0084] (4)性能指标考核

[0085] S7、最低检测限

[0086] 平行测定20孔零校准品(0pg/ml)的相对发光强度，计算发光值平均值 和标准偏差SD，用剂量‑反应曲线计算发光值为 时对应的浓度值即为最低检出限。

[0087] 表3

[0088]

[0089] 结果，最低检测限为4.11pg/ml,不高于40pg/mL，符合指标。

[0090] S8、剂量‑反应曲线的线性

[0091] 复孔测定试剂盒的参考品(M0～M5，浓度依次为0pg/ml、50pg/ml、200pg/ml、800pg/ml、1600pg/ml、3200pg/ml)，平行测定三次，用四参数进行拟合，三次测定的剂量‑反
应曲线如图7、图8和图9所示。测定的剂量‑反应曲线线性相关系数(R)如表4所示。

[0092] 表4

[0093]  第一次测 第二次测 第三次测
线性相关系数R 0.9999 0.9999 0.9999

[0094] 由图7、图8和图9，以及表4可知，连续三次测定0‑3200pg/mL浓度范围VEGFA抗原曲线，线性相关系数R均大于0.9990，符合指标。

[0095] S9、准确度

[0096] 将国际标准品(13ug/支)稀释成理论浓度为50pg/ml、200pg/ml、800pg/ml、1600pg/ml、3200pg/m标本，检测3次，计算测定浓度与理论浓度的比值，如表5所示：

[0097] 表5

[0098]

[0099] 结果，连续三次检测由VEGF国际标准品配制的准确性标本，结果准确度均在95～105％范围内，在90％～110％要求，符合指标。

[0100] S10、精密度

[0101] 平行测定质控品Q1和质控品Q2各10孔，并记录相应发光强度，各孔分别按照公式计算CV，计算结果如表6所示。

[0102]

[0103] 式中：—质控品测定浓度值的平均值

[0104] SD—质控品测定浓度值的标准差

[0105] 表6

[0106]

[0107]

[0108] 结果，连续三次平行测定QC1、QC2，结果均小于2％，不大于10％要求，符合指标。

[0109] S11、特异性

[0110] 在稀释液中分别加入人成纤维细胞生长因子2(FGF2)和表皮生长因子(EGF)，配制成含20μg/ml的FGF2样本和30ng/ml的EGF样本，进行检测，测定结果如表7所示：

[0111] 表7

[0112]项目 发光值 浓度值(pg/mL)
人成纤维细胞生长因子2(20μg/mL) 16149 10.496
表皮生长因子(30ng/mL) 10409 7.235

[0113] 结果，人成纤维细胞生长因子2(20μg/mL)和表皮生长因子(30ng/mL)，检测表观值分别为10.496pg/ml和7.235pg/ml，不大于50pg/ml，符合要求。

[0114] 本实施例中，VEGF免洗检测试剂的最低检测限、剂量‑反应曲线、准确性、精密度和特异性性能指标均符合现有技术要求并优于市场现有方法学试剂。

[0115] 实施例三VEGF免洗检测试剂的临床应用：检测人血清VEGF的量

[0116] 选取40份健康人血清标本及10份经确诊的恶性肿瘤病例血清，用本申请的基于半酶的免洗免疫分析检测方法及电化学发光法VEGF试剂盒对40份健康人血清标本及10份经
确诊的恶性肿瘤病例血清进行检测，在临床上健康人血清发光值均小于200；性肿瘤病例血
清发光值均高于400。

[0117] (1)40份健康人血清标本检测发光强度如表8所示：

[0118] 表8

[0119]

[0120]

[0121] (2)10份恶性肿瘤血清标本检测发光强度如表9所示：

[0122] 表9

[0123]   电化学法 免洗检测   电化学法 免洗检测1 706.09 774.83 5 802.98 960.932
2 1429.26 1609.75 7 732.98 803.134
3 419.19 514.936 8 895.36 921.43
4 697.07 765.335 9 702.73 729.186
5 708.96 798.904 10 586.90 596.736

[0124] 根据表8和表9绘制健康人血清与性肿瘤病例血清剂量‑反应曲线，如图10所示。

[0125] 结果由表8和表9所示，基于半酶的免洗免疫分析检测方法与现有的电化学发光法检测方法临床诊断结果符合率100％。

[0126] 如图10所示，基于半酶的免洗免疫分析检测方法检测浓度结果与已有电化学发光法检测浓度结果相关性R为0.9979，符合YY/T1175‑2010肿瘤标志物定量测定试剂(盒)化学
发光法行业标准。

[0127] 本实施例中，临床样本检测结果VEGF免洗检测试剂与市场现有较先进的电化学发光法检测结果相符，免洗检测方法相对电化学发光法免去了复杂的洗涤步骤操作更为简单
有效。

[0128] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明的申请范围所作的均等变化与改进
等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。