知母皂苷N在制备防治肺纤维化药物中的应用

摘要

本发明涉及知母皂苷N在制备防治肺纤维化药物中的应用。在本发明实施例中，知母皂苷N能够显著改善博来霉素肺纤维化模型大鼠的体重、肺指数，显著降低与肺纤维化紧密相关的生化指标如肺组织中羟脯氨酸含量，肺泡灌洗液中TGF‑β和TNF‑α的水平。此外，将知母皂苷N与吡非尼酮联用能够进一步协同地改善与肺纤维化相关的上述指标。可见，知母皂苷N或知母皂苷N联合吡非尼酮能够有效改善肺纤维化模型大鼠的肺纤维化程度，具有开发成抗肺纤维化药物的前景，有重要的社会效益和经济效益。

权利要求

1.知母皂苷N在制备治疗肺纤维化药物中的应用。

2.知母皂苷N联合吡非尼酮在制备治疗肺纤维化药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肺纤维化为特发性肺纤维化或继发性肺纤维化。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物提高肺纤维化患者的呼吸功能和降低肺指数。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物降低肺组织中羟脯氨酸含量。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物降低肺组织炎症程度和胶原含量。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物降低肺泡灌洗液中TGF-β和TNF-α的水平。

8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物包含知母皂苷N和药学上可接受的载体，或者所述药物包含知母皂苷N联合吡非尼酮以及药学上可接受的载体，其中知母皂苷N与吡非尼酮的剂型是相同的，或知母皂苷N与吡非尼酮的剂型是不同的。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为口服剂型。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述口服剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液。

说明书

知母皂苷N在制备防治肺纤维化药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，涉及知母皂苷N的一种新用途，具体涉及知母皂苷N在制备防治肺纤维化的药物中的应用。

背景技术

[0002] 间质性肺病(interstitial lung disease,ILD)是以肺泡壁为主要病变所引起的众多异质性疾病组成的疾病谱。肺纤维化是各种间质性肺病的最终表现，因肺泡损伤、肺组织反复破坏修复，成纤维细胞增殖活化以及大量细胞外基质沉积，最终造成大量胶原纤维沉积于肺组织中。特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是肺纤维化疾病中最常见的类型，约占肺纤维化患者的一半以上，也是各种纤维化疾病中发展恶化最快。IPF是一种特殊形式的未知病因的慢性、不可逆进展性纤维化间质性肺炎，病因尚未完全明确，吸烟、环境和职业暴露、病毒感染、胃酸反流和遗传倾向为IPF风险因素，临床表现为渐进性、不可逆的呼吸困难和咳嗽，几乎所有的IPF患者最终死于呼吸衰竭。IPF患者在确诊后的中位生存期仅为3-5年，比肺腺癌预后更差。过去20年间，肺纤维化的死亡率呈现出逐年上升的趋势。因此，作为一种严重的慢性疾病，肺纤维化已成为世界各国关注的重要公共卫生问题。

[0003] 目前，可以用于治疗肺纤维化的药物非常有限。临床上，常用糖皮质激素、免疫抑制剂/细胞毒性药物和抗纤维化剂治疗，但有明显的副作用，且疗效非常不理想。在全球范围内，仅有两个专门用于治疗特发性肺纤维化的药物上市。吡啡尼酮(pirfenidone)于2008年首先在日本用于IPF治疗，2014年吡啡尼酮和尼达尼布(nintedanib)被美国FDA批准用于特异性地治疗IPF，目前我国只有吡啡尼酮被批准用于治疗IPF。但是，实质上，这两种药物也不能逆转或阻止IPF的病情发展。肺移植是治疗IPF相对有效的手段，但由于供体来源有限而制约了其广泛应用，且在移植后的中位生存期低于5年。近年来，我国医学工作者用中医药治疗和延缓器官纤维化取得了丰硕成果，从天然来源寻找治疗肺纤维化的药物公认为是研发此类药物的有效途径。

[0004] 知母是百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎，其性寒、味苦、甘，具有清热泻火、滋阴润燥的功效，常用于治疗肺胃气分实热、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘、肝肾阴虚火旺等病证。知母常用于治疗肺纤维化的中药方剂中，例如CN105497469A中公开了一种具有抗纤维化作用的中药复方组合物，由人参、桑白皮、甘草、知母等原料药制成。CN111166823A公开了一种知母总提取物用于制备抗肺纤维化的药物的医药用途。但是，该专利申请中并没有明确知母总提取物中抗肺纤维化的具体活性成分。对于知母皂苷N活性的报道较少，有研究报道其对HL-60细胞和A549细胞具有细胞毒作用(参见Yokosuka,et al.Steroidal glycosides from the underground parts of Yucca glauca and their cytotoxic activities.Phytochemistry.2014(101):109-115)。CN105560261A公开了知母皂苷N在制备防治糖尿病药物中的应用。但是，未见知母皂苷N防治肺纤维化方面的报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为了解决现有技术的不足，实现采用现代药物研究方法对天然产物进行开发利用，结合大量药效学实验筛选，提供知母皂苷N在制备防治肺纤维化药物中的应用。

[0006] 为达到本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：

[0007] 知母皂苷N在制备防治肺纤维化药物中的应用。

[0008] 知母皂苷N联合吡非尼酮在制备防治肺纤维化药物中的应用。优选地，知母皂苷N与吡非尼酮的重量比为1：1。

[0009] 所述肺纤维化为特发性肺纤维化或继发性肺纤维化。

[0010] 所述药物提高肺纤维化患者的呼吸功能和降低肺指数。

[0011] 所述药物降低肺组织中羟脯氨酸含量。

[0012] 所述药物降低肺组织炎症程度和胶原含量。

[0013] 所述药物降低肺泡灌洗液中TGF-β和TNF-α的水平。

[0014] 所述药物包含知母皂苷N和药学上可接受的载体，或者所述药物包含知母皂苷N联合吡非尼酮以及药学上可接受的载体。

[0015] 知母皂苷N与吡非尼酮的剂型是相同的，或知母皂苷N与吡非尼酮的剂型是不同的。

[0016] 可以将适当剂量的知母皂苷N与吡非尼酮在同一药物组合物中制剂，也可以将知母皂苷N与吡非尼酮分别制成不同的药物制剂。在后一种情况下，两者可以同时施用或者分别施用。

[0017] 所述药物的剂型为口服剂型。

[0018] 所述口服剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液。优选为片剂或胶囊剂。

[0019] 所述药学上可接受的载体是指药物制剂领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、色素、矫味剂、溶剂、表面活性剂中的一种或几种。

[0020] 本发明所述填充剂包括但不限于淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖等；所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、氯化钠、油酸钠、月桂醇硫酸钠、泊洛沙姆等；所述粘合剂包括但不限于水、乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂包括但不限于淀粉泡腾混合物即碳酸氢钠和枸橼酸、酒石酸、低取代羟丙基纤维素等；所述助悬剂包括但不限于多糖如金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚和羧甲基甲壳酯等；所述溶剂包括但不限于水、平衡的盐溶液等。

[0021] 可以将所述药物组合物制成各种固体口服制剂、液体口服制剂等。药剂学可接受的口服剂固体制剂有：普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、散剂等，口服液体制剂有口服液、乳剂等。上述各种剂型可以根据药物制剂领域的常规工艺制备而成。

[0022] 知母皂苷N可以采用生物提纯方法(例如，马百平，“知母中的两种新呋甾皂苷”，药学学报，第41卷第6期，2006，第527-532页；或者CN105560261A中公开的方法)从含有该活性成分的知母等植物中提取分离得到，也可购自市售产品。

[0023] 在上文所述的医药用途中，对于知母皂苷N的给药时间、给药次数和给药频率等等，需要根据病情的具体诊断结果而定，这在本领域技术人员掌握的技术范围之内。

[0024] 将对大鼠的治疗方案应用于人体上，所有药物对人的有效剂量可以通过该药物对大鼠的有效剂量进行换算，这对于本领域的普通技术人员而言也是容易实现的。

[0025] 为了更好地理解本发明的实质，在下文具体实施方式部分用药效学实验及其结果来进一步说明知母皂苷N在制药领域中的新用途。

[0026] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0027] 本发明结合我国在天然产物研究方面的优势，筛选出天然产物单体知母皂苷N在防治肺纤维化方面的新用途。知母皂苷N能够显著改善博来霉素肺纤维化模型大鼠的体重，显著降低与肺纤维化紧密相关的生化指标如肺组织中羟脯氨酸含量，肺泡灌洗液中TGF-β和TNF-α的水平。此外，将知母皂苷N与吡非尼酮联用能够进一步协同地改善与肺纤维化相关的上述指标。可见，知母皂苷N或知母皂苷N联合吡非尼酮能够有效改善肺纤维化模型大鼠的肺纤维化程度，具有开发成抗肺纤维化药物的前景，为临床上治疗肺纤维化提供了更多治疗选择，有重要的社会效益和经济效益。

具体实施方式

[0028] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

[0029] 实施例1：知母90％乙醇总提取物的制备以及知母皂苷N的制备和表征[0030] 取知母药材2.0kg，以20L 90％(v/v)乙醇回流提取3次，每次回流2小时，过滤，合并滤液，得到知母90％乙醇总提取物，回收乙醇，减压浓缩至5L，保留一部分浓缩液用于后续给药。

[0031] 加水15L稀释剩余浓缩液，至体积浓度为0.1g生药/mL,溶液进行过滤，滤液待上样。将预先处理好的大孔吸附树脂HP20装柱(5L)，放置平衡后，滤液上样。上样之后依次用6倍柱体积(6BV)的水洗脱除杂，用6BV的30％(v/v)乙醇洗脱除杂、用6BV的50％(v/v)乙醇洗脱，最后用3BV的95％(v/v)乙醇洗脱下柱，经检测知母皂苷N主要集中于50％(v/v)乙醇部分，此部分洗脱液回收乙醇，浓缩至小体积，真空干燥得知母皂苷N粗样品。

[0032] 取粗样品溶解于200mL水溶液，通入50％(v/v)甲醇平衡好的ODS柱(5L)，用50％甲醇(2000mL)洗脱，收集洗脱液，每份1000mL，HPLC检测各份纯度，将8-15份合并，回收甲醇，浓缩至小体积，干燥得知母皂苷N。HPLC检测纯度为95％。利用质谱和核磁等手段进行了结构鉴定。

[0033] 实施例2：知母皂苷N抗肺纤维化的药效学研究

[0034] 1.实验目的

[0035] 考察知母皂苷N对博来霉素致大鼠肺纤维化模型的影响

[0036] 2.实验材料

[0037] 2.1动物：SPF级SD大鼠，雄性，体重200±20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号:SCXK(京)2018-0006。

[0038] 2.2主要仪器：分析天平、电子天平、2mL注射器、灌胃针头、动物笼具、水浴锅、紫外分光光度计、酶标仪等。

[0039] 2.3主要药品和试剂：博来霉素(日本化药株式会社)、吡非尼酮(北京康蒂尼药业有限公司)、羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)、TGF-β和TNF-α试剂盒(R&D Systems公司)。

[0040] 3.实验方法

[0041] 3.1大鼠肺纤维化模型的建立和给药

[0042] 将SD大鼠于室温下饲养，待其适应环境后，使用3％的戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉(麻醉剂量为40mg/kg)，麻醉后气管内注射博来霉素(注射浓度为5mg/kg，注射体积为1mL/kg)，空白组向气管内注射等体积生理盐水(1mL/kg)。动物苏醒后，可以自行摄食和饮水。大鼠造模3天后，开始灌胃给药。给药周期为28天。

[0043] 本实验分组和给药量如下，每组8只大鼠：

[0044] (1)空白组：生理盐水

[0045] (2)模型组：生理盐水

[0046] (3)吡非尼酮组：150mg/kg，根据70kg体重患者的临床用剂量换算

[0047] (4)知母90％乙醇总提取物组：8g/kg，以知母生药量计，参考在大鼠中进行的其他实验的用量

[0048] (5)知母皂苷N：50mg/kg，参考在大鼠中进行的其他实验的用量

[0049] (6)知母皂苷N+吡非尼酮组：知母皂苷N25mg/kg，吡非尼酮25mg/kg[0050] 3.2评价指标

[0051] 3.2.1体重：将大鼠放置在电子天平上进行称量，将开始称重计为第0周，然后每隔7天称重一次。

[0052] 3.2.2肺指数：实验结束时，在大鼠麻醉后，打开胸腔，取出大鼠肺组织用生理盐水洗净，洗净后用滤纸将生理盐水吸干，此时肺组织重量即为大鼠肺湿重。

[0053] 肺指数＝大鼠肺湿重/体重×100％

[0054] 3.2.3羟脯氨酸含量：羟脯氨酸含量反映结缔组织疾病的胶原代谢情况，通过测定羟脯氨酸含量可以了解组织纤维化程度。取新鲜左肺组织，按照试剂盒说明书进行检测。

[0055] 羟脯氨酸含量(μg/mg)＝(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)x标准品含量(5μg/mL)x(水解液总体积(10mL)x组织湿重)

[0056] 3.2.4 TGF-β和TNF-α含量：收集肺泡灌洗液，采用ELISA法，按照试剂盒说明书进行检测。

[0057] 3.3统计学方法

[0058] 结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据以平均值±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有显著统计学意义。

[0059] 4.实验结果

[0060] 4.1体重测定结果

[0061] 如表1所示，在第0周至第4周期间，空白组动物的体重呈现出稳步增长的趋势。博来霉素致肺纤维化模型组大鼠的体重随着时间的推移呈现出显著下降趋势。阳性对照药物吡非尼酮组、知母皂苷N组以及知母皂苷N联合吡非尼酮组大鼠体重也表现出逐渐增加的趋势，这三组动物的体重均与空白组较为接近，知母皂苷N组大鼠的体重甚至高于吡非尼酮组，在第4周时，这三组动物的体重均在统计学上显著高于模型组(p<0.05)，表明知母皂苷N以及知母皂苷N联合吡非尼酮均有助于降低博来霉素对大鼠体重的影响。知母90％乙醇总提取物也能够改善博来霉素对大鼠体重的影响(p<0.01)，但其效果明显不及知母皂苷N单体和知母皂苷N联合吡非尼酮。

[0062] 表1：知母皂苷N对肺纤维化模型大鼠体重的影响(g)

[0063]

[0064] 注：*p<0.05，**p<0.01，与模型组比较，仅对第4周结果进行了统计检验。

[0065] 4.2肺指数测定结果

[0066] 如表2所示，结果表明，与空白组比较，博来霉素致肺纤维化模型组大鼠对肺指数出现明显升高，说明造模成功。与模型组相比，阳性对照药物吡非尼酮显著改善了大鼠的肺指数(p<0.05)。知母皂苷N也能够显著改善大鼠的肺指数(p<0.05)，但其效果不如吡非尼酮。知母皂苷N联合吡非尼酮对大鼠肺指数的改善作用介于吡非尼酮与知母皂苷N之间。知母总提取物对大鼠肺指数的改善作用具有统计学显著性，也不及知母皂苷N单体。

[0067] 表2：知母皂苷N对肺纤维化模型大鼠肺指数的影响

[0068]

[0069] 注：*p<0.05，与模型组比较。

[0070] 4.3羟脯氨酸测定结果

[0071] 如表3所示，结果表明，与空白组比较，博来霉素致肺纤维化模型组大鼠对羟脯氨酸含量明显升高，说明造模成功。与模型组相比，阳性对照药物吡非尼酮显著降低了大鼠肺组织中的羟脯氨酸含量(p<0.05)。知母皂苷N也能够显著降低大鼠肺组织中的羟脯氨酸含量(p<0.05)，但其效果不如吡非尼酮。知母皂苷N联合吡非尼酮对大鼠肺组织中羟脯氨酸含量的降低作用介于吡非尼酮与知母皂苷N之间。知母总提取物对大鼠肺组织中羟脯氨酸含量的降低作用不具有统计学显著性，也不及知母皂苷N单体。

[0072] 表3：知母皂苷N对肺纤维化模型大鼠羟脯氨酸含量的影响

[0073]

[0074] 注：*p<0.05，与模型组比较。

[0075] 4.4细胞因子水平测定结果

[0076] 如表4所示，结果表明，与空白组比较，博来霉素致肺纤维化模型组大鼠肺泡灌洗液中肺纤维化典型细胞因子标志物TGF-β和TNF-α含量明显升高，说明造模成功。与模型组相比，阳性对照药物吡非尼酮非常显著地降低了大鼠肺泡灌洗液中TGF-β和TNF-α的含量(p<0.01)。知母皂苷N也能够显著降低大鼠肺泡灌洗液中TGF-β和TNF-α的含量(p<0.05)，但其效果不如吡非尼酮。知母皂苷N联合吡非尼酮对大鼠肺泡灌洗液中TGF-β和TNF-α含量的降低作用介于吡非尼酮与知母皂苷N之间。知母总提取物对大鼠肺泡灌洗液中TGF-β和TNF-α含量的降低作用不具有统计学显著性，也不及知母皂苷N单体。

[0077] 表4：知母皂苷N对肺纤维化模型大鼠细胞因子水平的影响

[0078]

[0079] 注：*p<0.05，**p<0.01，与模型组比较。

[0080] 5.实验结论

[0081] 上述实验结果表明，知母皂苷N能够显著改善博来霉素肺纤维化模型大鼠的体重、肺指数，显著降低与肺纤维化紧密相关的生化指标如肺组织中羟脯氨酸含量，肺泡灌洗液中TGF-β和TNF-α的水平，其作用效果与阳性对照药物吡非尼酮接近，且明显优于知母90％乙醇总提取物。

[0082] 值得一提的是，在知母皂苷N+吡非尼酮(1：1)组中，知母皂苷N的用量是知母皂苷N组的二分之一，吡非尼酮的用量是吡非尼酮组的六分之一，但是将上述两者联用对肺纤维化大鼠体重的影响却能够取得与知母皂苷组或吡非尼酮组相似的效果，且将上述两者联用对肺指数的改善作用以及对肺组织中羟脯氨酸含量，肺泡灌洗液中TGF-β和TNF-α水平的降低作用甚至略优于知母皂苷N。可见，将知母皂苷N与吡非尼酮联用能够极大地降低两者的用量，且其抗纤维化作用与知母皂苷N相当甚至更好，这在改善用药安全性方面是非常有意义的。

[0083] 综上所述，天然产物单体知母皂苷N或知母皂苷N联合吡非尼酮能够有效改善肺纤维化模型大鼠的肺纤维化程度，为临床上治疗肺纤维化提供了更多治疗选择，具有开发成抗肺纤维化药物的前景，有重要的社会效益和经济效益。

[0084] 此外，在上述动物实验中，未观察到知母皂苷N存在明显的不良反应，实验动物对其具有良好的耐受性。

[0085] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。