一种植物乳杆菌及其应用

摘要

本发明提供了一种植物乳杆菌及其应用，属于益生菌与饲料添加剂制备技术领域。本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)命名为DMSLP0315，保藏编号为GDMCC No.60716，该菌具有抑制ETEC功能，所产细菌素经121℃、30min热处理后抑菌活性仍保留80％以上，对高温具有耐受性；抑菌活性在pH值2‑10均保留80％以上抑菌活性，用胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K处理该菌后抑菌活性均保留90％以上，对肠道环境耐受性好，降低腹泻率，提高饲料转化效率，效果安全可靠，适用于开发为饲用益生菌添加剂。

权利要求

1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315，其特征在于，其保藏编号为GDMCC No.60716。

2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315和/或其发酵产物。

3.一种饲料添加剂或动物饲料，其特征在于，含有权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315和/或其发酵产物。

4.含有权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315或其发酵产物的药物。

5.如权利要求4所述的药物，其特征在于，其为抑制ETEC的药物。

6.一种复合菌剂，其特征在于，由权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315与保藏编号为GDMCC No.60717的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP1210复配而成。

7.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315或其发酵产物或权利要求6所述的复合菌剂在制备饲料添加剂中的应用。

8.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315或其发酵产物或权利要求6所述的复合菌剂在制备抑制ETEC的药物或保健品中的应用。

9.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315或其发酵产物或权利要求6所述的复合菌剂在提高饲料转化率中的应用。

10.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315或其发酵产物或权利要求6所述的复合菌剂在促进动物生长或提高动物体重中的应用。

说明书

一种植物乳杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及益生菌及饲料添加剂制备技术领域，具体地涉及一种植物乳杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 大肠埃希菌，通常被称为大肠杆菌，属于埃希氏菌属，是一种革兰氏阴性菌。大多数生活在肠道的大肠杆菌菌株是无害的，但是，也有一些具有致病性的菌株可引起仔猪患
腹泻病。依据生物学性质的不同可将致病性大肠杆菌分为6类：肠侵袭性大肠杆菌
(Enterinvasive Escherichia coli，EIEC)、肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic 
Escherichia coli，EPEC)、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，
EHEC)、产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)、肠黏附性大肠杆
菌(Enteroadherent Escherichia coli，EAEC)、弥散粘附性大肠杆菌(Diffusely 
adherent Escherichia coli，DAEC)。目前，产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪腹泻的主
要传染源，常导致仔猪黄痢、白痢的发生，是全球养猪业中导致育猪死亡的主要因素。

[0003] 目前治疗仔猪腹泻病使用最广泛的仍然是抗生素，然而抗生素残留问题日益严重，抗生素耐药菌株的发展和传播也限制了抗生素的使用。开发抗生素替代物，建立替代治
疗策略刻不容缓。乳酸菌具有长期安全食用的历史，对宿主有积极健康的影响，其产生的乳
酸、过氧化氢和细菌素等可以有效抑制肠道病原微生物，多株乳酸菌已被证明能够抑制致
病性大肠杆菌。近年来，许多益生菌产品已被用于治疗仔猪腹泻，包括含有活的益生菌微生
物的药物，此外一些具有抗菌潜力的细菌肽也被认为是一种合适的抗生素替代品，其中乳
酸菌素成为最有研究价值的热点之一。

[0004] 乳酸菌素是乳酸菌代谢过程中通过核糖体合成机制产生并胞外分泌的一类具有生物活性的蛋白或蛋白复合物，具有安全性高、稳定性好、不易残留、没有抗药性等优点，可
以抑制与乳酸菌和非乳酸菌亲缘关系相近的革兰氏阳性细菌，从而切断病原微生物对动物
肠道的危害，具有重要的应用价值。据报道乳酸菌细菌素目前几乎只应用于食品领域，但在
饲料、有机肥料、环境保护和个人护理产品等领域也具有广阔的应用前景。目前，乳酸链球
菌素(Nisin)是唯一一种获得美国食品药品监督管理局批准的细菌素，而且高纯度的乳酸
链球菌素(99％)价格昂贵，市场上很难买到，因此，开发成本低廉的乳酸菌素具有很高的商
业吸引力。近年来对乳酸菌素的研究主要集中在其抑菌活性、热稳定性、pH耐受性等方面，
深入研究乳酸菌素的生物学性质对于其加工应用至关重要。据报道乳酸菌素对其他细菌表
现出的抗菌特性与产生菌株密切相关，已有研究表明植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌及屎肠球菌
等菌株均能产生对致病性大肠杆菌具有抑制作用的乳酸菌素。然而，乳酸菌素的合成量受
到多种因素的影响，如高产量菌株、pH值、温度、培养基组成和菌株的生长状况等，因此，高
效乳酸菌菌株的分离和乳酸菌细菌素合成条件的优化至关重要。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种植物乳酸菌，并且该植物乳酸菌产生的细菌素耐高温、耐酸，对蛋白酶耐受性高，可用于制备饲料添加剂，用于降低腹泻率，提高饲料转化效率。

[0006] 为了实现本发明的目的，本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315是从猪粪便中分离的168株乳酸菌菌株经过层层筛选获得的。该菌株DMSLP0315
为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。该菌已于2019年7月8日保藏在广东省微生物
菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究
所，邮编510070)，分类命名为Lactobacillus plantarum，保藏号为GDMCC No.60716。

[0007] 本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，细胞形态为短杆菌，不规则形状。菌落白色、圆形凸起，表面光滑，不透
明。

[0008] 生理生化试验显示，硝酸盐还原反应、过氧化氢酶试验均为阴性，不液化明胶，不产生吲哚和H2S，无运动性，能利用纤维二糖、七叶甘、果糖、山梨醇、蜜二糖、葡萄糖、乳糖、
麦芽糖、甘露醇、甘露糖、水杨苷、蔗糖，不能利用阿拉伯糖、棉子糖、木糖。

[0009] 本发明通过生理生化鉴定方法与16S rDNA序列分析方法相结合将菌株DMSLP0315鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

[0010] 用DMSLP0315的无细胞发酵上清液进行抑菌实验，同时测定该菌株排除有机酸的无细胞发酵上清液(pH调至6.5)及排除过氧化氢的无细胞发酵液的抑菌效果，以ETEC CVCC 
1518为指示菌，试验结果显示无细胞发酵上清液的抑菌圈直径18.50±0.17(mm)，排除有机
酸的无细胞发酵上清液的抑菌圈直径15.52±0.21mm，排除过氧化氢的无细胞发酵上清液
的抑菌圈直径15.51±0.18mm，说明DMSLP0315的发酵产物具有ETEC抑制活性，且该菌的发
酵产物在pH值2.0‑10.0时均保留80％以上对ETEC的抑菌活性，不会产生溶血性危害。

[0011] 植物乳杆菌DMSLP0315的发酵产物属于本发明的保护范围。

[0012] 本发明提供含有该植物乳杆菌DMSLP0315或其发酵产物的菌剂。

[0013] 本发明还提供一种含有该植物乳杆菌DMSLP0315的动物饲料添加剂。本发明还提供一种含有该植物乳杆菌DMSLP0315的动物饲料。

[0014] 本发明通过体外法鉴定了植物乳杆菌DMSLP0315的益生效果，结果表明，植物乳杆菌DMSLP0315能够耐酸、能抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。

[0015] 本发明还发现植物乳杆菌DMSLP0315所产的细菌素具有对高温的耐受能力，121℃热处理30min后抑菌活性保留在80％以上，并且用胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶分别处理植
物乳杆菌DMSLP0315的发酵液中的细菌素后，发现细菌素对ETEC的抑菌活性保留在90％以
上，因此本发明提供了含有植物乳杆菌DMSLP0315的抑制ETEC的药物，以及提供了植物乳杆
菌DMSLP0315在降低食品或饲料中ETEC污染中的应用。

[0016] 本发明还提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315或其发酵产物在制备饲料添加剂中的应用。优选地，所述饲料添加剂能抑制ETEC，且对胃蛋白酶、胰蛋
白酶、蛋白酶K敏感性低。

[0017] 本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315或其发酵产物在抑制ETEC中的应用。

[0018] 本发明实施例中，以植物乳杆菌DMSLP0315和保藏编号为GDMCC No.60717的植物乳杆菌DMSLP1210为复配菌种，按照有效活菌数1:1进行配比，具有协同增效的抑菌效果。植
物乳杆菌DMSLP1210已于2019年7月8日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，(简称GDMCC，地
址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)，分类命名为
Lactobacillus plantarum，保藏号为GDMCC No.60717。本发明实施例还获得用于复配菌种
发酵产细菌素的廉价天然培养基，成分为4％玉米浆粉、2％酵母提取物和2％葡萄糖；上述
培养基的最优发酵条件为发酵温度32℃、发酵pH5.5、接种量2％，以最佳工艺参数发酵22h
后，按照如下条件进行喷雾干燥：物料浓度30％，进风温度为160℃，出风温度为80℃，制备
的乳酸菌素中细菌素效价达到2394.76AU/g。

[0019] 因此，本发明进一步提供一种复合菌剂，由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315与保藏编号为GDMCC No.60717的植物乳杆菌(Lactobacillus 
plantarum)DMSLP1210复配而成。优选地，以有效活菌数1:1复配而成。

[0020] 进一步地，本发明还提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315或其发酵产物在提高饲料转化率中的应用。

[0021] 本发明还提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315或其发酵产物在促进动物生长或提高动物体重中的应用。

[0022] 本发明的有益效果主要体现在：

[0023] 1、乳酸菌在代谢过程中可以产生多种抑菌物质，例如有机酸、双乙酰、过氧化氢和细菌素等，这些抑菌物质种类繁多，逐一排除非常困难。现有技术公认的确定细菌素的标准
是乳酸菌发酵上清液中的有机酸和过氧化氢排除后，仍具有抑菌活性即可初步判定乳酸菌
的发酵上清液中存在细菌素，对具体物质的证明则需进一步深入研究。一般采用中和酸法
排除有机酸的干扰，采用过氧化氢酶处理发酵液排除过氧化氢的干扰。本发明的植物乳杆
菌DMSLP0315发酵上清液在排除有机酸和过氧化氢后，仍能保持明显的抑菌活性，因此认为
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315的发酵上清液中存在细菌素。该菌无溶
血性，对庆大霉素有抗性，对氯霉素和红霉素敏感。

[0024] 2、植物乳杆菌DMSLP0315所产细菌素具有较强的抗逆性，其耐高温特性使其在热加工过程中不易被破坏；其具有良好的酸稳定性及酸碱耐受性，在pH 2～6之间表现出较好
的酸稳定性，在pH 2～4范围内抑菌活性明显高于pH 8～10时的抑菌活性。植物乳杆菌
DMSLP0315所产细菌素对蛋白酶的敏感性低，对肠道环境有更好的耐受性，能耐受胃肠道中
低酸环境，可以在胃肠道发挥较强的抑菌作用，具有开发为治疗腹泻用乳酸菌素的潜力。

[0025] 3、本发明的植物乳杆菌DMSLP0315具有显著的益生性，能够提高饲料利用率，能减少动物的病害率、减少动物因饮食抗生素类添加剂所致的腹泻率、以及降低死淘率，更重要
的是可以增强动物的免疫功能，增加动物的日采食量、提高饲料转化率、降低料肉比、增强
动物的生产性能、改善动物体内消化道内环境的稳态，具有促进营养的吸收利用、促进动物
生长等功效，从而节约成本、提高经济效益，具有良好的应用前景。

[0026] 4、将植物乳杆菌DMSLP0315和保藏编号为GDMCC  No.60717的植物乳杆菌DMSLP1210等比例复配，以改良玉米浆粉培养基(4％玉米浆粉+2％酵母提取物+2％葡萄糖)
按照如下条件进行发酵：发酵温度为32℃、发酵pH为5.5、接种量为2％，发酵时间为22h；发
酵结束后，按照如下条件进行喷雾干燥：物料浓度30％，进风温度为160℃，出风温度为80
℃，制备出细菌素效价为2265.80AU/g的发酵产物，可作为饲料添加剂进行使用。

[0027] 5、本发明的植物乳杆菌DMSLP0315的发酵产物作为益生菌和饲料添加剂成分，不存在抗生素类饲料添加剂的耐药性和残留问题，应用安全。

附图说明

[0028] 图1为DMSLP0315所产细菌素的标准效价曲线。

[0029] 图2为DMSLP1210所产细菌素的标准效价曲线。

[0030] 图3为DMSLP0315的生长曲线图。

[0031] 图4为DMSLP1210的生长曲线图。

[0032] 图5为培养时间对DMSLP0315抑菌活性的影响示意图。

[0033] 图6为培养温度对DMSLP0315抑菌活性的影响示意图。

[0034] 图7为DMSLP0315所产细菌素对温度的敏感性示意图。

[0035] 图8为DMSLP0315所产细菌素对pH的敏感性示意图。

[0036] 图9为DMSLP0315所产细菌素对酶的敏感性示意图。

[0037] 图10为7种复配方式的菌株代谢产物的抑菌活性示意图。

[0038] 图11为四种培养方式下上清液抑菌活性变化示意图。

[0039] 图12为恒pH 5.5发酵时制得的发酵干燥物的最小抑菌浓度。

[0040] 图13为非恒发酵时制得的发酵干燥物的最小抑菌浓度。

具体实施方式

[0041] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试
剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明实施例采用了双层平板打孔法检测细菌
素抑菌活性。产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli)ETEC CVCC 1518：
购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

[0042] MRS培养基：胰蛋白胨10g、柠檬酸氢二胺2g、蛋白胨5g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、酵母粉5g、Tween‑80 1g、牛肉膏5g、葡萄糖20g、硫酸锰0.25g、硫酸镁0.58g、蒸馏水1L，固体
培养基添加2％琼脂，调节pH 5.8，121℃灭菌15min。

[0043] LB培养基：蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母粉5g、蒸馏水1L，固体培养基添加2％琼脂，调节pH 7.2，121℃灭菌15min。

[0044] 实施例1植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMSLP0315的分离与鉴定

[0045] 1、东北农业大学阿城三花猪育种基地的猪粪便中分离的164株乳酸菌菌株和实验室保藏的168株乳酸菌。

[0046] 85份猪粪便样品经梯度稀释并培养后，挑选出164株有溶钙圈的疑似乳酸菌菌株，以字母H编号命名，将分离菌株于MRS固体培养基培养48h后，观察发现菌落形态多呈乳白色
圆形、中间略微隆起、不透明或半透明、边缘整齐。革兰氏染色呈阳性，菌体形态呈短杆、长
杆或圆球形，将－20℃冰箱中冷冻保存的乳杆菌和乳球菌分别以2％接种量接种于MRS和
M17液体培养基中，于37℃培养16h，连续活化传代3次备用。分离获得的猪源乳酸菌于－20
℃冰箱中冷冻保存，使用前以2％接种量将冷冻保存的菌种接种于MRS液体培养基中，于37
℃培养16h，连续活化传代3次备用。

[0047] 产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC CVCC 1518)以2％接种量分别接种于LB液体培养基中，于37℃培养16h，连续活化传代3次备用。

[0048] 2、抑菌活性的测定

[0049] 2.1无细胞发酵上清液的制备试验菌株以2％的接种量接种于MRS液体培养基中，置于37℃培养20h，12000r/min离心15min，收集上清液，调节pH至6.5，排除有机酸的干扰；
将过氧化氢酶溶解于0.02mol/L的乙酸钠缓冲液中，加入到上清液，控制过氧化氢酶的终质
量浓度为5.0mg/mL，在37℃下温育2h，以排除过氧化氢的干扰；用0.22μm滤膜过滤除去上清
液中的菌体和其他杂质；通过冷冻干燥的方法将无细胞发酵上清液浓缩10倍，用无菌水复
溶。

[0050] 2.2抑菌圈直径的测定采用双层平板打孔法测定抑菌圈直径。按每平皿10mL将含1.2％的软琼脂倾倒于无菌平皿中晾干；以0.6％的接种量将ETEC CVCC 1518接入含0.7％
琼脂的LB培养基(50℃左右)中，倾倒6mL含有ETEC CVCC 1518的LB琼脂培养基于底层琼脂
上；晾干后用打孔器打孔，向孔中加入100μL无细胞发酵上清液，在生物洁净工作台中扩散3
小时后，置于37℃培养9h，用游标卡尺测定抑菌圈直径。

[0051] 对实验室保藏的168株乳酸菌及从猪粪便分离的164株乳酸菌的无细胞发酵上清液进行抑菌实验，同时测定试验菌株排除有机酸的无细胞发酵上清液(pH调至6.5)及排除
过氧化氢的无细胞发酵液的抑菌效果，以ETEC CVCC 1518为指示菌，试验结果如表1所示
(部分阴性试验结果未列出)。

[0052] 表1乳酸菌对ETEC CVCC 1518的抑制效果

[0053]

[0054] 由表1可知，排除有机酸的干扰后仍有四株菌具有抑菌活性，其中1株为DMSLP0315，筛选自实验室保藏的168株乳酸菌中；3株编号为H3‑5、H7‑6和DMSLP1210，分离
自164株猪源乳酸菌中。四株乳酸菌的无细胞发酵上清液经过氧化氢酶处理前后抑菌圈直
径基本不变。根据上述试验结果可以推断四株乳酸菌的无细胞发酵上清液除了有机酸和过
氧化氢外可能还存在对ETEC CVCC 1518有抑制作用的细菌素，初步确定四株菌能产生抑制
ETEC CVCC 1518的细菌素。

[0055] 2.3细菌素效价的测定方法

[0056] 以AU/mL表示细菌素效价，具体测定方法如下，取抑菌圈直径最大的时间段样品作为标准品，将其进行复溶后，用灭菌后的新鲜的MRS液体培养基分别稀释1、2、4、8、16倍，采
用双层平板打孔法测定抑菌圈直径，以稀释过程中能出现明显抑菌圈的稀释度记为稀释因
子D，依据抑菌圈直径和稀释因子的关系绘制标准曲线，根据公式计算细菌素效价。

[0057] 抑菌圈直径和稀释因子的关系为：R＝a+blog(d)

[0058] 细菌素效价计算公式为：

[0059] R——抑菌圈直径(mm)，a——截距，b——斜率，D——稀释因子，d——每孔浓度，即上样量/D。

[0060] 根据各个不同稀释度所对应抑菌圈的大小绘制细菌素标准效价曲线(见图1、图2)，得到植物乳杆菌DMSLP0315回归方程为y＝7.42x+0.776，相关系数R2＝0.9870；植物乳
杆菌DMSLP1210回归方程为y＝6.4x+1.7273，相关系数R2＝0.9860。x表示每孔浓度(d)的对
数值，y表示抑菌圈直径(mm)。上述菌的回归方程均符合进一步试验要求。

[0061] 2.4生长曲线的测定

[0062] 植物乳杆菌DMSLP0315和植物乳杆菌DMSLP1210均以2％接种量接种于MRS培养基中，于37℃培养36h，以活菌数为测定指标绘制生长曲线见图3、图4。由图可知，植物乳杆菌
DMSLP0315生长迟滞期为培养初始～6h左右，随后进入对数生长期，此期间菌体呈指数倍增
加，当培养20h时活菌数达到最高值，16～24h为植物乳杆菌DMSLP0315生长的稳定期，菌体
生长缓慢，24h后逐渐进入衰亡期；植物乳杆菌DMSLP1210生长迟滞期在初始～6h左右，随后
进入对数生长期，此期间菌体呈指数倍增加，当培养22h时活菌数达到最高值，16～24h为植
物乳杆菌DMSLP1210生长的稳定期，菌体生长缓慢，24h后逐渐进入衰亡期。

[0063] 3、乳酸菌的鉴定

[0064] 3.1菌落及菌体形态观察将筛选获得的产细菌素乳酸菌菌株分别在MRS固体培养基上划线，置于37℃培养两天后，观察菌落颜色、形状、大小以及其他特征等；同时用接种环
挑取单菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体染色情况及菌体形态。

[0065] 3.2生理生化试验

[0066] 对筛选获得的产细菌素乳酸菌菌株进行生理生化鉴定，包括过氧化氢酶试验、明胶液化试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、H2S产生试验、运动性试验和糖发酵试验(包括阿
拉伯糖、纤维二糖、七叶甘、果糖、山梨醇、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜
二糖、棉子糖、水杨苷、木糖、蔗糖)。

[0067] 根据《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，可将菌株DMSLP0315和菌株DMSLP1210初步鉴定为乳杆菌属。

[0068] 3.3 16S rDNA序列分析

[0069] 将筛选获得的产细菌素乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基中，置于37℃培养20h后，离心收集菌体，参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。将提取获得
的DNA分装于PCR管中，于‑20℃冰箱中保存备用。取5μL样品进行1％琼脂糖凝胶电泳检测提
取的基因组DNA。采用通用引物27F和1492R扩增目的基因，PCR扩增后的序列通过吉林省库
美生物科技有限公司测序，通过BLAST在基因库中进行同源性分析，寻找与目的基因序列相
似性最高的菌株，采用MEGA5.0软件运用邻接法对相似性最高的菌株构建系统发育树，可见
DMSLP0315和DMSLP1210均与Lactobacillus plantarumstrain_JCM_1149,Lactobacillus 
plantarumstrain_NWAFU1186,Lactobacillus plantarumstrain_BCH930位于相同的进化
分支中。

[0070] 结合形态学、生理生化及16S  rDNA序列分析结果将菌株DMSLP0315和菌株DMSLP1210鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

[0071] 菌株DMSLP0315已于2019年7月8日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)，分
类命名为Lactobacillus plantarum，保藏号为GDMCC No.60716。

[0072] 实施例2培养条件对植物乳杆菌DMSLP0315抑菌活性的影响

[0073] (1)培养时间对目标菌株抑菌活性的影响

[0074] 将筛选出的目标菌株DMSLP0315以1％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养32h，从16h开始每隔两个小时取样，取10mL制备无细胞上清液，以ETEC CVCC 1518为
指示菌测定抑菌活性，确定最适培养时间。培养时间对植物乳杆菌DMSLP0315抑菌活性的影
响见图5。由图5可知，从16‑22h随着培养时间的增加，菌株的抑菌活性逐渐增强，22h时抑菌
活性达到最大，24h‑32h菌株的抑菌活性趋于稳定。16‑32h之间菌株的抑菌活性无明显差异
(P>0.05)。

[0075] (2)培养温度对目标菌株抑菌活性的影响

[0076] 将筛选出的目标菌株DMSLP0315以1％的接种量接种于MRS液体培养基中，分别以28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃恒温培养20h，取10mL制备无细胞上清液，以ETEC CVCC 
1518为指示菌测定抑菌活性，确定最适培养温度。培养时间对植物乳杆菌DMSLP0315抑菌活
性的影响见图6。由图6可以看出培养温度为30℃时，菌株的抑菌活性最高，30‑38℃时菌株
的抑菌活性随培养温度的增加呈逐渐下降趋势。不同培养温度下菌株的抑菌活性差异不显
著(P>0.05)。

[0077] 实施例3植物乳杆菌DMSLP0315的安全性评价

[0078] 1、溶血性试验

[0079] 以化脓性链球菌作为对照，对进行溶血性试验。化脓性链球菌接种于哥伦比亚血琼脂平板培养后菌落周围出现透明的溶血圈，是乙型溶血(β溶血)；植物乳杆菌DMSLP0315、
和植物乳杆菌DMSLP1210接种于哥伦比亚血琼脂平板培养后，观察菌落周围均未出现溶血
圈，因此可以判断两株菌均没有溶血性，不会产生溶血性危害。

[0080] 2、对抗生素的敏感性

[0081] 根据美国临床和实验标准协会CLSI的评价标准，得到两株菌对7种常用抗生素的敏感性结果(表2)，从表中可以看出植物乳杆菌DMSLP0315和植物乳杆菌DMSLP1210均对链
霉素和万古霉素具有抗性，对四环素和氨苄青霉素敏感。其中，植物乳杆菌DMSLP0315和植
物乳杆菌DMSLP1210对庆大霉素还具有抗性，对氯霉素和红霉素敏感。

[0082] 表2四株乳酸菌对抗生素的敏感性

[0083]

[0084]

[0085] 注：“R”代表耐药；“I”代表中介；“S”代表敏感。

[0086] 实施例4植物乳杆菌DMSLP0315所产细菌素的抗逆性检测

[0087] 1、细菌素对温度的敏感性

[0088] 无细胞发酵上清液分别在60℃、80℃、100℃和121℃保持10min和30min，用冰冷却后做抑菌试验,以确定温度对细菌素抑菌活性的影响。

[0089] 温度对植物乳杆菌DMSLP0315发酵液中细菌素的影响如图7所示，从图中可知DMSLP0315所产细菌素的抑菌活性随加热温度的升高及加热时间的延长呈下降趋势，加热
温度显著影响细菌素的抑菌活性(p<0.05)，加热10min和30min对细菌素的抑菌活性影响不
显著(p>0.05)；植物乳杆菌DMSLP0315所产的细菌素经121℃、30min热处理后抑菌活性均保
留90％以上，具有耐高温的特性。

[0090] 2、细菌素对pH的敏感性

[0091] 无细胞发酵上清液，用3mol/L HCL、NaOH调pH值2‑10,37℃下温育2h后做抑菌实验,以确定pH对细菌素抑菌活性的影响。

[0092] pH对植物乳杆菌DMSLP0315发酵液中细菌素的影响如图8所示，从图中可知该菌所产的细菌素在pH 2‑10范围内均具有抑菌活性，随pH逐渐升高抑菌活性呈下降趋势，但均保
留80％以上，表现出良好的酸碱耐受性；该菌所产的细菌素在pH 2‑4之间抑菌活性差异不
显著(p>0.05)，表现出较好的酸稳定性；细菌素在pH 2‑4范围内抑菌活性明显高于pH 8‑10
时的抑菌活性，在pH为2时细菌素的抑菌活性达到最高，说明该菌所产细菌素在酸性环境下
作用效果最佳，碱性环境下抑菌活性下降。

[0093] 3、细菌素对酶的敏感性

[0094] 无细胞发酵上清液，用HCL、NaOH调pH值到胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、过氧化氢酶的最适作用pH值。37℃水溶液2h后进行抑菌试验，以确定酶对细菌素抑菌活性的影响。

[0095] 酶处理对植物乳杆菌DMSLP0315发酵液中细菌素的影响如图9所示，从图中可知植物乳杆菌DMSLP0315所产细菌素用过氧化氢酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶处理后抑菌
活性均保留90％以上，对四种酶的作用均不敏感。

[0096] 实施例5菌株复配共培养对细菌素合成量的影响

[0097] 综合植物乳杆菌DMSLP0315和植物乳杆菌DMSLP1210所产细菌素的生物学特性结果，选择特性良好的植物乳杆菌DMSLP0315、植物乳杆菌H7‑6(本发明中的临床分离株，经鉴
定为植物乳杆菌)和植物乳杆菌DMSLP1210均按照接种活菌数1:1进行复配共培养后，测定
代谢产物的抑菌活性(图10)。由图可知，植物乳杆菌DMSLP0315+DMSLP1210复配后，随培养
时间的增加抑菌活性呈逐渐增大再趋于平稳的趋势，在培养22h时抑菌活性最高，细菌素合
成量最大，因此，确定植物乳杆菌DMSLP0315和植物乳杆菌DMSLP1210复配是最佳复配方式。

[0098] 植物乳杆菌DMSLP0315和植物乳杆菌DMSLP1210共培养(接种量1:1)后的抑菌活性见图11。由图可知：与对照组(植物乳杆菌DMSLP0315纯培养、植物乳杆菌DMSLP1210纯培养、
分别纯培养的等比上清液)相比，植物乳杆菌DMSLP0315和植物乳杆菌DMSLP1210共培养后
细菌素的抑菌活性显著增加(p<0.05)，具有增效作用。

[0099] 以植物乳杆菌DMSLP0315和植物乳杆菌DMSLP1210为复配菌种，获得用于复配菌种发酵产细菌素的廉价天然培养基，成分为4％玉米浆粉、2％酵母提取物和2％葡萄糖；上述
培养基的最优发酵条件为发酵温度32℃、发酵pH5.5、接种量2％，以最佳工艺参数发酵22h
后，按照如下条件进行喷雾干燥：物料浓度30％，进风温度为160℃，出风温度为80℃，制备
的乳酸菌素为褐黄色粉末，细菌素效价达到2394.76AU/g。

[0100] 实施例6植物乳杆菌DMSLP0315和DMSLP1210等比共培养发酵物最小抑菌浓度的确定

[0101] 1、发酵规模：10L发酵罐

[0102] 2、培养基：玉米浆粉培养基，配制如下：4％玉米浆粉，2％酵母提取物，2％葡萄糖，2％吐温80。

[0103] 3、发酵条件：2％接种量接种菌株DMSLP0315和菌株DMSLP1210(有效活菌数1∶1)，发酵温度为32℃、发酵pH分别为恒pH 5.5发酵、不调节pH发酵，发酵时间22h。

[0104] 4、冷冻干燥条件：用真空冷冻干燥机冻干，条件如下：发酵产物于－20℃冰箱预冻12h后，于－60℃冷冻干燥24h。

[0105] 5、细菌素效价的测定方法

[0106] 参照实施例1的公式计算细菌素效价。

[0107] 6、结果

[0108] (1)恒pH 5.5发酵

[0109] 按上述条件，维持恒pH 5.5发酵，采用氢氧化钠调节pH，测得最终冷冻干燥后发酵物的抑菌活性达到2394.76AU/g，乳酸含量为19.368mg/g，以无菌水稀释后的抑菌活性，发
现制得的干燥发酵物在稀释11倍时，抑菌活性为1836.25AU/mL，稀释至21倍时，没有出现明
显的抑菌圈。将发酵终产物的pH调至6.5后再进行冷冻干燥，发现抑菌活性达到2265.80AU/
g，可检测到明显抑菌圈的干燥产物的稀释倍数同样为11倍(图12)，此时测得的乳酸含量为
12.845mg/g。

[0110] (2)非恒pH的自然发酵

[0111] 按上述条件，采用非恒pH发酵，测得最终冷冻干燥后发酵物的抑菌活性达到3538.67AU/g，乳酸含量为46.364mg/g，以无菌水稀释后的抑菌活性见图13，发现制得的干
燥发酵物在稀释51倍时抑菌活性为1359.18AU/mL，再增大稀释倍数后，没有出现明显的抑
菌圈。将发酵终产物的pH调至6.5后再进行喷雾干燥，发现可检测到明显抑菌圈的干燥产物
的稀释倍数为11倍，测得的干燥物中乳酸含量为：11.485mg/g。

[0112] 根据上述结果，建议采用非恒pH发酵，22小时后结束发酵，干燥后的产物经51倍稀释后仍可获得明显的抑菌圈，此时乳酸含量为46.364mg/g。

[0113] 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见
的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的
范围。