一种2019新型冠状病毒抗原检测试剂及其制备方法转让专利
申请号 : CN202010396002.2
文献号 : CN111521805B
文献日 : 2021-09-14
发明人 : 刘光中 , 姚世平 , 高鲁嘉 , 关苗
申请人 : 北京倍肯恒业科技发展股份有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种制备2019新型冠状病毒抗原检测试剂的方法,所述检测试剂包括:样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫;所述方法包括以下步骤:(1)玻璃纤维膜预处理;(2)时间分辨微球标记;
(3)硝酸纤维素膜的包被;(4)微球的喷涂;和(5)试纸条组装;
所述硝酸纤维膜通过以下方法制得:
(1)将NC聚合物溶于甲基丙烯酸甲酯和异丙醇溶剂中,当硝酸纤维素完全溶解后,加入季戊四醇和水,搅拌均匀,得到铸膜所用的溶液;其中,在铸膜所用的溶液中,含有60‑
85wt%甲基丙烯酸甲酯,5‑10wt%异丙醇,1‑3wt%季戊四醇和1‑2wt%的水;
(2)使用铸膜机进行铸膜,然后烘干;
(3)取下得到的膜,并裁成25mm×300mm的膜条,然后将膜条置于绝热室内的拉伸平台上夹紧,在绝热室中将膜加热到50℃,达到预定温度后将膜单轴拉伸11%,拉伸速度为
0.03mm/s,然后保持20分钟,再降温至室温,降温速度为0.1℃/min;
(4)通过静电纺丝在步骤(3)得到的膜的表面施加聚乳酸和聚己内酯的纳米纤维层,静电纺丝设备的工艺条件为:电池8kV,针与硝酸纤维膜的距离即接收距离为12cm进行静电纺丝,同时保持进料速度恒定在6ml/h,纺丝时间为180s,所述纳米纤维层的平均厚度为
312nm,所述膜的表面施加有聚乳酸和聚己内酯的纳米纤维层的部分以面积比例计占整个膜表面的8%。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述NC膜包被有T线鼠抗人单克隆抗体1和C线抗鼠抗人单克隆抗体。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中结合垫包被有鼠抗人抗体2‑时间分辨微球偶联结合物。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述玻璃纤维膜为经过预处理的玻璃纤维膜,其预处理方法包括:将玻璃纤维膜浸润于预处理液中30min,取出后室温晾干,即得经过预处理的玻璃纤维膜。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述玻璃纤维膜预处理液包含50mM硼酸盐缓冲液+
2‑10%蔗糖+0.1‑0.5%TW20+0.1‑5%BSA。
6.根据权利要求5所述的方法,其中微球的喷涂使用喷膜仪进行。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其中将样品垫、结合垫、NC膜和吸收垫依次粘贴于PS底板上。
说明书 :
一种2019新型冠状病毒抗原检测试剂及其制备方法
技术领域
测的试剂及其制备方法。
背景技术
剂瓶或管的包装盒。
括:如SEQ ID NO.1所示的正向引物;和,如SEQ ID NO.2所示的反向引物,所述内标引物对
包括:/n如SEQ ID NO.4所示的正向引物;和,如SEQ ID NO.5所示的反向引物;/n所述探针
组包括:/n核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针,和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示
的内控探针。
针,反向转录酶,DNA聚合酶,T7RNA聚合酶,以及缓冲液。
所示的内侧正向引物FIP和内侧反向引物BIP。
入经包被的固相支持物上,在适合形成抗原抗体免疫结合复合物的条件下孵育;(3)适度清
洗去除任何未结合的SARS冠状病毒抗体;(4)加入经标记的针对人抗体的第二抗体,在适合
形成抗原抗体免疫复合物的条件下孵育;(5)适度清洗去除任何未结合的第二抗体;(6)定
量检测孵育混合物中抗原抗体免疫结合复合物的存在。
学偶联了作为抗原的SARS冠状病毒S,N,M或E蛋白。该免疫微球可以作为检测试剂检测抗
SARS抗体。
反应酶系、DEPC H2O以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
括:如SEQ ID NO.1所示的正向引物;和,如SEQ ID NO.2所示的反向引物,所述内标引物对
包括:如SEQ ID NO.4所示的正向引物;和,如SEQ ID NO.5所示的反向引物;所述探针组包
括:核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针,和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内控
探针。
分析,以供实验室参考。方法收集该院1例弱阳性患者不同时间点采集的咽拭子标本,选取6
种国产试剂(A‑F试剂)平行检测,进行RNA提取和扩增,根据各试剂检测结果比较其性能。
作。而抗体检测不能单独作为诊断指标用于筛查,只能作为当核酸检测为阴性时的辅助诊
断方法。在FDA的SARS‑COV‑2检测指导中明确指出,抗体检测不能单独用于新冠病毒诊断,
不能排除感染或说明感染状态。因此,本领域需要一种同时具备采样速度快速、过程操作简
便、特异性强且灵敏度稳定等优点的检测试剂及其制备方法。基于此,本申请人开发了一种
2019新型冠状病毒抗原(免疫荧光)检测试剂。
发明内容
型冠状病毒抗原(免疫荧光)检测试剂利用双抗体夹心原理及高灵敏度的时间分辨荧光微
球示踪物。实现对疑似新型冠状病毒感染患者的鼻咽拭子、口咽拭子、或痰液中的新冠病毒
核壳蛋白(nucleocapsid protein,或称N蛋白)的快速定性检测。
为时间分辨荧光微球(Time Resolved Fluorescent Microsphere,TRFM)。其具有荧光强度
高寿命长、共价结合稳定等特点,结合特定光源设备即可实现目测判读,较同样可目测判读
的胶体金方法灵敏度高1‑3个数量级,更适用于对敏感度要求高的新型冠状病毒检测。该检
测试剂主要应用于疑似新型冠状病毒感染患者的鼻咽拭子、口咽拭子、或痰液中的新冠病
毒核壳蛋白的快速定性检测。该产品操作简便,检测时间短,灵敏度高,非常适合基层医疗
机构及疫情集中爆发区的大范围初筛。
物。当待检样本中含有抗原N蛋白时,抗原N蛋白首先与结合垫位置包被的标记有时间分辨
微球的鼠抗人单克隆抗体2结合,形成N蛋白‑鼠抗人单克隆抗体2结合物,后与T线位置包被
的鼠抗人单克隆抗体1捕获结合,剩余标记有时间分辨微球的鼠抗人单克隆抗体2继续层
析,与C线位置的抗鼠抗人抗体结合。利用365nm波长紫外光照射,T线位置显示时间分辨微
球特有的红色荧光型号,即为阳性,C线位置始终显色。
(5)试纸条组装。
因此在溶液配制前将其室温放置30min,再称量相应重量使用);2.2取50‑200uL时间分辨微
球溶于600‑1000ul标记缓冲液中,加入上述配制的EDC溶液5‑10uL,混匀;再加入10‑20uL的
Sulfo‑NHS溶液,混匀;对微球进行活化;将该反应溶液放置在摇床上,室温下反应10‑
60min;2.3将活化后的微球用标记缓冲液离心清洗三次,并超声溶解于1ml标记缓冲液中;
2.4向超声溶解后的微球中加入0.05‑0.5mg鼠抗人单克隆抗体2,放置在摇床上,室温下反
应1‑3小时;2.5向反应后的微球‑抗体溶液中加入50‑200ul微球封闭液进行封闭,放置在摇
床上,室温下继反应0.5‑2小时;和2.6使用微球储存液将封闭后的微球‑抗体溶液离心清洗
三次,充分超声溶解于1‑5ml微球储存液中,4℃放置备用。
夜干燥,备用。
位置始终显色。
物,后与T线位置包被的鼠抗人单克隆抗体1捕获结合,剩余标记有时间分辨微球的鼠抗人
单克隆抗体2继续层析,与C线位置的抗鼠抗人抗体结合。
均匀,得到铸膜所用的溶液;(2)使用铸膜机进行铸膜,然后烘干;(3)取下得到的膜,并裁成
所需尺寸的膜条,然后将膜条置于绝热室内的拉伸平台上夹紧,在绝热室中将膜加热到40‑
70℃,达到预定温度后将膜拉伸8‑15%,然后保持10‑30分钟,再降温至室温;(4)通过静电
纺丝在步骤(3)得到的膜的表面施加聚乳酸和聚己内酯的纳米纤维层。
剂。
度偏高,特别是当接近接近膜收缩点时,会导致膜发生不均匀收缩转变。
入季戊四醇和和水,搅拌均匀,得到铸膜所用的溶液;(2)使用铸膜机(JK‑TMJ‑200A,深圳市
晶科诺尔公司)进行铸膜,然后烘干;(3)取下得到的膜,并裁成25mm×300mm的膜条,然后将
膜条置于绝热室内的拉伸平台上夹紧,在绝热室中将膜加热到50℃,达到预定温度后将膜
单轴拉伸11%,拉伸速度为为0.03mm/s,然后保持20分钟,再降温至室温,降温速度为0.1
℃/min。;(4)通过静电纺丝在步骤(3)得到的膜的表面施加聚乳酸和聚己内酯的纳米纤维
层,静电纺丝设备(北京新锐佰纳科技有限公司)的工艺条件为:电池8kV,针与硝酸纤维膜
的距离即接收距离为12cm进行静电纺丝,同时保持进料速度恒定在6ml/h,纺丝时间为
180s。述纳米纤维层的平均厚度为312nm,所述膜的表面施加有聚乳酸和聚己内酯的纳米纤
维层的部分占整个膜表面的8%(以面积比例计)。
由于拉伸作用,膜样品的孔结构和孔隙率发生明显变化。对于侧向流动中的膜性能,增加膜
拉伸伸长率可加快侧向芯吸时间。合适的拉伸速率,可以提高蛋白质如N蛋白结合力,同时
减少横向迁移时间以进行快速检测。
使得可以在快速诊断试剂盒的生产中保持高的膜蛋白结合力。
中实现长的流动延迟(例如5‑20s)。这种延迟的流动增加了N蛋白与偶联物之间的相互作用
速率,从而提高了检测灵敏度。与未涂层的NC膜相比,静电纺丝施涂的NC膜的灵敏度与未经
涂覆的NC膜相比,灵敏度可以提高2‑4倍。此外,本发明的精度纺丝层不明显影响流体流动。
是当使用根据上述方法制得的硝酸纤维素膜时,能够使本发明的试纸条具有更进一步提高
的侧向芯吸吸收、蛋白结合能力和灵敏度,即能够获得进一步提高益处。
的的特异性抗体结合,通过配套光源,对检测线荧光强度进行目测观察定性检测样本中待
测物的方法。检测过程操作简单,不依赖于设备判读,较同样目测判读的胶体金产品拥有更
高的灵敏度,15‑20分钟即可获得结果,非常适合基层医疗机构及疫情集中爆发区的大范围
初筛。
定的环境及技术人员,实现15‑20分钟快速获得检测结果,结合配套的光源即可实现快速的
目测判读,较同样目测判读的胶体金产品拥有更高的灵敏度,可很好的应用于大范围快速
初筛;(3)更高的产品特异性:采用高亲和力特异性单克隆抗体标记时间分辨微球,识别结
合靶点抗原的不同表位,降低非特异性交叉反应的几率,同时避免了血液样本中内源性及
外源性干扰物质引起非特异性结合,很大程度上提高了产品的特异性。3.灵敏度稳定:本发
明方法的抗原检测试剂检测目标物为新冠病毒壳蛋白,灵敏度可达50ng/ml,该蛋白经过简
单的病毒裂解操作获得,受前处理操作影响极小,且结构及存在状态稳定,故该检测试剂具
有稳定的检测灵敏度;(4)抗原检测可作为出院病例核酸检测及抗体检测的再次确诊方法,
避免假阴性患者出院造成新的传播风险。
高,更适用于对敏感度要求高的新型冠状病毒检测。并且新的纤维素的使用,能够更进一步
提高其性能。
附图说明
具体实施方案
摇床上,室温下反应30min。
测结果,结合配套的光源(365nm波长紫外光)即可实现快速的目测判读,较同样目测判读的
胶体金产品拥有更高的灵敏度,其中较同样可目测判读的胶体金方法灵敏度高约2个数量
级,并且经测试灵敏度可达50ng/ml,能够应用于大范围快速初筛。
表明本发明的检测试剂具有更加优越的性能。
术人员想到的其它实例。如果这种其它实例具有不异于权利要求书的字面语言的结构元
素,或者如果这种其它实例包括与权利要求书的字面语言无实质性差异的等效结构元素,
则这种其它实例意图处于权利要求书的范围之内。在不会造成不一致的程度下,通过参考
将本文中参考的所有引用之处并入本文中。