乌司他丁在制备抗鼻咽癌转移药物中的应用

摘要

本发明属于医药技术领域，具体涉及乌司他丁在制备抗鼻咽癌转移药物中的应用。本发明提供的乌司他丁在制备抗鼻咽癌转移药物中的应用，经经细胞体外试验发现，乌司他丁能够抑制鼻咽癌细胞的转移，且乌司他丁不抑制鼻咽癌细胞的增长，毒性小，更有利于鼻咽癌患者的康复。

权利要求

1.乌司他丁在制备抗鼻咽癌转移药物中的应用，其特征在于，所述药物包括乌司他丁和医学上可接受的添加剂。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物的制剂类型为注射液或冻干粉针剂。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述注射液可接受的添加剂选自注射用水、甘露醇、氯化钠和葡萄糖中的至少一种；所述冻干粉针剂可接受的添加剂选自甘露醇、乳糖、水解明胶、氯化钠和葡萄糖中的至少一种。

4.一种抗鼻咽癌转移的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括乌司他丁、盐酸水苏碱和右旋糖苷，所述乌司他丁、盐酸水苏碱和右旋糖苷的质量比为1：(1～5)：(1～

2.5)，U：mg：mg。

5.根据权利要求4所述药物组合物，其特征在于，所述乌司他丁、盐酸水苏碱和右旋糖苷的质量比为1：2.5：1，U：mg：mg。

6.根据权利要求4所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的制剂类型为注射液或冻干粉针剂。

7.根据权利要求6所述药物组合物，其特征在于，所述注射液或冻干粉针剂配以药学可接受的添加剂。

8.根据权利要求7所述药物组合物，其特征在于，所述注射液可接受的添加剂选自注射用水、甘露醇、氯化钠和葡萄糖中的至少一种；所述冻干粉针剂可接受的添加剂选自甘露醇、乳糖、水解明胶、氯化钠和葡萄糖中的至少一种。

说明书

乌司他丁在制备抗鼻咽癌转移药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及乌司他丁在制备抗鼻咽癌转移药物中的应用。

背景技术

[0002] 乌司他丁(Ulinastatin，UTI)分离纯化自健康成年男性的新鲜尿液。它是由143个氨基酸组成的一种糖蛋白，是一种广谱蛋白酶抑制剂。实验研究发现其具有抑制纤溶酶、玻璃酸酶、粒细胞弹性蛋白酶、α糜蛋白酶、胰蛋白酶等等多种酶活性的功能。乌司他丁主要由肝脏负责合成，经过肾脏进行代谢，之后随尿液排出体外，其经过分解的小分子成分也具有较强的抑制水解酶的活性。乌司他丁除了可以抑制胰蛋白酶，还可以抑制多种胰酶活性，所以对急性胰腺炎，慢性性胰腺炎的急性恶化期具有很好的治疗效果。除此之外，乌司他丁不仅具有抑制酶活性的功能，还拥有抑制溶酶体酶的游离作用、溶酶体膜的稳定化以及对抗心肌抑制因子产生的作用。

[0003] 鼻咽癌发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，是我国高发恶性肿瘤之一，易转移。而肿瘤转移是一个多步骤，多细胞，多分子参与的复杂过程，涉及包括上皮间质转化，肿瘤外渗，肿瘤细胞循环系统游走，肿瘤內渗，形成微小转移灶等步骤。在肿瘤外渗，肿瘤內渗过程中都涉及肿瘤细胞分泌多种酶，突破基底膜的限制。目前，对于鼻咽癌的转移，现有技术尚未有明确有效的方法用于治疗。

发明内容

[0004] 本发明第一个目的是提供乌司他丁的新用途，第二个目的是提供一种抗鼻咽癌转移药物组合物。

[0005] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0006] 一种抗鼻咽癌转移药物的药物，所述药物包括乌司他丁和医学上可接受的添加剂。

[0007] 在本发明中，通过Transwell细胞迁移实验、Transwell细胞侵袭实验和细胞划痕实验证明了乌司他丁能够抑制鼻咽癌细胞S18和鼻咽癌细胞5-8F的空间迁移，结合实验“乌司他丁对小鼠肿瘤足底淋巴结转移的影响”进一步证明乌司他丁能够抑制鼻咽癌细胞的转移。同时，还通过实验“司他丁对小鼠肿瘤增殖的影响”和实验“CCK8测定乌司他丁对肿瘤细胞生长的影响”得知乌司他丁不抑制肿瘤细胞的增长。

[0008] 进一步地，所述药物的制剂类型为注射液或冻干粉针剂。

[0009] 进一步地，所述注射液可接受的添加剂选自注射用水、甘露醇、氯化钠和葡萄糖中的至少一种；所述冻干粉针剂可接受的添加剂选自甘露醇、乳糖、水解明胶、氯化钠和葡萄糖中的至少一种。

[0010] 一种抗鼻咽癌转移的药物组合物，所述药物组合物包括乌司他丁、盐酸水苏碱和右旋糖苷，所述乌司他丁、盐酸水苏碱和右旋糖苷的质量比为1：(1～5)：(1～2.5)，U：mg：mg。

[0011] 进一步地，本发明通过实验“抗鼻咽癌转移药物组合物对小鼠肿瘤足底淋巴结转移的影响”后发现，相对于对比1组、对比2组和对比3组，乌司他丁与盐酸水苏碱和右旋糖苷按照特定比例组合的试验组显著提高对鼻咽癌肿瘤转移的抑制作用。盐酸水苏碱作为一种生物碱，具有改善微循环的作用，推测其与右旋糖苷、乌司他丁共同作用后能够促进小鼠对乌司他丁的吸收，从而使乌司他丁的抑制作用增强。

[0012] 进一步地，所述乌司他丁、盐酸水苏碱和右旋糖苷的质量比为1：2.5：1，U：mg：mg。

[0013] 进一步地，所述药物组合物的制剂类型为注射液或冻干粉针剂。

[0014] 进一步地，所述注射液或冻干粉针剂配以药学可接受的添加剂。

[0015] 进一步地，所述注射液可接受的添加剂选自注射用水、甘露醇、氯化钠和葡萄糖中的至少一种；所述冻干粉针剂可接受的添加剂选自甘露醇、乳糖、水解明胶、氯化钠和葡萄糖中的至少一种。

[0016] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0017] 本发明乌司他丁能够抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭，且乌司他丁不抑制鼻咽癌细胞的增长。乌司他丁与盐酸水苏碱和右旋糖苷按照特定比例组合后，相对于单独使用的乌司他丁，抑制作用强，毒性低，更为安全。

附图说明

[0018] 图1为本发明不同浓度乌司他丁对鼻咽癌S18细胞迁移能力的影响。

[0019] 图2为本发明乌司他丁抑制鼻咽癌细胞S18迁移和侵袭的影响。

[0020] 图3为本发明不同浓度乌司他丁对鼻咽癌5-8F细胞迁移能力的影响。

[0021] 图4为本发明乌司他丁抑制鼻咽癌细胞5-8F迁移和侵袭的影响。

[0022] 图5为本发明乌司他丁抑制鼻咽癌细胞S18和鼻咽癌细胞5-8F的划痕愈合影响。

[0023] 图6为本发明乌司他丁对肿瘤细胞增殖的影响。

[0024] 图7为本发明乌司他丁组和安慰剂组的小鼠活体成像。

[0025] 图8为本发明乌司他丁组和安慰剂组的小鼠腘窝淋巴结活体成像。

[0026] 图9为本发明乌司他丁组和安慰剂组的小鼠足底淋巴结转移数量柱状图。

[0027] 图10为本发明乌司他丁组和安慰剂组的小鼠体重变化线状图。

[0028] 图11为本发明乌司他丁对裸鼠皮下肿瘤生长的影响。

具体实施方式

[0029] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

[0030] 实施例1、一种抗鼻咽癌转移药物制剂

[0031] 取过滤灭菌后的乌司他丁1000U、甘露醇10g加入到适量的注射用水中溶解，调节pH为6.8，再加注射用水至1000ml，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装于1000个西林瓶中，无菌条件下冷冻干燥，即得。

[0032] 实施例2、一种抗鼻咽癌转移药物制剂

[0033] 取过滤灭菌后的乌司他丁2000U、盐酸水苏碱7g、右旋糖苷2.8g、甘露醇10g加入到适量的注射用水中溶解，调节pH为7.1，再加注射用水至1000ml，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装于1000个西林瓶中，无菌条件下冷冻干燥，即得。

[0034] 实施例3、一种抗鼻咽癌转移药物制剂

[0035] 取过滤灭菌后的乌司他丁5000U、盐酸水苏碱17.5g、右旋糖苷7g、甘露醇5g加入到适量的注射用水中溶解，调节pH为6.9，再加注射用水至1000ml，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装于1000个西林瓶中，即得。

[0036] 对比例1、一种抗鼻咽癌转移药物制剂

[0037] 取过滤灭菌后的乌司他丁5000U、甘露醇5g加入到适量的注射用水中溶解，调节pH为6.9，再加注射用水至1000ml，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装于1000个西林瓶中，即得。

[0038] 对比例2、一种抗鼻咽癌转移药物制剂

[0039] 取过滤灭菌后的乌司他丁5000U、盐酸水苏碱17.5g、甘露醇5g加入到适量的注射用水中溶解，调节pH为6.9，再加注射用水至1000ml，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装于1000个西林瓶中，即得。

[0040] 对比例3、一种抗鼻咽癌转移药物制剂

[0041] 取过滤灭菌后的乌司他丁5000U、右旋糖苷7g、甘露醇5g加入到适量的注射用水中溶解，调节pH为6.9，再加注射用水至1000ml，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装于1000个西林瓶中，即得。

[0042] 实验一、乌司他丁抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的实验

[0043] (1)Transwell细胞迁移实验

[0044] 实验方法：

[0045] 细胞准备：提前一天种板，接种在一个10cm皿/25cm2培养瓶，密度视需要的细胞量而定。

[0046] 细胞接种：对于S18、5-8F及对应处理的细胞，加入2×104个细胞，对于H1299及相应处理的细胞，加入1×104个细胞(于200μL无血清DMEM)于24孔板中迁移侵袭小室，加入终浓度为0.1％BSA与相应浓度药物。小室下槽加入0.8mL含有10％FBS的DMEM。

[0047] 染色观察。细胞于常规细胞培养条件中培养24h。之后将Transwell小室取出，弃掉孔中的培养液，用蘸有1×PBS的棉签轻柔地擦净上室内的细胞，用1ml PBS洗1遍，800-1000ul/孔甲醇加入至下室固定30分钟，将小室风干，之后用1％结晶紫室温染色30min，用自来水清洗后室温晾干。

[0048] 光学显微镜下(40X)随机选取5个视野计算迁移细胞数。

[0049] (2)Transwell细胞侵袭实验

[0050] 实验方法：用4℃的无血清细胞培养基DMEM稀释预冷的Matrigel至250μg/ml。取100μl稀释胶缓慢滴加到24-well transwell上室中，在培养箱中培养1小时。水化基底膜，倾斜小室，吸出未结合的试剂，用37℃的无血清培养基轻轻地洗涤凝胶，请确保移液器的吸头不要刮擦基底膜的表面。细胞接种，接种相应细胞于200μL无血清DMEM于24孔小室，加入终浓度为0.1％BSA与相应浓度药物。小室下槽加入0.8mL含有10％FBS的DMEM。染色观察，细胞于常规细胞培养条件中培养24h后取出Transwell小室，弃掉孔中的培养基，用含有1×PBS的棉签轻柔地擦净上室内的细胞，用1ml PBS洗1遍，800-1000ul/孔甲醇加入至下室固定30分钟，适当风干虎，使用1％结晶紫室温染色30min，用自来水清洗后室温晾干。光学显微镜下(40X)随机选取5个视野计算侵袭细胞数。

[0051] (3)细胞划痕实验

[0052] 实验方法：六孔板种板，每孔2ml,不同细胞种板浓度不同，以S18为例，每孔加入5×105个细胞，设置2-3个复孔，培养约24h。细胞数量以过夜贴壁能铺满70％-80％以上为宜，适当调整。打开孔板盖子，吸掉旧培养基，用200ul枪头紧贴直尺均匀移动制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。用无菌1×PBS冲洗细胞1次，去除划下的细胞后，再加入含血清的培养基。放入37℃5％CO2培养箱。光学显微镜下0，6，24小时取样拍照。

[0053] 实验结果：见图1～5。具体地，从图1可以看出，乌司他丁在400U/ml、800U/ml和1600U/ml下可以显著抑制鼻咽癌细胞S18的体外迁移，且呈现了量效关系。为了进一步验证乌司他丁对鼻咽癌细胞S18迁移和侵袭的作用，因而选择800U/ml和1600U/ml两个浓度来进行Transwell细胞侵袭实验，从图3可以看出，乌司他丁可以剂量依赖性显著抑制鼻咽癌细胞S18的迁移和侵袭。同时，为了确定乌司他丁对其他鼻咽癌细胞是否具有相同的作用，而从图2可以看出，乌司他丁作用于鼻咽癌细胞5-8F后，虽然具有抑制作用，但是没有显著性差异，而将乌司他丁的给药浓度加大到3200U/ml和6400U/ml后，乌司他丁能够显著抑制鼻咽癌细胞5-8F的迁移和侵扰。从图5可以看出，细胞划痕实验验证了乌司他丁可以显著抑制鼻咽癌细胞S18和鼻咽癌细胞5-8F的迁移。

[0054] 实验二、CCK8测定乌司他丁对肿瘤细胞生长的影响

[0055] 实验方法：接种细胞并生长4–24小时，然后开始检测。一般地，103-106个细胞足够一次检测。在细胞培养液中直接加入1/10体积的CCK-8，充分混合，保证孔中蓝色均一性，但避免气泡产生。对96孔板，每100μl培养液加入10μl活性检测试剂。于37℃培养箱中培养0.5-4小时至颜色变为橙色。应避免过夜培养。用酶标仪测量在450nm处的吸收光。一般的OD值在0.5-2.5之间。

[0056] 实验结果：从图6可以发现乌司他丁对肿瘤细胞的增殖几乎没有影响。

[0057] 实验三、乌司他丁对小鼠肿瘤增殖的影响

[0058] 实验方法：

[0059] 裸鼠饲养：从广东省医学实验动物中心订购3-4周龄，体重14-16g裸鼠，于SPF饲养室适应性饲养1周。

[0060] 取生长状态良好的处于对数生长期的鼻咽癌细胞S18-1C3，消化，计数，用1×PBS稀释成1×107个/mL(75％酒精消毒小鼠腋窝处中部外侧皮下)。将100μL细胞悬浮，即1×106个细胞注射至裸鼠的腋窝处中部外侧皮下。

[0061] 细胞注射后7天后，根据肿瘤大小和体重将小鼠均分为安慰剂组和UTI处理组。

[0062] UTI给药组小鼠按照20,000U/只/天进行腹腔给药，安慰剂组给予相同体积安慰剂。连续给药至28天。终止实验且对动物施行安乐死。实验期间每3天测量一次小鼠体重，采用游标卡尺测量肿瘤长径L和短径W，按公式V＝Length×Width2×0.52，计算肿瘤大小，并绘制生长曲线。

[0063] 实验结果：从图7可以看出，乌司他丁组与安慰剂组相比，对肿瘤的快速增殖没有显著性影响，乌司他丁组和安慰剂组相比，肿瘤的大小，体积和肿瘤均无显著性差别，同时不同给药组的小鼠体重亦无显著差异。

[0064] 实验四、乌司他丁对小鼠肿瘤足底淋巴结转移的影响

[0065] 实验方法：

[0066] 裸鼠饲养：从广东省医学实验动物中心订购3-4周龄，体重14-16g裸鼠，于SPF饲养室适应性饲养1周。

[0067] 将S18-1C3癌细胞在于含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基中，在含5％CO2的37℃的细胞培养箱中进行培养；细胞生长至对数生长期(70％-80％铺培养皿)时，加入0.25％胰蛋白酶进行消化，收集5×106个细胞，1000r/min离心5min，弃去上清液，用基础血清培养基清洗细胞，1000r/min离心再次离心5min，加入无菌1×PBS将细胞混匀调成单细胞悬液，总体积至1.0ml；

[0068] 取生长状态良好的处于对数生长期的癌细胞计数，用1×PBS稀释成5×106个/mL(75％酒精消毒小鼠足垫)。将20μL细胞悬浮，即1×105个细胞注射至小鼠的左后足底。正常对照组使用20μL 1×PBS注射至裸鼠的左后足底。

[0069] 细胞注射后10天后，根据体重将小鼠均分为安慰剂组和UTI处理组。

[0070] UTI给药组小鼠按照20,000U/只/天进行腹腔给药，安慰剂组给予相同体积安慰剂。连续给药至48天。

[0071] 给药期间，每7天进行小鼠活体成像实验。小鼠腹腔注射1％异戊巴比妥钠麻醉(7ul/g)，随后腹腔注射D-荧光素(钾盐)浓度5ul/g。注射入体内10-20min(待光信号达到最强稳定平台期)之后使用B检测荧光素酶信号。

[0072] 接种裸鼠49天后，处死裸鼠，摘取左后腘窝淋巴结。同时摘取右后腘窝淋巴结作为对照。称重记录，并立刻置于已经装有Trizol和研磨钢珠的研磨管中进行研磨。

[0073] 使用Trizol法提取淋巴结RNA。进行RNA纯度检测与电泳检测。

[0074] 逆转录及Real-time PCR：取1μg RNA进行逆转录，并取10ng RNA当量的cDNA进行Real-time PCR检测，检测Luciferase基因的表达量。并以右后足腘窝淋巴结RNA为阴性对照。以能检出人源Luciferase基因的表达(Ct值小于等于38)为转移阳性个体，计算不同组别的转移率。

[0075] 实验结果：小鼠足底淋巴结转移实验中，从图8可以看出，安慰剂组较乌司他丁组肿瘤转移进展明显缓慢。麻醉解剖进行小鼠活体成像，从图9可以发现安慰剂组小鼠的腘窝淋巴结有明显的光信号，即出现明显的淋巴结转移。经提取的淋巴结组织，进行RT-qPCR测定Luciferase的表达量，从图10可以看出，乌司他丁组可以显著性降低小鼠足底淋巴结转移，但从图11来看，乌司他丁组对小鼠体重没有显著影响。

[0076] 实验五、抗鼻咽癌转移药物组合物对小鼠肿瘤足底淋巴结转移的影响[0077] 实验方法：按照实验四方法进行实验，计算不同组别的转移率。

[0078] 各组给药剂量为：

[0079] 试验组：腹腔注射按本发明实施例3制剂2.5ml。

[0080] 对比1组：腹腔注射按本发明对比例1制剂2.5ml。

[0081] 对比2组：腹腔注射按本发明对比例2制剂2.5ml。

[0082] 对比3组：腹腔注射按本发明对比例3制剂2.5ml。

[0083] 实验结果：

[0084]

[0085] 从上表可知，试验组能够更好的抑制S18-1C3癌细胞的转移。

[0086] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。