一种小分子GLP-1R激动剂及其应用

摘要

本发明提供一种小分子GLP‑1R激动剂，其为通式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、酯、前药、溶剂化物和氘代化合物。所述化合物是一种小分子GLP‑1R激动剂，能促进胰岛素分泌，因此可以降低高血糖，另外由于其促进胰岛素分泌具有葡萄糖浓度依赖特性，因此所述化合物还能减少低血糖现象的发生。另外，本发明提供的通式(I)的化合物作为小分子GLP‑1R激动剂可口服给药，能提高患者的用药依从性和用药方便性，具有广阔的临床市场前景。

权利要求

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含化合物S6或其药学上可接受的盐，还包括药剂学上可接受的辅料，所述辅料选自：载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂和润湿剂中的至少一种；

(S6)。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含治疗有效量的化合物S6或其药学上可接受的盐，所述药物组合物适于口服给药。

3.化合物S6或其药学上可接受的盐在制备治疗GLP‑1R受体介导的疾病的药物中的用途；

(S6)。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述GLP‑1R受体介导的疾病为：糖尿病、癫痫、脑缺血性疾病或神经退行性疾病。

5.根据权利要求4所述的用途，所述糖尿病为二型糖尿病。

6.化合物S6或其药学上可接受的盐在制备Kv通道抑制剂中的用途；

(S6)。

7.化合物S6或其药学上可接受的盐在制备治疗与Kv通道相关疾病的药物中的用途，所述与Kv通道相关的疾病为：糖尿病、癫痫、脑缺血性疾病或神经退行性疾病；

(S6)。

说明书

一种小分子GLP‑1R激动剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种GLP‑1R激动剂及其应用。

背景技术

[0002] GLP‑1(7‑36)酰胺作为GLP‑1的主要活性形式，GLP‑1(7‑36)酰胺进入血液循环后，血液和细胞膜上的二肽基肽酶IV(DPP‑IV)迅速将其裂解为无活性的GLP‑1(9‑36)，其半衰
期仅1‑2min，因此不适用于T2DM的长期治疗。进一步的，科学研究已经对GLP‑1的结构进行
相应的改造和修饰，以增加其半衰期进而延长体内生物学效应。然而，目前临床上投入使用
的长效GLP‑1类似物如利拉鲁肽、艾塞那肽等均为多肽，频繁多次注射给药导致患者的依从
性较差，因此小分子GLP‑1R激动剂的开发将从提高患者的依从性、用药方便性以及降低药
物副作用的目的出发，具有广阔的临床市场前景。

[0003] 糖尿病是由于人体胰岛素分泌(相对或绝对)不足或者胰岛素作用障碍导致的以高血糖为特征的慢性疾病。根据国际糖尿病‑联盟(International Diabetes Federation，
IDF)最新颁布的第九版世界糖尿病地图显示，2019年全球约有4.63亿成人(20‑79岁)患糖
尿病，预计到2030年糖尿病患病人数将达到5.78亿。若按照此趋势持续下去，2045年全球将
有7亿糖尿病患者。因此，糖尿病已成为21世纪全球范围内面临的最为严峻的社会健康问题
之一。

[0004] 2型糖尿病(T2DM)是最常见的糖尿病类型，约占全球糖尿病患者总数的90％。迄今为止，临床上用于治疗T2DM的传统药物，如胰岛素、磺酰脲类药物，虽然能够有效降低高血
糖，但将血糖控制在正常范围后，仍能继续发挥降糖作用，这会导致T2DM患者出现低血糖的
风险。因此，迫切需要开发一种新的治疗药物，所述药物不仅能有效降低糖尿病患者的高血
糖，同时还能降低出现低血糖的风险。

[0005] 胰高血糖素样肽‑1(glucagon‑like peptide‑1，GLP‑1)是激素原转化酶PC1/3对胰高血糖素原基因表达产物翻译后切割而成，通过胃肠内分泌L细胞分泌，在葡萄糖和其他
营养物质的摄取后发挥降糖作用。研究报道GLP‑1通过GLP‑1受体(GLP‑1R)以葡萄糖浓度依
赖性的刺激胰岛素分泌，这是GLP‑1相对于其他降糖药物的最大优点。除此之外，GLP‑1还可
增加体内胰岛素合成，促进β细胞增值分化，抑制β细胞凋亡，这些特性可能有助于逆转甚至
预防糖尿病。

发明内容

[0006] 本发明的一个目的是提供一种通式为Ⅰ的化合物，所述化合物为一种小分子GLP‑1R激动剂；本发明的另一个目的是提供一种通式为Ⅰ的化合物在制备治疗糖尿病药物中的
用途。

[0007] 第一方面，本发明提供一种通式为Ⅰ的化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、酯、前药、溶剂化物和氘代化合物，

[0008]

[0009] 其中，A和B独立的选自C、N或O，B与相邻碳原子之间的 表示单键或双键。

[0010] R1、R2独立的选自：‑H、‑OH、‑CF3、卤素、C1‑10直链烷基、C3‑10支链烷基、C3‑8环烷基，或R1、R2与R1和R2之间的碳原子形成C3‑8环烷基、芳香五元环基团或芳香六元环基团。

[0011] R3选自‑H、C1‑5直链烷基、C3‑8环烷基。

[0012] R4、R5独立的选自‑H、‑OH、卤素、‑CN、C1‑5直链/支链烷基、‑N(C0‑10烷基)(C0‑10烷基)、‑OC0‑10烷基、C3‑6环烷基。

[0013] 优选的，所述A为N，B为C、N或O，且当B为O时，B与相邻的碳原子之间是碳氧单键；所述R1、R2独立的选自：‑OH、‑CH3、‑Cl、‑C2H5，或R1、R2与R1和R2之间的碳原子形成芳香六元环基
团；R3选自‑CH3、‑C2H5；R4、R5独立的选自‑H、‑OH、卤素、‑CH3。

[0014] 优选地，所述式(Ⅰ)化合物具有如下立体构型：

[0015]

[0016] 第二方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含通式Ⅰ的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、酯、前药、溶剂化物和氘代化合物，还包括药剂学上可接受
的辅料，所述辅料选自：载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂。

[0017] 优选的，所述药物组合物包含治疗有效量的通式Ⅰ的化合物。

[0018] 所述药物组合物适于胃肠给药或非胃肠给药，但本发明提供的GLP‑1R激动剂为小分子化合物，可以通过口服给药的方式，体现出相对于大分子多肽类的药物仅通过静脉内
和皮下注射给药体现出优势。

[0019] 所述药物组合物可以制备成以下形式的药物制剂：针剂、糖浆剂、酏剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、锭剂、霜剂、膏剂、凝胶剂、乳剂等。

[0020] 第三方面，本发明提供一种通式Ⅰ的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、酯、前药、溶剂化物和氘代化合物在制备小分子GLP‑1R激动剂用途。

[0021] 本发明提供的小分子GLP‑1R激动剂能促进胰岛素分泌，降低高血糖，同时由于促进胰岛素分泌具有葡萄糖浓度依赖特性，还能减少低血糖现象的发生。

[0022] 第四方面，本发明提供一种通式Ⅰ的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、酯、前药、溶剂化物和氘代化合物在制备预防和/或治疗糖尿病药物中的用途。

[0023] 优选的，所述糖尿病为二型糖尿病。

[0024] 目前临床上已投入使用的GLP‑1R激动剂大多数是多肽类药物，如利拉鲁肽、艾塞那肽等。由于多肽类大分子药物只能通过注射途径给药，但是频繁多次注射给药导致患者
用药依从性较差，而且由于肽类药物在体内外均表现出不稳定性，以注射给药的形式制约
着其临床应用。本发明提供的GLP‑1R激动剂属于小分子药物，可通过胃肠给药，能显著提高
患者用药依从性、用药方便性。

[0025] 第五方面，本发明提供一种通式Ⅰ的化合物及其药学上可接受的盐、立体异构体、酯、前药、溶剂化物和氘代化合物在制备Kv通道抑制剂中的用途。

[0026] 第六方面，本发明提供一种通式Ⅰ的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、酯、前药、溶剂化物和氘代化合物在制备治疗与Kv通道相关疾病的药物中的用途。

[0027] 除了本发明前述的糖尿病，与Kv通道相关的疾病还包括：癫痫、脑缺血性疾病、神经退行性疾病。

[0028] 本发明中所述的术语C0‑10烷基，C0烷基是指H，因此，C0‑10烷基包括H、碳原子为1‑10的直链烷基或支链烷基，具体碳原子数可以为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。

[0029] 可以举出的支链烷基的例子包括但不限于异丙基、异丁基、叔丁基、异戊基。

[0030] 本发明中所述的术语C3‑8环烷基，包括C3环烷基、C4环烷基、C5环烷基、C6环烷基、C7环烷基、C8环烷基。

[0031] 本发明所述的术语卤素，包括氟、氯、溴、碘。

附图说明

[0032] 图1 S6对不同葡萄糖条件下大鼠胰岛胰岛素分泌的影响。

[0033] 图2 A表示在β细胞中存在8.3mM葡萄糖的情况下，S6对[Ca2+]i的影响；B表示响应于S6的F‑F0的平均值。

[0034] 图3 A表示在有或没有S6的情况下记录电流曲线；B表示存在或不存在S6时，电压2+
门控的Ca 通道的电流‑电压关系曲线；C表示在0mV处记录的平均电流密度。

[0035] 图4 A表示使用或不使用S6记录的细胞电流；B表示Kv通道的电流‑电压曲线；C表示以80mV记录的Kv通道的平均电流密度：D和E表示不存在S6或存在S6时的代表性动作电位
波形；F表示平均动作电位时程(APD)。

[0036] 图5 A表示在8.3mM葡萄糖的情况下，20mM氯化四乙铵(TEA)对S6诱导的[Ca2+]i影响；B表示在存在或不存在8.3mM的TEA时，响应S6的F‑F0平均值；C表示在不存在或存在
8.3mM葡萄糖的TEA下，S6对胰岛素分泌的作用。

[0037] 图6 A表示在8.3mM葡萄糖存在下，L型Ca2+通道拮抗剂Azelnidipine对S6诱导的2+
[Ca ]i的影响；B表示在存在或不存在Azelnidipine时，响应S6的F‑F0平均值；C表示在没有
2+
细胞外钙的情况下，S6诱导[Ca ]i的变化；D表示在不存在细胞外钙的情况下，响应S6的F‑
F0平均值。

[0038] 图7 A表示无细胞蛋白表达SDS‑PAGE结果；B表示Western blot TOB透析式无细胞蛋白表达GLP‑1R蛋白的验证结果。

[0039] 图8 A表示使用CETSA检测在DMSO和S6(10μM)处理细胞裂解物后，GLP‑1R的表达随温度升高的变化，定量数据如B中显示。

[0040] 图9在存在或不存在Exendin(9‑39)的情况下，S6对胰岛素分泌的影响。

[0041] 图10 A表示Exendin(9‑39)对S6诱导[Ca2+]i的影响，在8.3mM葡萄糖存在下，不同2+
处理后[Ca ]i的变化以F340/F380的比例绘制，B表示在存在或不存在exendin(9‑39)时对
响应S6的F‑F0平均值。

[0042] 图11 A表示S6在有或无Exendin(9‑39)的情况下记录的电流曲线；B表示Kv通道的电流‑电压曲线；C表示80mV下Kv通道的平均电流密度。

具体实施方式

[0043] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在
没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0044] 实施例1含有化合物S6的片剂

[0045] S1：将化合物S6 50g按递增法添加乳糖220g的方法混合研磨80min，然后混入微晶纤维素35g和山梨醇10g再次研磨30min，研磨温度低于30℃，得到药物‑乳糖混合物；

[0046] S2：将混合物投入到湿法制粒机混合5min，按制剂重量每千克4mL的比例取吐温‑80(溶于95％乙醇中)，然后与0.5％聚维酮K30水溶液按1:20的混合作为黏合剂加到湿法颗
粒机混合物中进行制粒；

[0047] S4：向S2制得的颗粒中混合加入硬脂酸镁，压片机硬度控制在4‑5kgf法以内，压片得到含有化合物S6的片剂1000片。

[0048] 实施例2含有化合物S6的颗粒剂

[0049] S1：将化合物S6 50g按递增法添加乳糖220g的方法混合研磨80min，然后混入微晶纤维素35g和山梨醇10g再次研磨30min，研磨温度低于30℃，得到药物‑乳糖混合物；

[0050] S2：向步骤S1制备的药物‑乳糖混合物中加入蔗糖:糊精3:1的混合物(过80目筛150g，混匀，制软材，挤压制粒，干燥，整粒，过12目筛，分装后即得含有化合物S6的颗粒剂。

[0051] 实施例3含有化合物S6的胶囊剂

[0052] S1：将3.5g的氢氧化钠用少量质量浓度为50％的乙醇水溶液溶解，加入化合物S6 50g，混合并研磨，得到混合物；

[0053] S2：向混合物中加入220g乳糖，混合后进行在55℃条件下干燥80min，粉碎、过40目筛网，得到混合细粉；

[0054] S3：将30mL质量浓度为5％的聚维酮K30的乙醇溶液加入步骤S2所得混合细粉中制软材，过20目筛网制湿颗粒；

[0055] S4：将步骤S3制得湿颗粒在50℃条件下干燥6h后，过18目筛网进行整粒；

[0056] S5：测定颗粒中化合物S6的含量，计算装量，装囊，检查合格后包装，即得含有化合物S6的硬胶囊1000粒。

[0057] 实施例4含有化合物S6的注射剂

[0058] S1：配液，取20mg化合物S6溶于1000mL磷酸盐缓冲溶液中，配成药物浓度为0.02mg/mL的药液；

[0059] S2：活性炭处理，向药液中加入溶液总量0.2％的针用活性炭吸附处理0.5小时；

[0060] S3：初滤，用滤纸将药液进行过滤；

[0061] S4：过滤除菌，用孔径为0.22μm的微孔滤膜对药液进行除菌，除热源；

[0062] S5：以2mL为单位对药液进行分装，灌封，得到注射液。

[0063] 接下来，本发明将按照以下效果例对本发明优选化合物S6进行测试，验证化合物S6呈葡萄糖浓度依赖性促进大鼠胰岛素分泌及其电生理机制，及验证化合物S6通过激活
GLP‑1R促进大鼠胰岛素分泌。

[0064] 本发明使用的实验动物为雄性Wistar大鼠，体重为180～250g,购自于山西省人民医院实验动物中心，饲养于温度为20～22℃，并配有标准啮齿动物食物及饮用水。所有操作
流程均符合山西医科大学实验动物的管理和使用指南。

[0065] 大鼠胰岛组织的分离与培养、大鼠胰岛β细胞的分离与培养均是本领域技术人员常规的实验操作。本发明涉及的数据处理用SigmaPlot 12.5和Igor 6.1处理实验数据，并
以Mean±SEM表示。使用Student’s t‑test，one‑way ANOVA或paired t‑test进行统计分
析，当P<0.05时被认为具有统计学意义，使用Image LabTM软件对蛋白条带进行定量。

[0066] G表示葡萄糖浓度mmol/L，比如2.8G表示浓度为2.8mmol/L的葡萄糖溶液。

[0067] 一、验证S6呈葡萄糖浓度依赖性促进大鼠胰岛素分泌及其电生理机制

[0068] 主要药品与试剂

[0069]

[0070]

[0071] 主要实验仪器

[0072]

[0073]

[0074] 效果例1 S6促进胰岛素分泌呈葡萄糖浓度依赖性

[0075] 实验前准备：1)实验分为3组，Ep(Eppendorf)管编号(每组7个Ep管)；2)配制KRBH溶液，置培养箱中孵育30min，用NaOH调制pH至7.4；3)配制不同浓度的待测样品：2.8mmol/L
葡萄糖溶液(2.8G)、8.3mmol/L葡萄糖溶液(8.3G)16.7mmol/L葡萄糖溶液(16.7G)、2.8G+10
μM S6、8.3G+10μM S6、16.7G+10μM S6。

[0076] 实验步骤：1)向每个Ep管中加入500μL 2.8G，在体式显微镜下挑取5个胰岛(大小均一，边缘光滑)至Ep管中，放至培养箱内孵育30min；2)用移液枪将上清液吸出弃掉，然后
每组依次各加入500μL 2.8G、8.3G、16.7G，置培养箱中孵育30min；3)取出Ep管，用移液枪将
上清液吸出至提前标记好的Ep管中，混匀，封口，4℃保存，并按照上一轮的加药顺序依次加
入500μL 2.8G+10μM S6、8.3G+10μM S6、16.7G+10μM S6，置培养箱中孵育30min；4)取出Ep
管，将上清液吸出至已编号的Ep管中，封口，4℃保存。检测各组胰岛素的含量。

[0077] 实验结果如图1所示，图1表示S6对不同葡萄糖条件下大鼠胰岛胰岛素分泌的影响，从图中可以看出，在2.8mM葡萄糖(2.8G)，8.3mM葡萄糖(8.3G)和16.7mM葡萄糖(16.7G)
的条件下用10μM S6处理胰岛，n＝7，**p<0.01；***p<0.001，从图中可以看出，在基础葡萄
糖浓度(2.8G)下，S6未发挥促胰岛素分泌的作用，而在中等葡萄糖浓度(8.3G)及高葡萄糖
浓度(16.7G)下的促胰岛素分泌作用显著，且后者作用明显强于前者，上述结果表明S6以葡
萄糖浓度依赖性的方式促进胰岛素分泌。

[0078] 上述结果表明S6在高葡萄糖浓度(8.3G，16.7G)下发挥促胰岛素分泌的作用，而且此作用具有葡萄糖浓度依赖性，表明S6可以在GLP‑1R表达的胰岛组织中发挥促进胰岛素分
泌的作用，并且极大的减少了诱发低血糖的风险。基于以上结果，我们可以初步断定S6在治
疗T2DM中的可能性。

[0079] 接下来，我们进一步探究S6诱导胰岛素分泌的电生理机制，在大鼠原代胰岛β细胞上观察S6对细胞内钙离子浓度变化的影响。

[0080] 效果例2 S6升高β细胞内的钙离子浓度

[0081] 实验前准备：1)分离胰岛β细胞，在细胞培养箱内培养3～4h；2)配制实验所需的KRBH溶液(调pH至7.35～7.45)以及待测药物溶液：2.8G、8.3G、8.3G+10μM S6。

[0082] 实验步骤：1)取细胞玻片至35mm的培养皿内，用含2.8mM葡萄糖的KRBH溶液清洗细胞2次，加入Fura2‑AM工作液，用锡箔纸包裹后于培养箱内孵育30min。用含2.8mM葡萄糖的
KRBH溶液清洗细胞2次，以充分去除残留的Fura2‑AM工作液；2)在检测系统的荧光显微镜浴
槽内加入适量的含2.8mM葡萄糖的KRBH溶液，放置细胞于浴槽内。分别进行不同待测药物的
干预，在激发波长380nm和340nm，发射波长510nm下，观察细胞的荧光强度变化。

[0083] 实验结果如图2‑A和图2‑B所示，图A表示在β细胞中存在8.3mM葡萄糖的情况下，S62+ 2+
对[Ca ]i的影响，[Ca ]i的变化以F340/F380的比例绘制；B表示响应于S6的F‑F0的平均值，
F表示不同处理在峰前和峰后15s的平均值，F0表示对于2.8mM葡萄糖浓度最小值前后15s的
2+
平均值，n＝13，***p＜0.001。从图中可以看出，在8.3G葡萄糖浓度下，细胞内Ca 水平明显
2+
升高；在此基础上继续添加S6，细胞内Ca 浓度仍能进一步增加。因此，可以推断S6的促胰岛
2+
素分泌作用是通过升高细胞内Ca 浓度来实现，并且在8.3G的葡萄糖浓度显著促进细胞内
钙离子浓度升高。

[0084] 效果例3 S6未影响β细胞电压依赖性钙(VDCC)通道

[0085] 实验步骤：1)在显微镜浴槽内加入适量检测VDCC的电极外液，然后将细胞玻片放入浴槽边缘处，并在显微镜视野内找到细胞；2)充灌电极内液；3)电极入液，高阻封接。将细
胞钳制在‑70mV,进行快电容补偿；全细胞模式下破膜后，给予慢电容补偿。给予‑50mV～+
30mV的电压刺激且以10mV为一个步阶，记录50ms内电流的变化。在记录电压依赖性钙通道
2+ 2+ 2+
时，细胞外液用Ba 代替Ca ，其主要目的是延缓钙通道的衰减，而且Ba 电流可将信号适当
放大以便于分析。

[0086] 实验结果如图3所示，A表示在有或没有S6的情况下记录电流曲线；B表示存在或不2+
存在S6时，电压门控的Ca 通道的电流‑电压关系曲线；C表示在0mV处记录的平均电流密度，
n＝7。从图3可以看出，在测试电压为0mV下，与对照组相比(电流密度为‑5.5022±
1.4896pA/pF)，S6处理组电流密度为(‑6.9781±1.0858pA/pF)，两组间没有显著性差异。因
此，S6未影响β细胞电压依赖性钙通道，说明S6对VDCC通道没有促进作用。

[0087] 效果例4 S6抑制了β细胞电压依赖性钾(Kv)通道，延长β细胞动作电位时程

[0088] 实验步骤：1)在显微镜浴槽内加入适量检测电极外液，将含有β细胞的玻片放入浴槽内，并在镜下找到细胞；2)充灌适量电极内液，轻敲电极管壁除去起泡；3)电极入液，入液
过程中可给予正压，既能吹走电极尖端周围的脏物，又利于高阻封接，入液后将电极放至细
胞的正上方，慢慢下移电极；当电极接触到细胞膜表面时，继续下压电极，待电阻增加0.5M
Ω左右时给予负压直至高阻封接。电压钳模式下将细胞钳制在‑70mV，进行快电容补偿；全
细胞模式破膜后，进行慢电容补偿，将细胞膜电容调至≥7MΩ。给予‑70mV～+80mV的电压刺
激并以10mV为一个步阶，记录400ms内电流的变化。破膜后，在电流钳模式下给予150pA、4ms
的电流刺激。计算细胞去极化开始到复极化至距离静息电位以上10mV所需的时间。

[0089] 实验结果：通过全细胞膜片钳实验对Kv电流和动作电位进行检测，结果如图4所示，A表示使用或不使用S6记录的当前迹线，B表示Kv通道的电流‑电压曲线，C表示以80mV记
录的Kv通道的平均电流密度，n＝7，**P<0.01。如图4的A、B、C数据显示，在测试电压为80mV
下，与对照组相比，S6处理组显著性抑制了Kv电流。本实验动作电位持续时间(APD)由4ms，
150pA电流注入引起，图D和E表示代表性动作电位波形，F表示平均APD，n＝7；***P<0.001。
如图4的D、E、F所示，与对照组相比，S6明显延长了动作电位时程。因此，S6诱导的胰岛素分
泌作用是通过抑制Kv通道，延长动作电位时程来完成的。

[0090] 效果例5 Kv通道部分参与S6介导的胰岛素分泌作用

[0091] 实验1

[0092] 实验前准备：1)分离胰岛β细胞，在细胞培养箱内培养3～4h；2)配制实验所需的KRBH溶液(调pH至7.35～7.45)以及待测药物溶液：2.8G、8.3G、8.3G+10μMS6、8.3G+20mM 
TEA、8.3G+20mM TEA+S6；3)配置Fura‑2AM工作液：取1.5mL的Ep管，加入2μL 1mM的Fura2‑AM
工作液和1mL含2.8mM葡萄糖的KRBH溶液，配制成终浓度为2μM的荧光染料，充分混匀后避光
保存，备用。

[0093] 实验步骤：1)取细胞玻片至35mm的培养皿内，用含2.8mM葡萄糖的KRBH溶液清洗细胞2次，加入Fura2‑AM工作液，用锡箔纸包裹后于培养箱内孵育30min。用含2.8mM葡萄糖的
KRBH溶液清洗细胞2次，以充分去除残留的Fura2‑AM工作液；2)在检测系统的荧光显微镜浴
槽内加入适量的含2.8mM葡萄糖的KRBH溶液，放置细胞于浴槽内。分别进行不同待测药物的
干预，在激发波长380nm和340nm，发射波长510nm下，观察细胞的荧光强度变化。

[0094] 实验结果：为了探究S6诱导的胰岛素分泌作用是否仅与Kv通道有关，我们使用Kv通道阻断剂TEA进行观察，结果如图5的A和B所示，A表示在存在8.3mM葡萄糖的情况下，20mM
2+ 2+
氯化四乙铵(TEA)对S6诱导的[Ca ]i升高的影响，[Ca ]i的变化以在不同条件下的F340/
F380的比例绘制；B表示在存在或不存在8.3mM的TEA时，响应S6的F‑F0平均值，n＝18，***p
＜0.001。如图5的A和B所示，钙离子成像实验显示，TEA在8.3mM葡萄糖条件下显着增加了细
2+ 2+
胞内Ca 水平，紧接着我们同时给予Kv通道阻断剂TEA和S6，发现[Ca ]i仍能够进一步增
加。

[0095] 实验2

[0096] 实验前准备：1)实验分为3组，Ep管编号；2)配制待测药物，2.8G、8.3G、8.3G+20mM TEA、8.3G+10μM S6、8.3G+20mM TEA+10μM S6。

[0097] 实验步骤：1)预孵育；2)取出Ep管，弃上清，每组依次各加入500μL 2.8G、8.3G、8.3G+20mM TEA，置培养箱中孵育30min；3)取出Ep管，将上清液吸出至提前标记好的Ep管
中，混匀，封口，4℃保存，按照上一轮的加药顺序依次加入500μL 8.3G+10μM S6、8.3G+20mM 
TEA+S6，置培养箱中孵育30min；4)取出Ep管，用移液枪将上清液吸出至已编号的Ep管中，封
口，4℃保存，检测各组胰岛素的含量。

[0098] 实验结果如图5的C所示，C表示在不存在或存在8.3mM葡萄糖的TEA下，S6对胰岛素分泌的作用，n＝6，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。我们发现S6和TEA分别在8.3mM葡萄糖
条件下显着增强了胰岛素的分泌，同时给予TEA和S6时，胰岛素分泌的能力进一步增强，这
些结果共同表明，S6的促胰岛素分泌作用除了Kv通道抑制作用，还涉及其他因素。

[0099] 效果例6证明S6介导的细胞内Ca2+浓度升高的另一个原因是细胞内钙库释放

[0100] 实验1

[0101] 实验前准备：1)分离胰岛β细胞，在细胞培养箱内培养3～4h；2)配制实验所需的KRBH溶液(调pH至7.35～7.45)以及待测药物溶液：2.8G、8.3G、8.3G+10μMS6、8.3G+0.1μM 
Azelnidipine、8.3G+0.1μM Azelnidipine+S6；3)配置Fura‑2AM工作液：取1.5mL的Ep管，加
入2μL 1mM的Fura2‑AM工作液和1mL含2.8mM葡萄糖的KRBH溶液，配制成终浓度为2μM的荧光
染料，充分混匀后避光保存，备用。

[0102] 实验步骤：1)取细胞玻片至35mm的培养皿内，用含2.8mM葡萄糖的KRBH溶液清洗细胞2次，加入Fura2‑AM工作液，用锡箔纸包裹后于培养箱内孵育30min。用含2.8mM葡萄糖的
KRBH溶液清洗细胞2次，以充分去除残留的Fura2‑AM工作液；2)在检测系统的荧光显微镜浴
槽内加入适量的含2.8mM葡萄糖的KRBH溶液，放置细胞于浴槽内。分别进行不同待测药物的
干预，在激发波长380nm和340nm，发射波长510nm下，观察细胞的荧光强度变化。

[0103] 实验结果：为了探究[Ca2+]i的增加与细胞内钙库释放的关系，我们使用L型Ca2+通2+
道拮抗剂Azelnidipine分析S6在促进细胞内Ca 浓度升高的作用，结果如图6的A和B图所
2+ 2+
示，A表示在8.3mM葡萄糖存在下，L型Ca 通道拮抗剂Azelnidipine对S6诱导的[Ca ]i升高
2+
的影响，[Ca ]i的变化以在不同条件下F340/F380的比例绘制；B表示在存在或不存在
Azelnidipine时，响应S6的F‑F0平均值为8.3mM，n＝14，***p＜0.001。如图6的A和B图钙离
子成像实验显示，在8.3G葡萄糖条件下，细胞内钙水平显著增加；随后我们发现同时给予S6
2+ 2+
和Azelnidipine时，[Ca ]i仍明显增加，这些现象提示细胞内Ca 的增加可能源自细胞内
钙动员。

[0104] 实验2

[0105] 实验前准备：配制实验所需的无Ca2+‑KRBH溶液(调节pH至7.35～7.45)以及待测药物溶液：2.8G、8.3G、8.3G+10μM S6。

[0106] 实验步骤：1)取出细胞，用含2.8mM葡萄糖的KRBH溶液清洗2次，加入Fura2‑AM工作液孵育30min，孵育完成后用含2.8mM葡萄糖的KRBH溶液清洗细胞2次；2)分别进行不同待测
药物的干预，在激发波长380nm和340nm，发射波长510nm下，观察细胞的荧光强度变化。

[0107] 实验结果：我们在去除细胞外Ca2+情况下，测量细胞内钙浓度的变化，结果如图6的2+ 2+
C图和D图所示，C表示在没有细胞外钙的情况下，S6诱导[Ca ]i升高，[Ca ]i的变化以在不
同条件下的F340/F380的比例绘制；D表示在不存在细胞外钙的情况下，响应S6的F‑F0平均
2+
值为8.3mM，n＝9，***p<0.001。如图6的C和D图数据显示，在没有细胞外Ca 的存在下，S6仍
2+ 2+
明显增加了细胞内钙的浓度，以上结果共同表明S6通过细胞内Ca 库释放增强了[Ca ]i。

[0108] 二、验证S6通过激活GLP‑1R促进大鼠胰岛素分泌

[0109] 为了证明S6是否是有效的GLP‑1R激动剂，我们首先引入了一种新兴的名为细胞热转变分析(Cellular Thermal Shift Assay，CETSA)的实验来监测和量化药物到达并结合
蛋白靶标的程度。其原理是每种蛋白质都有自身的热熔解曲线，当用药物处理细胞时，未与
药物结合的蛋白质将在加热过程中变性失活并产生沉淀，而能与药物结合的蛋白质能稳定
存在。然后通过western blot检测不同温度下药物处理组和对照组胞浆内残留的可溶性蛋
白来估算热稳定性的变化。另外该方法适用范围广泛，可以在活细胞、细胞裂解液和组织内
检测药物和靶标蛋白的相互作用。

[0110] 主要药品与试剂

[0111]

[0112]

[0113] 主要实验仪器

[0114] 低温高速离心机 德国Eppendorf公司多功能酶标仪 美国Bio Tek公司
Western blot垂直电泳系统 美国Bio Tek公司
Western blot半干转膜系统 美国Bio Tek公司
凝胶成像系统 美国Bio Tek公司
钙成像LAMBDA 10‑B系统 北京MDE公司
PCR仪 美国Bio‑rad公司
恒温振荡培养箱 太仓华美生化仪器有限公司
恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司
电热恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司
微型漩涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司
数显恒温水浴锅 国华电器有限公司

[0115] 效果例7 CETSA验证GLP‑1R与S6的靶向作用

[0116] 无细胞GLP‑1R蛋白的表达：1)构建大鼠GLP‑1R载体：用PCR扩增技术获得大鼠GLP‑1R的序列片段，琼脂糖凝胶中回收GLP‑1R rat基因片段，将目的基因GLP‑1R克隆到载体
pEX‑3中，用EcoRI和BamHI双酶切pEX‑3，电泳，回收载体pEX‑3；利用 Entry 
One Step Cloning Kit，把扩增片段重组克隆到pEX‑3载体中；将重组连接产物转化为感受
态细胞，挑取克隆菌落，少量抽提得到质粒，用EcoRI和BamHI双酶切鉴定，电泳，挑取阳性克
隆；最后对重组质粒测序验证后进行大量抽提，取适量阳性克隆对应的菌液测序，剩余的菌
液用甘油保存；将测序结果与目的基因序列进行比对，核对无误后，用甘油菌液接菌LB培养
基，大量质粒抽提，得到足够量的重组质粒。2)无细胞GLP‑1R蛋白的表达：采用杭州谨澳生
物科技Z1高保真DNA聚合酶G‑POL‑001或Z2超保真DNA聚合酶G‑POL‑002对目的基因进行扩
增，为了提高蛋白表达的成功率，我们分别采用E.coli透析式无细胞蛋白表达体系，TOB透
析式无细胞蛋白表达体系，Yeast透析式无细胞蛋白表达体系进行表达，最后用SDS‑PAGE观
测表达结果。

[0117] 实验步骤：1)从‑80℃冰箱取出用TOB表达系统表达的含有GLP‑1R的总蛋白溶液，置于冰上，取出实验所需总蛋白的体积，实验分为2组，实验干预组加入终浓度为10μM S6，
对照组加入同体积的DMSO，置于37℃培养箱内孵育45min。孵育结束后，将实验干预组和对
照组分别等分为5组，然后用RT‑PCR仪在不同温度下(47～67℃)加热3min，室温冷却3min，4
℃，20000g 20min离心，将上清吸出至200μL的Ep管中，加入5×Loading buffer，95℃加热
5min后，于‑80℃冰箱内保存。2)蛋白印迹(Western‑Blot)分析：a配制10％的分离胶和5％
的浓缩胶,蛋白上样体积为5μL；b电泳：先以80V恒压分离30min，待蛋白样品进入分离胶后
换成120V继续分离1h，停止电泳：c转膜：恒压半干湿法转膜，20V，25min；d封闭：将NC膜放入
5％脱脂奶粉中，37℃孵育1h；e孵育一抗，用TBST将一抗稀释至1:3000，室温孵育2h，最后用
TBST洗涤三次，每次10min；f孵育二抗，用TBST将二抗稀释至1:10000，室温下孵育1h后用
TBST洗涤三次，每次10min，g显影:配制ECL发光液，并使用ChemiDicTM XRS+成像系统对蛋
白条带进行鉴定。

[0118] 实验结果：

[0119] 1，pEX3‑GLP‑1R表达载体的鉴定

[0120] 对质粒进行如下检测：1)采用序列比对的方法进行基因序列检测：测序结果与目的序列一致；2)采用序列比对的方法进行向量序列检测：侧翼20bp序列与载体一致；3)采用
琼脂糖电泳的方法对片段大小进行检测：质粒无污染带，片段大小正确；4)采用紫外分光光
度法对浓度进行检测：OD260/280为1.8‑2.0。

[0121] 2，TOB透析式蛋白表达体系的GLP‑1R蛋白的鉴定

[0122] 分别取5μL GLP‑lR E.coli、GLP‑lR TOB、GLP‑lR Yeast的上清和总蛋白进行SDS‑PAGE检测，如图7的A图所示，GLP‑lR目的蛋白在E.coli表达体系和Yeast表达体系未观测到
目的蛋白过量表达；目的蛋白(*)在TOB表达体系疑似表达，为可溶蛋白。随后我们对GLP‑lR 
TOB样品进行了western blot检测，结果如图7的B图所示，证实GLP‑lR目的蛋白在TOB表达
体系表达。

[0123] 3，GLP‑1R是S6的特异性靶标

[0124] 在前一部分中，已经验证S6能够发挥促进大鼠胰岛素分泌的作用，本发明还验证了S6为有效的小分子GLP‑1R激动剂。首先使用CETSA技术来观察GLP‑1R和S6的关系，通过
Western‑Blot检测蛋白质样品，观察GLP‑1R表达的变化。如图8所示，图A表示使用DMSO和S6
(10μM)处理的细胞裂解物的CETSA使用Western印迹检测S6和GLP‑1R之间的相互作用，定量
数据如B中显示，n＝3，独立实验，*p＜0.05。随着温度的升高，对照组(DMSO)GLP‑1R的表达
越来越不稳定；而S6处理组的GLP‑1R表达虽然也随着温度升高而减弱，但相对于DMSO处理
组而言是稳定的，尤其是在62℃时两组间的差距最大，这说明与GLP‑1R结合后增强了GLP‑
1R的热稳定性，进而说明GLP‑1R是S6的靶蛋白。

[0125] 效果例8 S6通过GLP‑1R促进胰岛素分泌

[0126] 实验前准备：1)实验分3组，Ep管编号；2)配制待测药物：2.8G、8.3G、8.3G+100nM Exendin(9‑39)、8.3G+S6+Exendin(9‑39)、8.3G+S6。

[0127] 实验步骤：1)预孵育；2)取出Ep管弃上清，每组各自加入500μL 2.8G、8.3G、8.3G+Exendin(9‑39)，孵育30min；3)将上清液吸出至提前标记好的Ep管中，混匀，封口，4℃保存；
4)按照前一次的给药顺序，依次各自给予500μL 8.3G+S6+Exendin(9‑39)、8.3G+S6，孵育
30min后，上清液吸出至已准备好的Ep管中，混匀，封口。检测各组上清液中胰岛素的含量。

[0128] 实验结果：通过使用GLP‑1R拮抗剂Exendin(9‑39)，检查S6增强胰岛素分泌是否依赖于大鼠胰岛中的GLP‑1R活化，如图9所示，表示S6中存在或不存在Exendin(9‑39)的情况
下，S6通过GLP‑1R诱导葡萄糖依赖性胰岛素分泌，n＝6；*P<0.05，**P<0.01。结果显示
Exendin(9‑39)阻断了S6促进的胰岛素分泌作用，表明S6对胰岛素分泌的作用与GLP‑1R激
活有关，这与先前实验结果相同。

[0129] 效果例9 S6通过GLP‑1R增加细胞内Ca2+浓度

[0130] 实验前准备：1)分离胰岛β细胞，在细胞培养箱内培养3～4h；2)配制实验所需的KRBH溶液(调pH至7.35～7.45)并配制待测溶液：2.8G、8.3G、8.3G+Exendin(9‑39)、8.3G+S6
+Exendin(9‑39)、8.3G+S6；3)配置Fura‑2AM工作液。

[0131] 实验步骤：在2.8G、8.3G、8.3G+Exendin(9‑39)、8.3G+S6+Exendin(9‑39)、和8.3G+S6干预下，观察细胞的荧光强度变化。

[0132] 实验结果：为进一步验证S6升高细胞内Ca2+浓度与GLP‑1R的关系，我们使用2+
Exendin(9‑39)对细胞内Ca 浓度变化进行检测。如图10所示，图A表示Exendin(9‑39)对S6
2+ 2+
诱导的影响[Ca ]i在8.3mM葡萄糖存在下，[Ca ]i的变化以F340/F380的比例绘制，图B表
示在存在或不存在Exendin(9‑39)时对S6响应的F‑F0平均值，n＝9，***P<0.001。实验结果
2+
显示Exendin(9‑39)减弱了S6诱导的细胞内Ca 增强的作用，而单独使用时没有影响细胞内
2+ 2+
Ca 浓度变化。这些发现表明，S6通过GLP‑1R引起[Ca ]i增加，从而导致胰岛素囊泡的胞吐
作用增强。

[0133] 效果例10 S6通过GLP‑1R抑制Kv通道电流

[0134] 实验前准备：1)分离好胰岛β细胞，在细胞培养箱内培养24h，待用；2)电极的制备；3)配制实验所需的药物浓度:11.1G、11.1G+S6、11.1G+Exendin(9‑39)、11.1G+S6+Exendin
(9‑39)。

[0135] 实验步骤：记录不同药物干预下β细胞上Kv通道电流。

[0136] 实验结果如图11所示，图A表示存在或不存在Exendin(9‑39)的情况下记录的细胞电流曲线；图B表示Kv通道的电流‑电压曲线；图C表示80mV下Kv通道的平均电流密度，n＝
7；*P<0.05。实验结果证明S6明显减弱了Kv通道电流，而用Exendin(9‑39)后，S6抑制Kv通道
电流的作用被逆转了。

[0137] GLP‑1R属于G蛋白偶联受体B族亚类，当GLP‑1及其类似物与GLP‑1R结合后，可以触发一系列的信号反应，最终调节胰岛素的分泌活动。在胰岛素分泌实验中，我们观察在GLP‑
1R阻断剂Exendin(9‑39)存在下，S6减弱了对大鼠胰岛素分泌的作用，表明S6通过GLP‑1R发
挥促胰岛素分泌的作用，再次印证了S6作用于GLP‑1R。紧接着在钙离子成像技术实验中，我
2+
们观察S6诱导细胞内Ca 浓度升高的作用是否也与GLP‑1R有关，结果发现在Exendin(9‑39)
存在下，S6升高细胞内钙离子浓度的能力被消除，这表明S6升高细胞内钙离子浓度是通过
激活GLP‑1R完成的。而且在膜片钳实验中我们发现S6通过激活GLP‑1R抑制Kv通道，进而延
2+
长动作电位时程，导致电压依赖性钙通道开放时间延长，最终导致细胞内Ca 浓度增加。

[0138] 效果例11化合物S6的急性毒性试验

[0139] 将雄性小鼠随机分为5组，每组10只，将化合物S6溶于生理盐水中进行灌喂给药，第1‑6组的给药剂量分别为1.5g/kg、3.0g/kg、5.0g/kg、7.5g/kg、15.0g/kg。给药后将老鼠
按常规标准进行饲养，10天后记录各组死亡情况，用SPSS13.0软件计算药物半数致死量
(LD50)。药物急性毒性试验结果如下表所示，结果显示本发明提供的化合物LD50值为6.2g/
kg，95％可信限为4.3‑7.9g/kg，毒性较低。

[0140] 表1药物急性毒性试验结果

[0141] 组别 给药剂量g/kg 10天小鼠死亡数 成活率1 1.5 0 100％
2 3.0 1 90％
3 5.0 2 80％
4 7.5 6 40％
5 15.0 10 0

[0142] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依
然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术
方案的范围。