一株恶臭假单胞菌X14及其应用方法转让专利
申请号 : CN202010461696.3
文献号 : CN111548967B
文献日 : 2022-01-18
发明人 : 许隽 , 雷平 , 邵晨霞 , 杨祎 , 葛小鹏 , 贺月林 , 唐少军 , 靳磊 , 吴胜莲
申请人 : 湖南省微生物研究院
摘要 :
权利要求 :
1.一株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14,保藏编号为:CGMCC No.19720。
2.权利要求1所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14在促进羊肚菌菌丝生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14在促进羊肚菌试管种菌丝生长中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,把羊肚菌接种在PDA平板培养基中培养,菌丝长满平皿待用;把X14菌株接种在营养肉汤培养基中,振荡培养过夜待用;把麦粒浸泡过夜或用开水煮沸,过滤水分晾干后装入试管,进行高温高压灭菌制作成麦粒试管培养基;用打孔器接种羊肚菌圆形菌饼于麦粒试管种,同时接种X14菌液,静置培养。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,把羊肚菌接种在PDA平板培养基中,在16‑
20℃培养5‑7 d,菌丝长满平皿待用;把X14菌株接种在营养肉汤培养基中,在25‑28℃振荡培养14‑18 h待用;把麦粒浸泡过夜,用开水煮沸,过滤水分晾干后装入20 x 200 mm试管,麦粒装量18‑22 g,进行高温高压灭菌制作成麦粒试管培养基;用打孔器接种直径为10 mm的羊肚菌圆形菌饼1‑2个于麦粒培养基上,同时接种1‑2 ml的X14菌液,16‑20℃静置培养。
6.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)X14在促进羊肚菌原种菌丝生长,缩短羊肚菌原种制备周期中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,用麦粒制作羊肚菌原种培养基,用打孔器接种的羊肚菌圆形菌饼于麦粒原种培养基上,同时接种X14菌液,16‑20℃静置培养。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,用麦粒制作羊肚菌原种培养基,培养基配方为:小麦70%、木屑18%、腐殖土10%、生石灰1%、石膏1%,培养基装量580‑620 g,玻璃瓶容积
500 mL,用打孔器接种4‑5个直径为10 mm的羊肚菌圆形菌饼于麦粒原种培养基上,同时接种4‑5 ml的X14菌液,16‑20℃静置培养。
说明书 :
一株恶臭假单胞菌X14及其应用方法
技术领域
背景技术
高,是久负盛名的食补良品,具有增强肌体免疫力、促进副肾皮激素的分泌、降低胆固醇、预
防动脉硬化、抗疲劳、抗病毒、抗肿瘤等作用。
2019年约10‑12万亩,相比2018年,栽培面积稳中有降。羊肚菌主要种植范围由四川、云南、
贵州逐渐向河南、河北、湖北、新疆、湖南等地区扩展。由于栽培技术还不完善,羊肚菌人工
种植产量不高,市场上供不应求。
具有重要作用,羊肚菌生长土壤的细菌数量显著高于非羊肚菌生长土壤。目前土壤细菌与
羊肚菌的互作机理仍然不清楚,有待深入研究。菌种制作是羊肚菌人工栽培中首要环节,大
部分菇农采用试管种‑原种‑栽培种传统扩大培养方法制作羊肚菌菌种,制种周期长,导致
生产成本高。
发明内容
长速率提高了13.8%。通过生理生化特征试验与16S rDNA序列分析,初步鉴定菌株X14为恶
臭假单胞菌。
干后装入试管,进行高温高压灭菌制作成麦粒试管培养基;用打孔器接种羊肚菌圆形菌饼
于麦粒试管种,同时接种X14菌液,静置培养。
夜,用开水煮沸,过滤水分晾干后装入20x 200mm试管,麦粒装量18‑22g,进行高温高压灭菌
制作成麦粒试管培养基;用打孔器接种直径为10mm的羊肚菌圆形菌饼1‑2个于麦粒培养基
上,同时接种1‑2ml的X14菌液,16‑20℃静置培养。
沸,过滤水分晾干后装入20x 200mm试管,麦粒装量20g,进行高温高压灭菌制作成麦粒试管
培养基;用打孔器接种直径为10mm的羊肚菌圆形菌饼1‑2个于麦粒培养基上,同时接种1ml
的X14菌液,20℃静置培养。实验结果表明:分别在第4,第6,第7天测量羊肚菌菌丝长度,结
果显示添加X14菌液,羊肚菌菌丝长度比对照增加了23.7‑28.8%。
个直径为10mm的羊肚菌圆形菌饼于原种培养基上,同时接种4‑5ml的X14菌液(即把X14菌株
接种在营养肉汤培养基中,在26℃振荡培养14h获得),16‑20℃静置培养。实验结果表明:在
原种瓶中添加X14菌液,培养5天羊肚菌菌丝长度没有显著性差异,培养10天后菌丝长度比
对照增加13.8%,培养11天菌丝发满瓶,培养17‑19天菌种成熟,菌核变成金黄色或浅褐色
颗粒,比对照提前5‑7天完成。
产。
0.05‑0.15g/L、氯化钠4.0‑6.0g/L。优选:蛋白胨10.0g/L、牛肉膏5.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡
萄糖5.0g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、氯化钠5.0g/L。
附图说明
具体实施方式:
‑2
荡30min,待样品分散后,静置5min,吸取0.5ml土壤悬液至4.5ml无菌水振荡混匀,得到10
‑6 ‑4 ‑5 ‑6
稀释度悬液,依次按10倍稀释法稀释至10 ,取10 ,10 ,10 三个梯度。
株。
肚菌菌丝生长有促进作用,其中X14菌株效果最显著(图1C)。
显示X14为短杆状或卵圆形(图2B)。提取菌株基因组总DNA,用细菌16S rDNA通用引物27F/
1492R扩增,将测序结果与GeneBank数据库中进行Blast比对,结果表明本发明菌株X14与恶
臭假单胞菌(Pseudomonas putida strain:MUFP69,GenBank:AB621834.1)16S rDNA的序列
同源性为99.58%,选取假单胞菌属的8个代表性菌种与X14一起构建系统发育进化树(图
2C),结果显示X14与恶臭假单胞菌进化关系最接近,结合生理生化特征试验结果(表1)初步
鉴定X14菌株为恶臭假单胞菌。于2020年04月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会
普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为:CGMCC No.19720,保藏单位地址:中国,北京,中科院
微生物研究所。
水分晾干后装入20x 200mm试管(每支试管装入20g麦粒),进行高温高压灭菌制作成麦粒试
管培养基;用打孔器接种直径为10mm的羊肚菌圆形菌饼1‑2个于麦粒培养基上,同时接种
1ml的X14菌液(对照CK为1ml灭菌的营养肉汤),20℃静置培养,分别在第4,第6,第7天测量
羊肚菌菌丝长度(图3B),结果显示添加X14菌液,羊肚菌菌丝长度比对照增加了23.7‑
28.8%(图3A)。
羊肚菌圆形菌饼于原种培养基上,同时接种4ml在营养肉汤培养基26℃振荡培养14h后获得
的X14菌液(对照CK为4ml灭菌的营养肉汤培养基),20℃静置培养,分别在第4和第8天测量
羊肚菌菌丝长度(图4B)。结果显示在原种瓶中添加X14菌液,培养5天羊肚菌菌丝长度没有
显著性差异,培养10天后比对照增加13.8%(图4A),培养11天菌丝发满瓶,培养17‑19天菌
种成熟,菌核变成金黄色或浅褐色颗粒,比对照提前5‑7天完成。
麦芽糖,OD600nm值为2.60‑2.76;以甘油为碳源时,X14生长菌液浓度最低,OD600nm值为2.22。
因此,选择葡萄糖作为培养基最佳碳源(图5A)。
OD600nm值为3.24;以蛋白胨+牛肉膏或蛋白胨+酵母膏作为氮源时,X14菌株浓度次之,OD600nm
值为2.73‑2.74;以蛋白胨、牛肉膏、酵母膏单独氮源或牛肉膏+酵母膏作为氮源时,X14菌株
浓度较低,OD600nm值为2.34‑2.41。因此,选择复合氮源(蛋白胨+牛肉膏+酵母膏)作为培养基
最佳氮源(图5B)。
X14菌株浓度最高,OD600nm值为3.12;以磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠作为无机盐组
分时,X14菌株浓度没有显著性差异,OD600nm值为2.60‑2.76。因此,选择磷酸氢二钾作为培养
基最佳无机盐(图5C)。
220rpm,pH 7.0条件下培养14h,与营养肉汤(NB)培养基比较,采用优化培养基菌体OD600nm值
提高28.2%(图5D)。