猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用转让专利
申请号 : CN202010407723.9
文献号 : CN111548987B
文献日 : 2021-07-09
发明人 : 周荣 , 吴珍芳 , 石俊松 , 罗绿花 , 麦然标 , 纪红美 , 余婉娴 , 蔡更元
申请人 : 温氏食品集团股份有限公司
摘要 :
本发明公开了一种猪卵母细胞体外成熟培养液。该培养液包括胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS、成纤维细胞生长因子FGF、白血病抑制因子LIF、肌醇。该培养液应用在卵母细胞体外成熟培养时，无需添加血清及卵泡液，更加安全、稳定、高效。
权利要求 :
1.猪卵母细胞体外成熟培养液，其中，所述的培养液组分为：以基础培养液TCM‑199为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L 、血清替代物的体积分数为5%、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10 IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.1‑1.5%、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为10‑
40ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为10‑40ng/mL、肌醇的质量浓度为1‑10μg/ml。
2.根据权利要求1所述的培养液，其中，所述的培养液组分为：以基础培养液TCM‑199为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L 、血清替代物的体积分数为5%、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10 IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.5%、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为40ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为20ng/mL、肌醇的质量浓度为5μg/ml。
3.根据权利要求1所述的培养液，其中，所述的培养液组分为：以基础培养液TCM‑199为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L 、血清替代物的体积分数为5%、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10 IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.1%、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为10ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为10ng/mL、肌醇的质量浓度为1μg/ml。
4.权利要求1‑3任一项所述的猪卵母细胞体外成熟培养液在猪体细胞克隆技术中的应用。
说明书 :
猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用。
背景技术
[0002] 随着胚胎移植、冷冻精液技术、克隆转基因技术的发展，卵母细胞需求量越来越大。由于利用猪的超数排卵技术所获得的卵母细胞或者胚胎数量是极其有限的，并不能满
足大量优质卵母细胞的需求，而且操作复杂、成本较高，所以体外成熟培养就显得尤为重
要。
足大量优质卵母细胞的需求，而且操作复杂、成本较高，所以体外成熟培养就显得尤为重
要。
[0003] 猪卵母细胞体外成熟是指从屠宰场直接采集废弃卵巢，取出未成熟的卵母细胞后，在体外模拟体内成熟环境来达到成熟的目的。现有的成熟培养体系中，一般是在基础培
养液中添加激素类，血清类，生长因子类或者其他小分子物质等达到最佳的体外培养条件。
猪卵母细胞常用的基础培养基有NCSU‑23和M199,其中M199已有商品化产品，可直接购买。
这些化学合成培养基具有适当的渗透压、能源物质、氨基酸、维生素、微量元素及缓冲pH值，
以满足卵母细胞体外培养最基本的需要。其他的添加成分需各个实验室根据自身的培养体
系来选择性添加。其中，血清含有丰富的营养物质，一般在培养体系中的添加量是10％。但
是由于其成份不确定性，想要观察一种生长因子对卵母细胞的作用时，这时很难排除血清
中生长因子的干扰作用。已有文章研究出血清的替代产物KSR，可直接购买。另外，猪的卵泡
液可以为卵母细胞成熟提供发育的微环境，一般在培养体系中的添加量是10％。能提供卵
母细胞生长所需要的激素、维生素、生长因子等营养因素，但是也有不利的方面。首先，因为
卵泡液通常是直接抽取从屠宰场采集卵巢的大卵泡所得，每一批次的卵巢质量是不一样
的，导致所获得的卵泡液质量也不一样。而且卵泡液中的许多成份随着卵母细胞的生长发
育起动态变化，对卵母细胞的成熟起正向或者负向调节作用。其次，猪卵泡液还是潜在的疾
病传染源，特别现在非洲猪瘟的常态下，使用屠宰场来源的卵泡液有很大的安全隐患。即使
使用前没有检测到非洲猪瘟病毒，可能是由于浓度过低没有检测到。一旦将胚胎移植到受
体母猪体内，病毒在体内增值，导致受体猪或周围群猪的感染，损失将是巨大的。
养液中添加激素类，血清类，生长因子类或者其他小分子物质等达到最佳的体外培养条件。
猪卵母细胞常用的基础培养基有NCSU‑23和M199,其中M199已有商品化产品，可直接购买。
这些化学合成培养基具有适当的渗透压、能源物质、氨基酸、维生素、微量元素及缓冲pH值，
以满足卵母细胞体外培养最基本的需要。其他的添加成分需各个实验室根据自身的培养体
系来选择性添加。其中，血清含有丰富的营养物质，一般在培养体系中的添加量是10％。但
是由于其成份不确定性，想要观察一种生长因子对卵母细胞的作用时，这时很难排除血清
中生长因子的干扰作用。已有文章研究出血清的替代产物KSR，可直接购买。另外，猪的卵泡
液可以为卵母细胞成熟提供发育的微环境，一般在培养体系中的添加量是10％。能提供卵
母细胞生长所需要的激素、维生素、生长因子等营养因素，但是也有不利的方面。首先，因为
卵泡液通常是直接抽取从屠宰场采集卵巢的大卵泡所得，每一批次的卵巢质量是不一样
的，导致所获得的卵泡液质量也不一样。而且卵泡液中的许多成份随着卵母细胞的生长发
育起动态变化，对卵母细胞的成熟起正向或者负向调节作用。其次，猪卵泡液还是潜在的疾
病传染源，特别现在非洲猪瘟的常态下，使用屠宰场来源的卵泡液有很大的安全隐患。即使
使用前没有检测到非洲猪瘟病毒，可能是由于浓度过低没有检测到。一旦将胚胎移植到受
体母猪体内，病毒在体内增值，导致受体猪或周围群猪的感染，损失将是巨大的。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种猪卵母细胞体外成熟培养液，以解决上述问题。
[0005] 根据本发明的一个方面，提供了猪卵母细胞体外成熟培养液，其包括胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS、成纤维细胞生长因子FGF、白血病抑制因子LIF、肌醇。
[0006] 在某些实施方式中，培养液中胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.1‑1.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为10‑80ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度
为10‑40ng/mL、培养液中肌醇的质量浓度为1‑10μg/ml。
为10‑40ng/mL、培养液中肌醇的质量浓度为1‑10μg/ml。
[0007] 在某些实施方式中，培养液包括：以基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L、血清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓
度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.1‑1.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为10‑80ng/mL、白血病抑制因子
LIF的质量浓度为10‑40ng/mL、肌醇的质量浓度为1‑10μg/ml。
度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.1‑1.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为10‑80ng/mL、白血病抑制因子
LIF的质量浓度为10‑40ng/mL、肌醇的质量浓度为1‑10μg/ml。
[0008] 在某些实施方式中，培养液包括：以基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L、血清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓
度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为40ng/mL、白血病抑制因子LIF的质
量浓度为20ng/mL、肌醇的质量浓度为5μg/ml。
度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为40ng/mL、白血病抑制因子LIF的质
量浓度为20ng/mL、肌醇的质量浓度为5μg/ml。
[0009] 在某些实施方式中，培养液包括：以基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L、血清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓
度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.1％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为10ng/mL、白血病抑制因子LIF的质
量浓度为10ng/mL、肌醇的质量浓度为1μg/ml。
度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.1％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为10ng/mL、白血病抑制因子LIF的质
量浓度为10ng/mL、肌醇的质量浓度为1μg/ml。
[0010] 在某些实施方式中，培养液包括：以基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L、血清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓
度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为1.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为80ng/mL、白血病抑制因子LIF的质
量浓度为40ng/mL、肌醇的质量浓度为10μg/ml。
度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为1.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为80ng/mL、白血病抑制因子LIF的质
量浓度为40ng/mL、肌醇的质量浓度为10μg/ml。
[0011] 在某些实施方式中，培养液包括：以基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L、血清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓
度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.8％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为50ng/mL、白血病抑制因子LIF的质
量浓度为25ng/mL、肌醇的质量浓度为8μg/ml。
度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.8％、成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为50ng/mL、白血病抑制因子LIF的质
量浓度为25ng/mL、肌醇的质量浓度为8μg/ml。
[0012] 在某些实施方式中，基础培养液为TCM‑199、NCSU‑37、NCSU‑23、Ham’s F10、CRI‑aa中的任一种。
[0013] 根据本发明的另一个方面，提供了一种猪卵母细胞体外成熟培养液在猪体细胞克隆技术中的应用。
[0014] 在某些实施方式中，用于体细胞克隆技术中的猪卵母细胞体外成熟培养液包括：体积分数为0.1‑1.5％胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS、质量浓度为10‑80ng/mL成纤维细胞生长
因子FGF、质量浓度为10‑40ng/mL白血病抑制因子LIF、质量浓度为1‑10μg/ml肌醇中。
因子FGF、质量浓度为10‑40ng/mL白血病抑制因子LIF、质量浓度为1‑10μg/ml肌醇中。
[0015] 在某些实施方式中，用于体细胞克隆技术中的猪卵母细胞体外成熟培养液包括：以基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L、血
清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓
度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为
10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.1‑1.5％、成纤维细胞生长因子FGF的
质量浓度为10‑80ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为10‑40ng/mL、肌醇的质量浓度为
1‑10μg/ml。
清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓
度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为
10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.1‑1.5％、成纤维细胞生长因子FGF的
质量浓度为10‑80ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为10‑40ng/mL、肌醇的质量浓度为
1‑10μg/ml。
[0016] 在某些实施方式中，用于体细胞克隆技术中的猪卵母细胞体外成熟培养液包括：以基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L、血
清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓
度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为
10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量
浓度为40ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为20ng/mL、肌醇的质量浓度为5μg/ml。
清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓
度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为
10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量
浓度为40ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为20ng/mL、肌醇的质量浓度为5μg/ml。
[0017] 在某些实施方式中，用于体细胞克隆技术中的猪卵母细胞体外成熟培养液包括：以基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L、血
清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓
度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为
10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.1％、成纤维细胞生长因子FGF的质量
浓度为10ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为10ng/mL、肌醇的质量浓度为1μg/ml。
清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓
度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为
10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.1％、成纤维细胞生长因子FGF的质量
浓度为10ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为10ng/mL、肌醇的质量浓度为1μg/ml。
[0018] 在某些实施方式中，用于体细胞克隆技术中的猪卵母细胞体外成熟培养液包括：以基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L、血
清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓
度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为
10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为1.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量
浓度为80ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为40ng/mL、肌醇的质量浓度为10μg/ml。
清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓
度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为
10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为1.5％、成纤维细胞生长因子FGF的质量
浓度为80ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为40ng/mL、肌醇的质量浓度为10μg/ml。
[0019] 在某些实施方式中，用于体细胞克隆技术中的猪卵母细胞体外成熟培养液包括：以基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L、血
清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓
度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为
10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.8％、成纤维细胞生长因子FGF的质量
浓度为50ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为25ng/mL、肌醇的质量浓度为8μg/ml。
清替代物的体积分数为5％、半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L、孕马血清促性腺激素PMSG的浓
度为10IU/mL、人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL、表皮生长因子EGF的质量浓度为
10ng/mL、胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体积分数为0.8％、成纤维细胞生长因子FGF的质量
浓度为50ng/mL、白血病抑制因子LIF的质量浓度为25ng/mL、肌醇的质量浓度为8μg/ml。
[0020] 本发明的有益效果：
[0021] 1、常规的猪卵母细胞成熟培养液中会添加10％PFF。很多研究表明培养液中添加卵泡液有益于猪卵母细胞的体外成熟。Algriany认为卵泡液是生长因子、促性腺激素、减数
分裂激活固醇的来源，这些都被证明与猪卵母细胞核成熟有关。但是由于卵泡液直接来源
于屠宰场收集的卵巢，收集方法是：用12号针头抽取卵巢上直径6‑8mm的卵泡液，离心后取
上清，0.22μm的滤膜过滤除菌，然后‑20℃冷冻保存备用。而非洲猪瘟病毒直径大约在
0.175‑0.215μm之间，使用这种方法无法做到有效滤除病毒。在这种非洲猪瘟的常态下，使
用卵泡液具有很大的安全隐患。本发明公开的方案，可以不用添加卵泡液，即可达到相当甚
至更好的培养效果，因而更加安全。
分裂激活固醇的来源，这些都被证明与猪卵母细胞核成熟有关。但是由于卵泡液直接来源
于屠宰场收集的卵巢，收集方法是：用12号针头抽取卵巢上直径6‑8mm的卵泡液，离心后取
上清，0.22μm的滤膜过滤除菌，然后‑20℃冷冻保存备用。而非洲猪瘟病毒直径大约在
0.175‑0.215μm之间，使用这种方法无法做到有效滤除病毒。在这种非洲猪瘟的常态下，使
用卵泡液具有很大的安全隐患。本发明公开的方案，可以不用添加卵泡液，即可达到相当甚
至更好的培养效果，因而更加安全。
[0022] 2、血清和卵泡液的成分复杂且不稳定，其中卵泡液的质量更不稳定。卵泡液通常是直接抽取从屠宰场采集卵巢的大卵泡所得，每一批次的卵巢质量是不一样的，导致所获
得的卵泡液质量也不一样。而且卵泡液中的许多成份随着卵母细胞的生长发育起动态变
化，对卵母细胞的成熟起正向或者负向调节作用。本发明公开的方案中，无需添加血清FBS，
也无需添加卵泡液PFF。因此，可以减少血清FBS及卵泡液对培养体系的影响。可使卵母细胞
体外成熟体系更加安全、更加稳定、更加标准化，也更加高效。而且，在卵母体外培养过程
中，可获得比传统添加卵泡液的培养液更高的成熟率。对获得的成熟卵母细胞做孤雌激活
和体细胞核移植后，体外培养能够获得更高的卵裂率和囊胚率。
得的卵泡液质量也不一样。而且卵泡液中的许多成份随着卵母细胞的生长发育起动态变
化，对卵母细胞的成熟起正向或者负向调节作用。本发明公开的方案中，无需添加血清FBS，
也无需添加卵泡液PFF。因此，可以减少血清FBS及卵泡液对培养体系的影响。可使卵母细胞
体外成熟体系更加安全、更加稳定、更加标准化，也更加高效。而且，在卵母体外培养过程
中，可获得比传统添加卵泡液的培养液更高的成熟率。对获得的成熟卵母细胞做孤雌激活
和体细胞核移植后，体外培养能够获得更高的卵裂率和囊胚率。
[0023] 3、本发明培养液中添加的物质成分明确，性质稳定，能精确定量，对于体外卵母细胞的成熟培养及研究，及其在体细胞克隆技术上的应用，都有极其重要的意义。
附图说明
[0024] 图1为对照组培养液囊胚在荧光显微镜下观察发育至第6天的核移植猪囊胚内总细胞数；
[0025] 图2为实验组培养液囊胚在荧光显微镜下观察发育至第6天的核移植猪囊胚内总细胞数。
具体实施方式
[0026] 实验研究所用试剂未经特殊说明均购自SIGMA公司。卵母细胞成熟、胚胎培养耗材为NUNC公司产品。洗卵液为DPBS+PVA液,操作液为无钙的H‑NCSU‑23，卵母细胞培养液以
TCM‑199为基础培养液，胚胎培养液为PZM‑3。
TCM‑199为基础培养液，胚胎培养液为PZM‑3。
[0027] 实施例一
[0028] 一、卵母细胞成熟培养液的配法
[0029] 对照组培养液(现有技术采用的卵母细胞成熟培养液)配方：以TCM‑199基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L，血清FBS的体
积分数为10％，卵泡液PFF的体积分数为10％，半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L，孕马血清促
性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL，表皮生长因子
EGF的质量浓度为10ng/mL。
积分数为10％，卵泡液PFF的体积分数为10％，半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L，孕马血清促
性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL，表皮生长因子
EGF的质量浓度为10ng/mL。
[0030] 实验组培养液配方：以TCM‑199基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L,血清替代物的体积分数为5％，半胱氨酸的浓
度为0.57mmol/L，孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL，表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL，胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.5％,成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为40ng/mL，LIF的质量浓度为20ng/
mL,肌醇的质量浓度为5μg/ml。
度为0.57mmol/L，孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL，表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL，胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.5％,成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为40ng/mL，LIF的质量浓度为20ng/
mL,肌醇的质量浓度为5μg/ml。
[0031] 以下步骤中，实验组和对照组至少设计三个平行组试验，进行数据统计分析。
[0032] 二、卵母细胞的收集
[0033] 猪卵巢采至广州白云屠宰场，用剪刀去除输卵管等组织后将卵巢置于含抗生素的37℃生理盐水中，用保温瓶3h内运回实验室。用含抗生素的生理盐水冲洗3‑5次后，用配有
18G针头的10mL注射器抽取直径为2mm～6mm的卵泡。在体视显微镜下用自制捡卵针捡取胞
质完整及包裹3层以上卵丘细胞的卵丘‑卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes，
COCs)。用洗卵液冲洗3次，再用成熟培养液冲洗2次，然后放入已在二氧化碳培养箱内平衡
4h以上的成熟培养液(分为对照组和实验组)中。在39℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中成熟
培养42h～44h。
18G针头的10mL注射器抽取直径为2mm～6mm的卵泡。在体视显微镜下用自制捡卵针捡取胞
质完整及包裹3层以上卵丘细胞的卵丘‑卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes，
COCs)。用洗卵液冲洗3次，再用成熟培养液冲洗2次，然后放入已在二氧化碳培养箱内平衡
4h以上的成熟培养液(分为对照组和实验组)中。在39℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中成熟
培养42h～44h。
[0034] 三、获得有极体的成熟卵母细胞
[0035] 向含有1mg/ml透明质酸酶的尖底离心管中加入已成熟42h～44h的卵母细胞，移液器反复吹吸去周围卵丘细胞。用操作液将卵母细胞清洗干净后，在体视显微镜下用圆头玻
璃针将胞质均匀、第一极体排出为成熟标志的卵母细胞挑出，放到操作液滴中备用。
璃针将胞质均匀、第一极体排出为成熟标志的卵母细胞挑出，放到操作液滴中备用。
[0036] 四、成熟卵母细胞的孤雌激活
[0037] 将挑选好的成熟卵母细胞先在融合激活液(0.25mol/L Mannitol，0.1mmol/L CaCl2·2H2O，0.1mmol/L Mg‑Cl2·6H2O，0.5mmol/L HEPES，0.01％PVA(w/v))中静置2min，
再移到融合槽中进行孤雌激活。激活后用含5μg/mL CB+10μg/mL CHX的辅助激活液处理4h，
在胚胎培养液PZM‑3中，39℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养6d。作为孤雌激活胚胎，排
除了精子及受精过程、核移植操作过程对于胚胎质量的影响，所以孤雌激活胚胎的发育质
量相对于体外受精胚和核移植操作胚，操作步骤少，影响条件单一，只与卵母细胞质量有
关，通过孤雌激活胚胎的发育率，比较能衡量出卵母细胞的成熟质量问题。
再移到融合槽中进行孤雌激活。激活后用含5μg/mL CB+10μg/mL CHX的辅助激活液处理4h，
在胚胎培养液PZM‑3中，39℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养6d。作为孤雌激活胚胎，排
除了精子及受精过程、核移植操作过程对于胚胎质量的影响，所以孤雌激活胚胎的发育质
量相对于体外受精胚和核移植操作胚，操作步骤少，影响条件单一，只与卵母细胞质量有
关，通过孤雌激活胚胎的发育率，比较能衡量出卵母细胞的成熟质量问题。
[0038] 五、成熟卵母细胞的克隆胚胎生产
[0039] 供体细胞的准备：采集猪耳样，经含有双抗的生理盐水冲洗，保存到含双抗的DMEM培养液中，用冰盒带回实验室。耳样按照常规体细胞建系方法建立成纤维细胞系，冷冻保
存。在做核移植操作前1‑2周，将供体细胞复苏培养。将传代至3‑6代的成纤维细胞培养至
100％汇合，再接触抑制2天后，常规消化，离心洗涤，最后用操作液将细胞沉淀重悬，用作核
供体。
存。在做核移植操作前1‑2周，将供体细胞复苏培养。将传代至3‑6代的成纤维细胞培养至
100％汇合，再接触抑制2天后，常规消化，离心洗涤，最后用操作液将细胞沉淀重悬，用作核
供体。
[0040] 去核及注核：采用盲吸去核法构建体细胞克隆胚胎(重构胚)：在显微操作仪用固定针将卵母细胞固定，去核针拨动使极体处于5点钟位置，用去核针把卵母细胞内的极体及
附近1/3胞质去除并将体细胞注进透明带内，使其与胞质紧密贴近。
附近1/3胞质去除并将体细胞注进透明带内，使其与胞质紧密贴近。
[0041] 融合与激活：将构建好的重构胚分批转移到融合激活液中(0.25mol/L Mannitol，0.1mmol/L CaCl2·2H2O，0.1mmol/L Mg‑Cl2·6H2O，0.5mmol/L HEPES，0.01％PVA(w/v))
平衡2min，用融合激活液洗涤3遍后，每批15‑20个重构胚放入已经铺满融合激活液的融合
槽内，用拉制的很细的实心玻璃针拨动重组胚，使供体细胞‑受体卵细胞膜接触面与电极平
行，施加直流电脉冲诱导融合同时激活，接着胚胎培养液PZM‑3洗涤3遍，立即转入含5μg/mL
CB+10μg/mL CHX的辅助激活液中处理4h。
平衡2min，用融合激活液洗涤3遍后，每批15‑20个重构胚放入已经铺满融合激活液的融合
槽内，用拉制的很细的实心玻璃针拨动重组胚，使供体细胞‑受体卵细胞膜接触面与电极平
行，施加直流电脉冲诱导融合同时激活，接着胚胎培养液PZM‑3洗涤3遍，立即转入含5μg/mL
CB+10μg/mL CHX的辅助激活液中处理4h。
[0042] 体外培养：对判定已经融合的重构胚，用胚胎培养液PZM‑3洗涤3遍后，然后放入已在二氧化碳培养箱内平衡4h以上的PZM‑3培养液中。在39℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中
培养168h。
培养168h。
[0043] 六、重构胚的体外发育观察
[0044] 胚胎培养至48h和144h时记录卵裂数和囊胚数。同时对囊胚染色记录囊胚细胞数，因为囊胚细胞数是反映囊胚优劣的一个必要条件。具体方法为：取出第6d的囊胚，在含有
3.7％多聚甲醛的DPBS中洗涤2遍后固定10min，将固定好的囊胚转移到含10μg/ml的
Hoechst33342的DPBS中避光染色5min，将好的囊胚用操作液洗3遍，转移到载玻片上，再轻
轻压盖玻片。然后在Olympus荧光显微镜下紫外光激发下观察拍照，细胞计数。
3.7％多聚甲醛的DPBS中洗涤2遍后固定10min，将固定好的囊胚转移到含10μg/ml的
Hoechst33342的DPBS中避光染色5min，将好的囊胚用操作液洗3遍，转移到载玻片上，再轻
轻压盖玻片。然后在Olympus荧光显微镜下紫外光激发下观察拍照，细胞计数。
[0045] 七、数据处理
[0046] 使用SPSS16.0统计软件，对卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率进行t检验统计分析，数据以均值±标准误表示，P＜0.05为差异显著。
[0047] 八、结果分析
[0048] 8.1对照组配方和实验组配方对卵母细胞成熟率的影响
[0049]组别 培养卵母细胞总数 成熟卵母细胞数 成熟率(％)
a
对照组 1273 790 62.79±0.32
b
实验组 1211 885 74.37±0.13
a
对照组 1273 790 62.79±0.32
b
实验组 1211 885 74.37±0.13
[0050] 备注：在同一列内有不同上标字母的表示差异显著(P＜0.05)，下同。
[0051] 8.2对照组配方和实验组配方的成熟卵孤雌激活效率
[0052]组别 培养孤雌胚胎总数 卵裂数 囊胚数 卵裂率(％) 囊胚率(％)
a a
对照组 195 170 100 84.24±0.51 45.37±0.10
b b
实验组 260 246 140 91.52±0.49 49.68±0.67
a a
对照组 195 170 100 84.24±0.51 45.37±0.10
b b
实验组 260 246 140 91.52±0.49 49.68±0.67
[0053] 8.3对照组配方和实验组配方的成熟卵克隆胚胎发育效率
[0054]
[0055] 综上，通过多次重复实验，结果表明，实施例一实验组配方能显著提高猪卵母细胞体外成熟率。对所得到的成熟卵母细胞做孤雌激活，卵裂率和囊胚率均高于对照组，且差异
显著。核移植胚胎卵裂率和囊胚率均高于对照组，细胞数也优于对照组，且差异显著。所以，
这个实验组配方液完全可以用于猪卵母细胞的体外成熟培养，培养液体系体系更加安全、
稳定和高效，并且获得的成熟卵母细胞具有更好的发育潜能。
显著。核移植胚胎卵裂率和囊胚率均高于对照组，细胞数也优于对照组，且差异显著。所以，
这个实验组配方液完全可以用于猪卵母细胞的体外成熟培养，培养液体系体系更加安全、
稳定和高效，并且获得的成熟卵母细胞具有更好的发育潜能。
[0056] 实施例二
[0057] 一、卵母细胞成熟培养液的配法
[0058] 对照组培养液(现有技术采用的卵母细胞成熟培养液)配方：以TCM‑199基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L，血清FBS的体
积分数为10％，卵泡液PFF的体积分数为10％，半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L，孕马血清促
性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL，表皮生长因子
EGF的质量浓度为10ng/mL。
积分数为10％，卵泡液PFF的体积分数为10％，半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L，孕马血清促
性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL，表皮生长因子
EGF的质量浓度为10ng/mL。
[0059] 实验组培养液配方：以TCM‑199基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L,血清替代物的体积分数为5％，半胱氨酸的浓
度为0.57mmol/L，孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL，表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL，胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.1％,成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为10ng/mL，LIF的质量浓度为10ng/
mL,肌醇的质量浓度为1μg/ml。
度为0.57mmol/L，孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL，表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL，胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.1％,成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为10ng/mL，LIF的质量浓度为10ng/
mL,肌醇的质量浓度为1μg/ml。
[0060] 以下步骤中，实验组和对照组至少设计三个平行组试验，进行数据统计分析。
[0061] 其他步骤，参考实施例一中步骤二至七。
[0062] 八、结果分析
[0063] 8.1对照组配方和实验组配方对卵母细胞成熟率的影响
[0064]
[0065] 8.2对照组配方和实验组配方的成熟卵孤雌激活效率
[0066]组别 培养孤雌胚胎总数 卵裂数 囊胚数 卵裂率(％) 囊胚率(％)
a a
对照组 202 178 108 85.62±0.61 48.24±0.19
b b
实验组 210 200 115 93.12±0.38 52.11±0.52
a a
对照组 202 178 108 85.62±0.61 48.24±0.19
b b
实验组 210 200 115 93.12±0.38 52.11±0.52
[0067] 8.3对照组配方和实验组配方的成熟卵克隆胚胎发育效率
[0068]
[0069] 综上，通过多次重复实验，结果表明，实施例二实验组配方能显著提高猪卵母细胞体外成熟率。对所得到的成熟卵母细胞做孤雌激活，卵裂率和囊胚率均高于对照组，且差异
显著。核移植胚胎卵裂率和囊胚率均高于对照组，细胞数也优于对照组，且差异显著。所以，
这个实验组配方液完全可以用于猪卵母细胞的体外成熟培养，培养液体系体系更加安全、
稳定和高效，并且获得的成熟卵母细胞具有更好的发育潜能。
显著。核移植胚胎卵裂率和囊胚率均高于对照组，细胞数也优于对照组，且差异显著。所以，
这个实验组配方液完全可以用于猪卵母细胞的体外成熟培养，培养液体系体系更加安全、
稳定和高效，并且获得的成熟卵母细胞具有更好的发育潜能。
[0070] 实施例三
[0071] 一、卵母细胞成熟培养液的配法
[0072] 对照组培养液(现有技术采用的卵母细胞成熟培养液)配方：以TCM‑199基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L，血清FBS的体
积分数为10％，卵泡液PFF的体积分数为10％，半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L，孕马血清促
性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL，表皮生长因子
EGF的质量浓度为10ng/mL。
积分数为10％，卵泡液PFF的体积分数为10％，半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L，孕马血清促
性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL，表皮生长因子
EGF的质量浓度为10ng/mL。
[0073] 实验组培养液配方：以TCM‑199基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L,血清替代物的体积分数为5％，半胱氨酸的浓
度为0.57mmol/L，孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL，表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL，胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.8％,成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为50ng/mL，LIF的质量浓度为25ng/
mL,肌醇的质量浓度为8μg/ml。
度为0.57mmol/L，孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL，表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL，胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为0.8％,成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为50ng/mL，LIF的质量浓度为25ng/
mL,肌醇的质量浓度为8μg/ml。
[0074] 以下步骤中，实验组和对照组至少设计三个平行组试验，进行数据统计分析。
[0075] 其他步骤，参考实施例一中步骤二至七。
[0076] 八、结果分析
[0077] 8.1对照组配方和实验组配方对卵母细胞成熟率的影响
[0078]
[0079] 8.2对照组配方和实验组配方的成熟卵孤雌激活效率
[0080]组别 培养孤雌胚胎总数 卵裂数 囊胚数 卵裂率(％) 囊胚率(％)
a a
对照组 201 175 103 84.92±0.46 47.99±0.31
b b
实验组 208 199 118 95.02±0.27 55.32±0.19
a a
对照组 201 175 103 84.92±0.46 47.99±0.31
b b
实验组 208 199 118 95.02±0.27 55.32±0.19
[0081] 8.3对照组配方和实验组配方的成熟卵克隆胚胎发育效率
[0082]
[0083] 综上，通过多次重复实验，结果表明，实施例三实验组配方能显著提高猪卵母细胞体外成熟率。对所得到的成熟卵母细胞做孤雌激活，卵裂率和囊胚率均高于对照组，且差异
显著。核移植胚胎卵裂率和囊胚率均高于对照组，细胞数也优于对照组，且差异显著。所以，
这个实验组配方液完全可以用于猪卵母细胞的体外成熟培养，培养液体系体系更加安全、
稳定和高效，并且获得的成熟卵母细胞具有更好的发育潜能。
显著。核移植胚胎卵裂率和囊胚率均高于对照组，细胞数也优于对照组，且差异显著。所以，
这个实验组配方液完全可以用于猪卵母细胞的体外成熟培养，培养液体系体系更加安全、
稳定和高效，并且获得的成熟卵母细胞具有更好的发育潜能。
[0084] 实施例四
[0085] 一、卵母细胞成熟培养液的配法
[0086] 对照组培养液(现有技术采用的卵母细胞成熟培养液)配方：以TCM‑199基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L，血清FBS的体
积分数为10％，卵泡液PFF的体积分数为10％，半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L，孕马血清促
性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL，表皮生长因子
EGF的质量浓度为10ng/mL。
积分数为10％，卵泡液PFF的体积分数为10％，半胱氨酸的浓度为0.57mmol/L，孕马血清促
性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的浓度为10IU/mL，表皮生长因子
EGF的质量浓度为10ng/mL。
[0087] 实验组培养液配方：以TCM‑199基础培养液为基准计，碳酸氢钠的浓度为1.99mmol/L、丙酮酸钠的浓度为0.91mmol/L,血清替代物的体积分数为5％，半胱氨酸的浓
度为0.57mmol/L，孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL，表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL，胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为1.5％,成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为80ng/mL，LIF的质量浓度为40ng/
mL,肌醇的质量浓度为10μg/ml。
度为0.57mmol/L，孕马血清促性腺激素PMSG的浓度为10IU/mL，人绒毛膜促性腺激素HCG的
浓度为10IU/mL，表皮生长因子EGF的质量浓度为10ng/mL，胰岛素转铁蛋白硒溶液ITS的体
积分数为1.5％,成纤维细胞生长因子FGF的质量浓度为80ng/mL，LIF的质量浓度为40ng/
mL,肌醇的质量浓度为10μg/ml。
[0088] 以下步骤中，实验组和对照组至少设计三个平行组试验，进行数据统计分析。
[0089] 其他步骤，参考实施例一中步骤二至七。
[0090] 八、结果分析
[0091] 8.1对照组配方和实验组配方对卵母细胞成熟率的影响
[0092]组别 培养卵母细胞总数 成熟卵母细胞数 成熟率(％)
a
对照组 1155 705 61.03±0.82
b
实验组 1108 820 73.05±0.29
a
对照组 1155 705 61.03±0.82
b
实验组 1108 820 73.05±0.29
[0093] 8.2对照组配方和实验组配方的成熟卵孤雌激活效率
[0094]组别 培养孤雌胚胎总数 卵裂数 囊胚数 卵裂率(％) 囊胚率(％)
a a
对照组 190 160 88 83.99±0.21 45.88±0.13
b b
实验组 185 168 95 91.23±0.72 50.12±0.82
a a
对照组 190 160 88 83.99±0.21 45.88±0.13
b b
实验组 185 168 95 91.23±0.72 50.12±0.82
[0095] 8.3对照组配方和实验组配方的成熟卵克隆胚胎发育效率
[0096] 组别 培养核移植胚胎总数 卵裂数 囊胚数 卵裂率(％) 囊胚率(％) 囊胚总细胞数对照组 502 377 91 75.12a±0.77 18.03a±0.28 41.29a±3.19
实验组 508 416 123 83.10b±0.91 24.39b±0.93 49.98b±1.29
实验组 508 416 123 83.10b±0.91 24.39b±0.93 49.98b±1.29
[0097] 综上，通过多次重复实验，结果表明，实施例四实验组配方能显著提高猪卵母细胞体外成熟率。对所得到的成熟卵母细胞做孤雌激活，卵裂率和囊胚率均高于对照组，且差异
显著。核移植胚胎卵裂率和囊胚率均高于对照组，细胞数也优于对照组，且差异显著。所以，
这个实验组配方液完全可以用于猪卵母细胞的体外成熟培养，培养液体系更加安全、稳定
和高效，并且获得的成熟卵母细胞具有更好的发育潜能。
显著。核移植胚胎卵裂率和囊胚率均高于对照组，细胞数也优于对照组，且差异显著。所以，
这个实验组配方液完全可以用于猪卵母细胞的体外成熟培养，培养液体系更加安全、稳定
和高效，并且获得的成熟卵母细胞具有更好的发育潜能。
[0098] 以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。