一种快速准确检测新型冠状病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法

摘要

本发明实施例涉及临床体外检测，具体涉及一种快速准确检测新型冠状病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法。本发明提供的试剂盒包括：辣根过氧化物酶标记的新型冠状病毒抗原；和，偶联有抗人IgM抗体的磁微粒；所述新型冠状病毒抗原包括来源于新型冠状病毒N蛋白的N蛋白抗原和来源于新型冠状病毒S蛋白的S蛋白抗原。本发明提供的试剂盒以新冠病毒IgM抗体作为检测对象，有助于对患者进行早期辅助诊断；其将N蛋白和S蛋白片段共同作为抗原联合使用，可在不影响特异性的基础上，提高相关产品的灵敏度；可与核酸检测形成互补，提高新冠肺炎检出率；且其阳性检出率明显高于市场在售同类新冠病毒IgM检测产品，可更准确地服务于体外诊断领域。

权利要求

1.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：

辣根过氧化物酶标记的新型冠状病毒抗原；

和，偶联有鼠抗人IgM抗体的磁微粒；所述鼠抗人IgM抗体为武汉奥科博泰生物科技有限公司，货号为A0041；

所述新型冠状病毒抗原包括来源于新型冠状病毒N蛋白的N蛋白抗原和来源于新型冠状病毒S蛋白的S蛋白抗原；

所述N蛋白抗原为新型冠状病毒N蛋白，所述S蛋白抗原为新型冠状病毒S蛋白片段；所述S蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述N蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

新型冠状病毒抗原中N蛋白抗原和S蛋白抗原的质量比为1：2。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

编码N蛋白抗原的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

和/或，编码S蛋白抗原的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：发光底物液A、发光底物液B、样品稀释液、酶标工作液、校准品和磁珠悬浮液；

其中，酶标工作液包括所述辣根过氧化物酶标记的新型冠状病毒抗原；

磁珠悬浮液包括所述偶联有鼠抗人IgM抗体的磁微粒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：酶标工作液包括下述终浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的N蛋白抗原0.3-1.0mg/L，辣根过氧化物酶标记的S蛋白抗原0.8-

1.5mg/L，磷酸二氢钠0.05-0.4g/L，磷酸氢二钠2.0-4.0g/L，氨基比林0.2-1.5g/L，ProCLin300 0.1-1.0ml/L，酪蛋白1.0-4.0g/L；

和/或，磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有鼠抗人IgM抗体的磁微粒0.2-2g/L，其中，1g磁微粒上偶联有1-2g的鼠抗人IgM抗体。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：发光底物液A包括下述终浓度的组分：三羟甲基氨基甲烷0.01-0.05g/L，盐酸0.002-0.01ml/L，鲁米诺0.001-0.007g/L；

和/或，发光底物液B包括下述终浓度的组分：磷酸二氢钠0.1-0.5g/L，磷酸氢二钠2.0-

4.0g/L，过氧化脲0.002-0.05g/L，氯化钠3-15g/L；

和/或，样品稀释液包括下述终浓度的组分：牛血清白蛋白8-15g/L，氯化钠5-12g/L，ProCLin300 0.1-1ml/L；

和/或，校准品包括下述终浓度的组分：抗新型冠状病毒抗体160AU/mL。

说明书

一种快速准确检测新型冠状病毒IgM抗体的试剂盒及其制备

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及临床体外检测，具体涉及一种快速准确检测新型冠状病毒IgM抗体的试 剂盒及其制备方法。

背景技术

[0002] 2019新型冠状病毒(2019Novel Coronavirus，2019-nCoV)引起新型冠状病毒肺炎 (COVID-19)。核酸检测被推荐为新冠肺炎的主要确诊手段。但在临床实践中，核酸检 测可能受样本采集部位、采集方法、病程等因素的影响而出现假阴性结果。且由于核酸 检测对检测环境和人员的要求较高，也为疾控中心和医院带来很大挑战。因此，建立快 速、准确、简便、安全、有效的新冠病毒特异性检测方法具有重要意义。

[0003] 2019-nCoV属于β冠状病毒属，其基因组为一长约29kb的正单链RNA。其基因组 可编码至少四种病毒结构蛋白，分别为刺突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(Membrane，M)， 包膜蛋白(Envelop，E)以及核蛋白(Nucleocapsid，N)。

[0004] 公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当 被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

[0005] 发明目的

[0006] 为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种快速准确检测新型冠状病毒IgM 抗体的试剂盒及其制备方法。本发明采用捕获法定性检测人血清或血浆中的新型冠状病 毒IgM抗体，用抗人IgM抗体标记磁微粒，辣根过氧化物酶标记新型冠状病毒抗原制备 酶结合物，通过免疫反应形成固相二抗-抗体-酶标抗原复合物，该复合物催化发光底物 发出光子，发光强度与新型冠状病毒IgM抗体的含量成正比。

[0007] 本发明实施例中提供的试剂盒，以新冠病毒IgM抗体作为检测对象，IgM阳性提示急 性期感染，因此，IgM抗体检测有助于对患者进行早期辅助诊断。本发明实施例提供的 试剂盒中，将新型冠状病毒的N蛋白和S蛋白片段共同作为抗原，二者联合使用可以在不 影响特异性的基础上，提高相关产品的灵敏度。通过对部分临床已确诊为新型冠状病毒 感染的患者的血样进行复检，本发明实施例提供的新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒能 检出相当部分(IgM)阳性，提示可与核酸检测形成互补，提高新冠肺炎检出率。并且， 本发明试剂盒的阳性检出率明显高于市场在售同类新冠病毒IgM检测产品，提示本发明 的试剂盒可以更加准确地服务于体外诊断领域。

[0008] 解决方案

[0009] 为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：

[0010] 辣根过氧化物酶标记的新型冠状病毒抗原；

[0011] 和，偶联有抗人IgM抗体的磁微粒；

[0012] 所述新型冠状病毒抗原包括来源于新型冠状病毒N蛋白的N蛋白抗原和来源于新型 冠状病毒S蛋白的S蛋白抗原。所述新型冠状病毒指2019新型冠状病毒(2019 Novel Coronavirus，2019-nCoV)。

[0013] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，抗人IgM抗体包括鼠抗人IgM抗体或羊抗人 IgM抗体中的一种或多种；可选地，抗人IgM抗体为鼠抗人IgM抗体。

[0014] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述N蛋白抗原包括新型冠状病毒N蛋白或 新型冠状病毒N蛋白片段；可选地，所述N蛋白抗原为新型冠状病毒N蛋白。

[0015] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述N蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

[0016] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，编码N蛋白抗原的基因序列如SEQ ID NO.2 所示。

[0017] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述S蛋白抗原包括新型冠状病毒S蛋白或新 型冠状病毒S蛋白片段；可选地，所述S蛋白抗原为新型冠状病毒S蛋白片段。

[0018] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述S蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.3 所示。SEQ ID NO.3所示的序列为新型冠状病毒S蛋白氨基酸序列的340-650区域，该区 域为S蛋白的受体结合域，富含B细胞表位，用作抗原，特异性好。

[0019] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，编码S蛋白抗原的基因序列如SEQ ID NO.4 所示。

[0020] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，新型冠状病毒抗原中N蛋白抗原和S蛋白抗 原的质量比为1-5：1-5；可选地为1：2。

[0021] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述试剂盒包括：发光底物液A、发光底物 液B、样品稀释液、酶标工作液、校准品和磁珠悬浮液；

[0022] 其中，酶标工作液包括所述辣根过氧化物酶标记的新型冠状病毒抗原；

[0023] 磁珠悬浮液包括所述偶联有抗人IgM抗体的磁微粒。

[0024] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，发光底物液A包括下述组分：Tris(三羟甲基 氨基甲烷)，盐酸和鲁米诺；可选地，发光底物液A包括下述终浓度的组分：Tris 0.01- 0.05g/L，盐酸0.002-0.01ml/L，鲁米诺0.001-0.007g/L；进一步可选地，发光底物液A包 括下述终浓度的组分：Tris 0.02g/L，盐酸0.006ml/L，鲁米诺0.003g/L。

[0025] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，发光底物液B包括下述组分：磷酸二氢钠， 磷酸氢二钠，过氧化脲和氯化钠；可选地，发光底物液B包括下述终浓度的组分：磷酸 二氢钠0.1-0.5g/L，磷酸氢二钠2.0-4.0g/L，过氧化脲0.002-0.05g/L，氯化钠3-15g/L； 进一步可选地，发光底物液B包括下述终浓度的组分：磷酸二氢钠0.2g/L，磷酸氢二钠 2.9g/L，过氧化脲0.01g/L，氯化钠9g/L。

[0026] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，样品稀释液包括下述组分：BSA(牛血清白 蛋白)，氯化钠和ProCLin300；可选地，样品稀释液包括下述终浓度的组分：BSA(牛血 清白蛋白)8-15g/L，氯化钠5-12g/L，ProCLin300 0.1-1ml/L；进一步可选地，样品稀 释液包括下述终浓度的组分：BSA(牛血清白蛋白)10g/L，氯化钠9g/L，ProCLin300 0.5ml/L。

[0027] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，酶标工作液包括下述组分：所述辣根过氧化 物酶标记的新型冠状病毒抗原(nCov-Ag-HRP)，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，氨基比林， ProCLin300和CaSein(酪蛋白)；可选地，酶标工作液包括下述终浓度的组分：所述辣 根过氧化物酶标记的N蛋白抗原(nCov-NAg-HRP)0.3-1.0mg/L，所述辣根过氧化物酶 标记的S蛋白抗原(nCov-SAg-HRP)0.8-1.5mg/L，磷酸二氢钠0.05-0.4g/L，磷酸氢二 钠2.0-4.0g/L，氨基比林0.2-1.5g/L，ProCLin300 0.1-1.0ml/L，CaSein(酪蛋白)1.0-4.0g/L； 进一步可选地，酶标工作液包括下述终浓度的组分：所述辣根过氧化物酶标记的N蛋白 抗原0.5mg/L，所述辣根过氧化物酶标记的S蛋白抗原1.0mg/L，磷酸二氢钠0.2g/L，磷 酸氢二钠2.9g/L，氨基比林1g/L，ProCLin300 0.5ml/L，CaSein(酪蛋白)2.5g/L。

[0028] 本领域通用的辣根过氧化物酶标记的新型冠状病毒抗原的标记比例为1mgHRP上 标记1mg新型冠状病毒抗原。本发明试剂盒中，nCov-Ag-HRP的终浓度以新冠病毒抗原 的质量计，即“nCov-NAg-HRP 0.3-1.0mg/L”指以N蛋白抗原的质量计，酶标工作液中nCov-NAg-HRP的终浓度为0.3-1.0mg/L；“nCov-SAg-HRP 0.8-1.5mg/L”同理。

[0029] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，校准品包括：抗新型冠状病毒抗体；可选地， 校准品包括下述终浓度的组分：抗新型冠状病毒抗体160AU/mL。本发明中，所用校准 品为人源性血清。

[0030] 上述试剂盒在一种可能的实现方式中，磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有 抗人IgM抗体的磁微粒(以磁微粒的质量计)0.2-2g/L，其中，1g磁微粒上偶联有1-2g 的抗人IgM抗体；可选地，磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有抗人IgM抗体的磁 微粒(以磁微粒的质量计)1g/L，其中，1g磁微粒上偶联有1.5g的抗人IgM抗体。

[0031] 本发明实施例还提供了利用上述试剂盒的组分制备新型冠状病毒检测试剂盒的制 备方法。

[0032] 上述制备方法在一种可能的实现方式中，发光底物液A的制备方法包括下述步骤： 称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；

[0033] 发光底物液B的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容， 即得；

[0034] 样品稀释液的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即 得；

[0035] 酶标工作液的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即 得。

[0036] 上述制备方法在一种可能的实现方式中，磁珠悬浮液的制备方法包括下述步骤：称 取磁微粒，用碳二亚胺(EDC)活化，加入抗人IgM抗体，混悬，清洗，定容。

[0037] 本发明实施例还提供了上述试剂盒的使用方法，所述使用方法包括下述步骤：

[0038] 将校准品梯度稀释；在全自动化学发光仪的反应杯中，每孔分别加入样品稀释液， 校准品或待测样本，磁微粒悬浮液，酶标工作液，发光底物液A和发光底物液B；检测发 光强度，输出检测结果；

[0039] 计算：以校准品发光强度RLU值建立定标曲线，将待测样本的RLU值代入定标曲线 中计算待测样本中新型冠状病毒IgM抗体的含量。

[0040] 有益效果

[0041] (1)本发明实施例中提供的试剂盒，以新冠病毒IgM抗体作为检测对象，IgM阳性提 示急性期感染，因此，IgM抗体检测有助于对患者进行早期辅助诊断。临床免疫学机理 表明，病原体感染机体后能诱导宿主产生体液免疫/细胞免疫应答。免疫球蛋白(即抗体) 作为体液免疫应答中的关键组成部分，主要包括IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等。IgM是初 次免疫应答中最早出现的抗体，亲和力较低，持续时间较短，检出率低于IgG和IgA抗体， 但IgM阳性提示急性期感染。因此，对于新冠病毒感染患者来讲，IgM抗体检测有助于对 患者进行早期辅助诊断。

[0042] 此外，新型冠状病毒N蛋白为核蛋白，是病毒体含量最丰富的结构蛋白，其刺激机 体产生抗体应答能力强，使用此蛋白抗原用于检测时，灵敏度高。新型冠状病毒S蛋白 为主要的跨膜糖蛋白，在受体结合和病毒入胞过程中发挥关键作用，其结构中拥有受体 结合区域(Receptor-binding Region，RBD)，使用此蛋白作为抗原，特异性好。本发明 实施例提供的试剂盒中，将新型冠状病毒的N蛋白和S蛋白片段共同作为抗原，二者联合 使用可以在不影响特异性的基础上，提高相关产品的灵敏度。

[0043] 并且，核酸检测可能受样本采集部位、采集方法、病程等因素的影响而出现假阴性 结果；且核酸检测对检测设备和人员的要求较高。通过对部分临床已确诊为新型冠状病 毒感染的患者的血样进行复检，本发明实施例提供的新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒 能检出相当部分(IgM)阳性，提示可与核酸检测形成互补，提高新冠肺炎检出率。

[0044] (2)本发明实施例中提供的试剂盒，对N蛋白抗原和S蛋白抗原进行了特定选择，特 定选出的N蛋白抗原和特定选出的S蛋白抗原联合使用，进一步提高了试剂盒的检出率、 灵敏度和特异性。

[0045] 此外，本发明对N蛋白和S蛋白片段联用时二者的比例和浓度作了进一步选择。冠状 病毒的核衣壳蛋白(N端)在冠状病毒家族中高度保守，2019-nCoV和其它冠状病毒的N 蛋白之间可能存在交叉反应，因此，N蛋白抗原用量太大时，可能与其它冠状病毒产生 交叉出现假阳性；而降低N蛋白的使用浓度时，有漏检的可能性。在本发明提供的比例 和使用浓度内，可充分发挥N蛋白和S蛋白各自的作用，进一步提高试剂盒的检测灵敏度 和特异性。

[0046] (3)本发明实施例中提供的试剂盒，对磁微粒上偶联的抗人IgM抗体的种类进行了 特定选择，结果发现鼠抗人IgM抗体用于本发明具有相对更好的效果，阳性检出率更高。

[0047] (4)本发明实施例中提供的试剂盒，阳性检出率明显高于市场在售同类新冠病毒IgM 检测产品，如胶体金法试剂盒，提示本发明的试剂盒可以更加准确地服务于体外诊断领 域。

具体实施方式

[0048] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的 技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不 是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动 前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示， 否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被 理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

[0049] 另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。 本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中， 对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发 明的主旨。

[0050] 1.下述实施例和对比例中，所用的N蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所 用的S蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

[0051] 二者通过下述方法制得：

[0052] (1)2019-nCoV N蛋白(核蛋白，Nucleoprotein)的氨基酸序列信息来自于GeneBank (QHD43423.2)，本发明选取全长N蛋白进行表达纯化，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所 示。针对大肠杆菌表达偏好密码子对N蛋白氨基酸序列进行密码子优化，得到编码N蛋 白的基因序列，如SEQ ID NO.2所示；按照pET28b载体的多克隆位点序列信息，在基因 序列两端分别添加NcoI和XhoI酶切位点；全基因合成后，亚克隆到pET28a表达载体中。

[0053] 将测序验证正确的表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落进行培养， 利用0.6mM IPTG于32℃诱导表达4h。蛋白以可溶性形式表达后，10mM Tris-HCl (pH8.0)溶解，利用镍柱亲和层析介质以及DEAE离子交换介质对目的蛋白进行纯化； 采用PBS溶液对目的蛋白进行透析后，最终保存于PBS溶液中。

[0054] (2)2019-nCoV S蛋白(刺突蛋白，Spike protein)的氨基酸序列信息来自于GeneBank (QHD43416.1)，本发明选取S蛋白的340-650区域进行表达纯化，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。针对大肠杆菌表达偏好密码子对此区域(340-650)进行密码子优化，得 到编码该区域的基因序列，如SEQ ID NO.4所示；按照pET28b载体的多克隆位点序列信 息，在基因序列两端分别添加NcoI和XhoI酶切位点；全基因合成后，亚克隆到pET28a表 达载体中。

[0055] 将测序验证正确的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落进 行培养，0.6mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)于32℃诱导表达4h；蛋白包涵体 表达后，8M尿素溶解，利用镍柱亲和层析介质以及DEAE离子交换介质对目的蛋白进行 纯化；采用梯度浓度尿素溶液对目的蛋白进行复性，最终保存于PBS溶液中。

[0056] 2.下述实施例和对比例中，除特别说明的，所述原料均为市售商品；其中，[0057] 商购或自制获得新冠病毒抗原后，使用本领域通用方法进行辣根过氧化酶标记，具 体如下：

[0058] 取4mg HRP，加入1mL水，0.2mL高碘酸钠，避光搅拌30min；加入80μL乙二醇， 避光搅拌30min；加入4mg新冠病毒抗原，混匀后使用50mM的碳酸盐缓冲液透析，4℃ 避光透析24h；加入硼氢化钠1mg，混匀后静置6h，加入丙三醇2mL，即得；-20℃储 存备用。

[0059] 3.下述实施例和对比例中，所用的校准品(160AU/mL的抗新型冠状病毒抗体)为 人源性血清，通过下述方法制得：

[0060] (1)收集新型冠状病毒感染患者血清，用实施例1提供的试剂盒进行测试，将检测 发光值大于500万的血清混合备用；

[0061] (2)160AU/mL的校准品制备方法为：先用牛血清稀释抗新型冠状病毒抗体混合血 清，稀释比例10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1280倍、2560倍、 5120倍；使用实施例1提供的试剂盒检测稀释后的混合血清与牛血清，混合血清的检测 值接近牛血清的检测值时，则将该稀释后的混合血清的抗新型冠状病毒抗体的浓度定为 0AU/mL；例如，稀释2560倍的混合血清的抗新型冠状病毒抗体的浓度定为0AU/mL时， 此浓缩的上一个浓度(稀释1280倍)时混合血清的抗新型冠状病毒抗体浓度就定为 5AU/mL，稀释640倍的混合血清的抗新型冠状病毒抗体的浓度就定为10AU/mL，稀释 320倍的混合血清的抗新型冠状病毒抗体的浓度就定为20AU/mL，依次类推，稀释40 倍的混合血清的抗新型冠状病毒抗体浓度就定为160AU/mL；

[0062] (3)以5-160AU/mL的抗体混合血清为校准品，使用实施例1提供的试剂盒检测阳 性质控血清(确诊患者的血清)10例，阴性质控血清(正常人血清)10例，如均检测准 确则符合要求；如果符合要求，将此批号的混合血清稀释40倍，即得抗新型冠状病毒 抗体浓度为160AU/mL的校准品。

[0063] 实施例1

[0064] 1.一种快速准确检测新型冠状病毒IgM抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：

[0065] 发光底物液A、发光底物液B、样品稀释液、酶标工作液、校准品和磁珠悬浮液；

[0066] 其中发光底物液A包括下述终浓度的组分：

[0067] Tris 0.02g/L，盐酸0.006ml/L，鲁米诺0.003g/L；

[0068] 发光底物液B包括下述终浓度的组分：

[0069] 磷酸二氢钠0.2g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，过氧化脲0.01g/L，氯化钠9g/L；

[0070] 样品稀释液包括下述终浓度的组分：

[0071] BSA 10g/L，氯化钠9g/L，ProCLin300 0.5ml/L；

[0072] 酶标工作液包括下述终浓度的组分：

[0073] 辣根过氧化物酶标记的N蛋白抗原0.5mg/L，辣根过氧化物酶标记的S蛋白抗原 1mg/L，磷酸二氢钠0.2g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，氨基比林1g/L，ProCLin300 0.5ml/L， CaSein 2.5g/L；

[0074] 校准品包括下述终浓度的组分：抗新型冠状病毒抗体160AU/ml；

[0075] 磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有鼠抗人IgM抗体1的磁微粒(以磁微粒 的质量计)1g/L，其中，1g磁微粒上偶联有1500mg的鼠抗人IgM抗体1；其中，鼠抗人 IgM抗体1购自武汉奥科博泰生物科技有限公司，货号为A0041，批号为20190128A。

[0076] 2.上述试剂盒的制备方法包括下述步骤：

[0077] 发光底物液A的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容， 即得；发光底物液B的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容， 即得；样品稀释液的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容， 即得；酶标工作液的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容， 即得；校准品的制备方法见上述；

[0078] 磁珠悬浮液的制备方法包括下述步骤：

[0079] 称取1g磁微粒(购自JSR Corporation，型号为MX100/CarboxyI，粒径为1μm)加入 10mL 25mM的MES缓冲液清洗磁微粒1次，磁分离弃上清；加入10mL水和100mgEDC， 混悬活化
30min，磁分离弃上清；加入10mL 25mM的MES缓冲液，鼠抗人IgM抗体1 1500mg，混匀，然后放置于4℃混悬过夜(16-20小时)；加入10mL 25mM的MES缓冲 液清洗磁微粒1次，磁分离弃上清；加入保存液(磷酸二氢钠0.2g/L，磷酸氢二钠2.9g/L， 氨基比林1g/L，ProCLin300 1mL/L，CaSein 2.5g/L)，定容，即得。

[0080] 实施例2

[0081] 1.一种快速准确检测新型冠状病毒IgM抗体的试剂盒，所述试剂盒的组分同实施例 1，区别仅在于磁珠悬浮液中为偶联有鼠抗人IgM抗体2的磁微粒；

[0082] 其中，鼠抗人IgM抗体2购自杭州隆基生物技术有限公司，货号为MS00704，批号 为M19111501。

[0083] 2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

[0084] 实施例3

[0085] 1.一种快速准确检测新型冠状病毒IgM抗体的试剂盒，所述试剂盒的组分同实施例 1，区别仅在于磁珠悬浮液中为偶联有鼠抗人IgM抗体3的磁微粒；

[0086] 其中，鼠抗人IgM抗体3购自合肥康瑞祥生物技术有限公司，货号为XY080，批号 为20190906。

[0087] 2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

[0088] 实施例4

[0089] 1.一种快速准确检测新型冠状病毒IgM抗体的试剂盒，所述试剂盒的组分同实施例 1，区别仅在于磁珠悬浮液中为偶联有羊抗人IgM抗体1的磁微粒；

[0090] 其中，羊抗人IgM抗体1购自西格玛Sigma，货号为i1636-2ML，批号为023M4827。

[0091] 2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

[0092] 实施例5

[0093] 1.一种快速准确检测新型冠状病毒IgM抗体的试剂盒，所述试剂盒的组分同实施例 1，区别仅在于磁珠悬浮液中为偶联有羊抗人IgM抗体2的磁微粒；

[0094] 其中，羊抗人IgM抗体2购自Meridian，货号为L04354G，批号为036-21201。

[0095] 2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

[0096] 对比例1

[0097] 1.一种试剂盒，所述试剂盒的组分同实施例1，区别仅在于酶标工作液中不含辣根 过氧化物酶标记的S蛋白抗原，其包括下述终浓度的组分：

[0098] 辣根过氧化物酶标记的N蛋白抗原0.5mg/L，磷酸二氢钠0.2g/L，磷酸氢二钠 2.9g/L，氨基比林1g/L，ProCLin300 0.5ml/L，CaSein 2.5g/L；

[0099] 2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

[0100] 对比例2

[0101] 1.一种试剂盒，所述试剂盒的组分同实施例1，区别仅在于酶标工作液中不含辣根 过氧化物酶标记的N蛋白抗原，其包括下述终浓度的组分：

[0102] 辣根过氧化物酶标记的S蛋白抗原1.0mg/L，磷酸二氢钠0.2g/L，磷酸氢二钠2.9g/L， 氨基比林1g/L，ProCLin300 0.5ml/L，CaSein 2.5g/L；

[0103] 2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

[0104] 对比例3

[0105] 1.一种试剂盒，所述试剂盒的组分同实施例1，区别仅在于酶标工作液中辣根过氧 化物酶标记的新冠病毒抗原不同，其包括下述终浓度的组分：

[0106] 辣根过氧化物酶标记的商购N蛋白抗原0.5mg/L，辣根过氧化物酶标记的商购S蛋白 抗原1.0mg/L，磷酸二氢钠0.2g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，氨基比林1g/L，ProCLin300 0.5ml/L，CaSein 2.5g/L；

[0107] 其中，N蛋白抗原购自北京德奥平生物技术有限公司，产品名称为2019-nCov N蛋 白，货号为P043C01；

[0108] S蛋白抗原购自通用生物系统(安徽)有限公司，产品名称为SARS-Cov-2(2019- nCov)，货号为UDP9002-2。

[0109] 2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

[0110] 对比例4

[0111] 1.一种试剂盒，所述试剂盒的组分同实施例1，区别仅在于酶标工作液中辣根过氧 化物酶标记的新冠病毒抗原不同，其包括下述终浓度的组分：

[0112] 辣根过氧化物酶标记的商购N蛋白抗原0.5mg/L，辣根过氧化物酶标记的商购S蛋白 抗原1.0mg/L，磷酸二氢钠0.2g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，氨基比林1g/L，ProCLin300 0.5ml/L，CaSein 2.5g/L；

[0113] 其中，N蛋白抗原购自广东菲鹏生物有限公司，产品名称为nCov-PS-Ag18 N蛋白， 货号为Ag18；

[0114] S蛋白抗原购自奥创生物技术(山东)有限公司，产品名称为2019-nCov-Spike Protein (RBD)，货号为B219-Ag1。

[0115] 2.上述试剂盒的制备方法参照实施例1。

[0116] 试验例1

[0117] 利用中航赛维生物生产的VI-200全自动化学发光仪对实施例提供的抗新型冠状病 毒IgM抗体检测试剂盒(化学发光法)进行检测验证。程序及参数如下：

[0118] 1.在反应杯中分别加入样品稀释液100μL/孔；每孔分别加入校准品(将160AU/mL 的校准品稀释为160、80、40、20、10、5AU/mL六个梯度)或样本10μL；

[0119] 2.每孔分别加入磁珠悬浮液20μL；

[0120] 3.混匀后37±0.5℃温育15min；

[0121] 4.磁分离去上清；

[0122] 5.加300μL清洗液至检测管中，混匀；

[0123] 6.磁分离去上清；

[0124] 7.重复步骤5、6，三遍；

[0125] 8.每孔分别加入酶标工作液100μL；

[0126] 9.混匀后37±0.5℃温育15min；

[0127] 10.磁分离去上清；

[0128] 11.重复步骤5、6，三遍；

[0129] 12.每孔加入发光底物A液和发光底物B液各50μL；

[0130] 13.混匀后1-5min检测发光强度，输出检测结果；

[0131] 14.手工结果计算方式：应用Microsoft Office Excel，以校准品浓度值的log值作为x轴， 以校准品发光强度RLU值的log值为y轴建立定标曲线，得到曲线方程Y＝m(X)+c及其线性 相关系数R2；将所读样品RLU值的对数(Y)代入上述曲线方程，求得对应的X值，再求 反对数后，即为所测样品中新型冠状病毒IgM抗体的浓度。

[0132] 通过对部分临床已确诊为新型冠状病毒感染阳性，但PCR核酸检测为阴性的患者血 样进行复检，用实施例1-5生产的新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒(化学发光法)同 时检测新型冠状病毒感染阳性患者血清P1-P10，对不同来源抗人IgM的性能进行验证， 检测结果如表1所示：

[0133] 表1

[0134]

[0135] 测定P1-P10时，发光值大于8AU/ml时判断为阳性，通过实验测定结果，可以看到 各实施例提供的新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒均能检出相当部分(IgM)阳性，提 示本发明提供的试剂盒检测可与核酸检测形成互补。其中，实施例1生产的新型冠状病 毒IgM抗体检测试剂盒(化学发光法)能检出5/10的阳性，实施例2和3的检出率与 实施例1相同；但使用羊抗人IgM的实施例4和5阳性检出率只有4/10，效果略差于 实施例1-3的阳性检出率；此外，实施例2和3提供的试剂盒的阳性发光值略低于实施 例1，说明实施例1的试剂盒灵敏度相对更好。

[0136] 试验例2

[0137] 用实施例1生产的新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒与对比例1和对比例2生产的 试剂盒同时检测新型冠状病毒感染患者血清P11-P20，验证N蛋白抗原与S蛋白抗原混合 使用的优势，检测流程与试验例1相同。检测结果如表2所示：

[0138] 表2

[0139]

[0140] 测定P11-P20时，发光值大于8AU/ml时判断为阳性，通过实验测定结果，可以看 到实施例1的新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒能检出7/10的阳性；对比例1的试剂 盒能检出5/10的阳性；对比例2的试剂盒能检出5/10的阳性；即N蛋白抗原和S蛋白 抗原同时使用时，灵敏度和阳性检出率更高。

[0141] 试验例3

[0142] 用对比例3和对比例4提供的试剂盒检测新型冠状病毒感染患者血清P11-P30、健 康人血清N1-N20，与实施例1提供的试剂盒的检测结果进行对比，验证不同N蛋白抗原 和S蛋白抗原的灵敏度、特异性和检出率。检测流程与试验例1相同，检测结果如表4所 示：

[0143] 表4

[0144]

[0145]

[0146] 测定P11-P30、N1-N20时，发光值大于8AU/ml时判断为阳性。检测P11-P30时， 由表4结果可知，实施例1提供的新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒(化学发光法)能 检出15/20的阳性；对比例3提供的试剂盒(化学发光法)能检出12/20的阳性；对比 例4提供的试剂盒(化学发光法)能检出14/20的阳性；说明实施例1的阳性检出率高 于对比例3和对比例4。而且，实施例1的试剂盒的阳性发光值高于对比例3和对比例 4，说明实施例1的灵敏度高于对比例3和对比例4。

[0147] 检测正常人血清N1-N20时，实施例1和对比例4的试剂盒全部检测为阴性，而对 比例3的试剂盒出现了1例假阳性；说明实施例1和对比例4的试剂盒的特异性相当， 均高于对比例3的试剂盒的特异性。

[0148] 试验例4

[0149] 用市场同类产品同时检测新型冠状病毒感染患者血清P11-P40和正常人阴性血清 N1-N10，与实施例1的试剂盒的检测结果进行对比，验证实施例1与市场同类产品之间 的性能差异。市售试剂盒的检测流程参照其说明书，检测结果如表5所示：

[0150] 表5

[0151]

[0152]

[0153] 实施例1提供的试剂盒测定P11-P40和N1-N10时，发光值大于8AU/ml时判断为 阳性；市售试剂盒通过观察检测线的显色强度判断结果。通过实验测定结果，可以看到 实施例1的新型冠状病毒IgM抗体检测试剂盒能检出23/30的阳性；对比试剂盒广东和 信健康生产的新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)能检出15/30 的阳性；对比试剂盒英诺特(唐山)生产的新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM/IgG抗体检 测试剂盒(胶体金法)IgM能检出18/30的阳性；即实施例1的试剂盒的灵敏度和阳性 检出率高于市售胶态金检测试剂盒。检测阴性血清N1-N10时，3种试剂盒的符合率为 100％，即特异性无差异。

[0154] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然 可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替 换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的 精神和范围。