一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法和用途，本发明从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，提取分离到的淋巴细胞的总mRNA，通过RT‑PCR的方法得到总cDNA片段，以cDNA为模板，在相应的带有Linker接头的引物的作用下，通过SOE‑PCR的方法得到猪源ScFv抗体基因序列，将ScFv抗体基因序列构建至pET‑30a载体，转化BL21感受态细胞，从转化后的单个菌落中筛选得到一个针对于非洲猪瘟病毒的ScFv抗体(VH‑VLκ6)，采用ELISA试验对筛选得到的ScFv抗体(VH‑VLκ6)进行初步活性鉴定，表明此抗体具有非洲猪瘟反应活性。本发明的提出为非洲猪瘟的早期诊断与防控提供了新的材料，为尽快控制非洲猪瘟的疫情传播提供了新的技术手段。

权利要求

1.一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体(ScFv)，其特征在于，所述的单链抗体由SEQ ID NO.1所述的序列编码。

2.如权利要求1所述的单链抗体(ScFv)，其特征在于，所述的单链抗体由SEQ ID NO.1所述的序列通过原核表达系统表达、纯化后获得。

3.权利要求1或2所述的抗非洲猪瘟病毒的单链抗体在制备检测非洲猪瘟病毒试剂中的用途。

4.编码权利要求1所述的抗非洲猪瘟病毒的单链抗体的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。

说明书

一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体。此外，本发明还涉及到该抗体的制备方法和用途。本发明属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever Virus,ASFV)引起的猪的一种高度致死性出血性疾病，具有高度接触性传染的特点。ASFV是
一种直径为200nm的正二十面体双链DNA病毒，为非洲猪瘟病毒科的唯一成员，是已知的唯
一以媒介虫传播的病毒。非洲猪瘟在1921年首次爆发于非洲肯尼亚，于2018年8月传入我
国，截至2019年2月，全国已有24个省份发生非洲猪瘟疫情，给养猪业造成巨大的经济损失。
目前世界范围内还没有针对此病毒的有效疫苗，因此非洲猪瘟的早期诊断对该病的防控起
着至关重要的作用。抗体是机体免疫系统中重要的免疫分子，也是疫苗和诊断试剂中的核
心成分，抗体的研发对非洲猪瘟的防控起着至关重要的推动作用。但ASFV的基因组复杂，目
前我们对其各功能蛋白的作用机制知之甚少，故传统抗体的研发也显得尤为困难，此时，一
种新型抗体的研发与制备可能成为了防控此病的突破口。

[0003] 单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。单链抗体作为第三代抗体
(基因工程抗体)的一种，受到人们的广泛关注。1988年，Bird和Huston等第一次将单链抗体
研制出来，在此后的三十年里，科研人员对单链抗体的研究一直没有间断，不仅研制出了单
链抗体多聚体、双特异性单链抗体等多种抗体形式，还建立了单链抗体的多种展示系统。单
链抗体是一种比常规抗体分子量小的抗体，只含有重链可变区与轻链可变区，因此单链抗
体具有很好的穿透性,易透过血管壁与靶细胞进行接触，适用于肿瘤的诊断和治疗；此外单
链抗体因很好的保留了可变区域，因此对原抗原依然具有准确的特异性与亲和性；单链抗
体作为一种人工合成的抗体，还易于进行分子的改造，可直接对靶细胞产生杀伤作用；单链
抗体最突出的特点是克服了传统单克隆抗体鼠源性强的特点，消除了抗体应用上的异源性
反应，扩宽了抗体的应用范围。凭借以上特性单链抗体与普通抗体相比有很大优势。因此，
单链抗体在疾病的治疗与诊断中具有很大的价值。

[0004] 回顾近些年来抗体领域的发展情况，我们可以看出，传统的抗体已不能满足目前抗体市场的需求，人们急需一种制备简便、特异性强、稳定性高且分子量小的灵活抗体，使
其高效作用于特定部位。为此，实现抗体小型化靶向癌细胞内效应分子或者其他靶细胞一
直是抗体工程与抗癌研究的重要目标和研究热点。

[0005] 综上所述，通过制备具有ASFV特异性、生物活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体，尤其是单链抗体之类的新型抗体，对于建立敏感的ASFV的临床诊断方法，控
制ASF的疫情蔓延具有及其重要的意义。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体(ScFv)及其制备方法。

[0007] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

[0008] 本发明的一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体(ScFv)，其由SEQ ID NO.1所述的序列编码。

[0009] 其中，优选的，所述的单链抗体由SEQ ID NO.1所述的序列通过原核表达系统表达、纯化后获得。

[0010] 进一步，本发明还提出了一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体(ScFv)的制备方法，包括以下步骤：

[0011] (1)淋巴细胞分离

[0012] 从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；

[0013] (2)淋巴细胞总mRNA的提取

[0014] 提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mRNA；

[0015] (3)全基因cDNA合成

[0016] 以步骤(2)提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；

[0017] (4)第一轮扩增

[0018] 以步骤(3)合成的全基因cDNA为模板，以P1、R1；F1、B11、B12、B13为引物进行第一轮扩增，扩增程序分别为：98℃2min，98℃10s、52℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min；98℃
2min，98℃10s、54℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min；将扩增产物电泳，纯化收集300bp产
物，‑20℃保存备用；

[0019] P1:5‑ACGACGACTTCAACGCCTGG‑3

[0020] R1:5‑GAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG‑3

[0021] F1:5‑TTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC‑3

[0022] B11:5‑GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC‑3

[0023] B12:5‑GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC‑3

[0024] B13:5‑GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC‑3

[0025] (5)第二轮扩增

[0026] 以第一轮扩增产物为模板，以P1、R2；F2、B11、B12、B13为引物进行第二轮扩增，扩增程序分别为：98℃2min，98℃10s、56℃5s、72℃30s、35个循环，72℃10min；98℃2min，98℃
10s、68℃30s、30个循环，72℃10min。扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集
320bp产物，置‑20℃保存备用；

[0027] R2:

[0028] 5‑GCCGCCTGACCCTCCGCCACCGAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG‑3

[0029] F2:

[0030] 5‑GGTGGCGGAGGGTCAGGCGGCTTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC‑3

[0031] (6)第三轮扩增

[0032] 以第二轮扩增产物为模板，以P1、B11、B12、B13为引物进行第三轮扩增，扩增程序为：①无引物：98℃2min，98℃10s、68℃30s、10个循环，72℃10min。②有引物：98℃2min，98
℃10s、55℃5s、72℃50s、35个循环，72℃10min。扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯
化收集800bp产物，置‑20℃保存备用。

[0033] (7)T‑A克隆鉴定

[0034] I将第三轮扩增产物进行3’端加“A”处理，反应程序为65℃10min；

[0035] II将加A产物连接至PMDTM20‑T载体上，连接程序为16℃30min；

[0036] III将连接产物转化至E.coli JM109感受态中，100μL感受态细胞转化10μL连接产+
物，将转化的菌液均匀涂布于LB‑A平板上，37℃倒置培养8‑16h直至单克隆出现，挑取单克
+
隆菌落于LB‑A液体培养基中培养，提取质粒，送测序，筛选出基因序列正确的质粒；

[0037] (8)ScFv抗体的构建与制备

[0038] 准备BL21感受态细胞，每50μL感受态细胞转化1μL由测序正确的扩增产物构建的+
ScFv‑PET‑30a质粒，将转化的菌液均匀涂布于LB‑K 平板上，37℃倒置培养8‑16h直至单克
+
隆出现，挑取单克隆菌落于LB‑K液体培养基中，诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进
行收集、洗涤、纯化，即得抗非洲猪瘟病毒的单链抗体。

[0039] 其中，优选的，所述的淋巴细胞分离是按照以下步骤进行：

[0040] (1)自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中加入等量的全血稀释液，混匀，得到全血的稀释液；

[0041] (2)以全血的稀释液与淋巴细胞分离液体积比为5:9的比例，量取淋巴细胞分离液，之后先慢后快加入步骤(1)得到抗凝血的稀释液，水平离心机1800rpm，18‑22℃,30min；

[0042] (3)小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释，水平离心机1500rpm，18‑22℃,10min；弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机1500rpm，18‑22
℃，10min离心；沉淀用5mL无RNA酶水重悬，随即加入45mL RPIM‑1640培养液混匀，1000rpm，
18‑22℃，10min离心，沉淀即为淋巴细胞淋巴细胞，并将其重悬于RNALater保存液中，置‑70
℃保存备用。

[0043] 其中，优选的，所述的淋巴细胞总mRNA的提取按照以下方法进行：吸取上述淋巴细胞液400μL，加入1mL TRizol，混匀，4℃静置5min；加入250μL三氯甲烷，混匀，4℃静置
10min，12000r/min，4℃，离心15min；吸取450μL上清，加等量异丙醇，‑20℃静置30min，
12000r/min，4℃，离心15min；轻弃上清，沉淀加1mL 75％乙醇，12000r/min，4℃，离心5min；
沉淀置通风橱10min使之干燥；25μL无RNA酶的水溶解的沉淀即为收获的总mRNA。

[0044] 其中，优选的，所述的全基因cDNA合成是在0.2ml的PCR扩增管中依次加入下列组分：

[0045]

[0046]

[0047] 混匀后，将PCR扩增管放置于PCR仪，反应程序为：25℃10min，37℃60min，72℃15min。得到的产物即为全基因组cDNA，置‑20℃保存备用。

[0048] 其中，优选的，所述的第一轮扩增是在0.2ml的PCR扩增管中分别依次加入下列组分：

[0049] ①:

[0050]

[0051] ②:

[0052]

[0053] 在步骤(4)所述扩增程序下进行第一轮扩增，将扩增产物电泳，纯化收集300bp产物，‑20℃保存备用；

[0054] 所述的第二轮扩增是在0.2ml的PCR扩增管中分别依次加入下列组分：

[0055] ①:

[0056]

[0057] ②:

[0058]

[0059] 在步骤(5)所述扩增程序下进行第二轮扩增，扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集320bp产物，置‑20℃保存备用；

[0060] 所述的第三轮扩增是在0.2ml的PCR扩增管中依次加入下列组分：

[0061] ①:

[0062]

[0063]

[0064] ②:补充引物

[0065]

[0066] 在步骤(6)所述扩增程序下进行第三轮扩增，扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集800bp产物，置‑20℃保存备用。

[0067] 其中，优选的，所述的T‑A克隆鉴定是先于0.2mL的PCR扩增管中依次进行下列I和II两个程序，再于1.5mL离心管中进行程序III：

[0068] I

[0069]

[0070] II

[0071]

[0072] III

[0073] II全部连接产物             10μl

[0074] E.coli JM109               100μL

[0075] 在步骤(7)所述程序下进行T‑A克隆鉴定，筛选基因序列正确的质粒进行ScFv‑pET‑30a质粒的构建。

[0076] 更进一步的，本发明还提出了所述的抗非洲猪瘟病毒的单链抗体在制备检测非洲猪瘟病毒试剂中的用途。

[0077] 编码所述的抗非洲猪瘟病毒的单链抗体的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0078] 相较于现有技术，本发明的有益效果是：

[0079] 本发明提出了一种抗非洲猪瘟病毒的单链抗体(ScFv)，其由SEQ ID NO.1所述的序列编码。本发明发明人对所制备的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体(VH‑VLκ6)的基因序列进行
了比对分析，结果表明该抗体的基因序列与猪源抗体的基因序列基本一致，证明所构建的
抗体基因序列是正确的。采用ELISA检测技术对所制备的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体(VH‑
VLκ6)进行反应活性鉴定，结果表明所制备的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体(VH‑VLκ6)具有非
洲猪瘟反应活性。本发明的提出为非洲猪瘟的早期诊断与防控提供新的材料，为尽快控制
非洲猪瘟的疫情传播提供了新的技术支持。

附图说明

[0080] 图1a为VH基因扩增产物；

[0081] 其中，M：DL2000DNA marker；1～2：VH；

[0082] 图1b为VLκ基因扩增产物；

[0083] 其中，M：DL2000DNA marker；1：VLκ；

[0084] 图2a为VH‑Linker基因扩增产物；

[0085] 其中，M：DL2000DNA marker；1：VH‑Linker；

[0086] 图2b为VLκ‑Linker基因扩增产物；

[0087] 其中，M：DL2000DNA marker；1～2：VLκ‑Linker；

[0088] 图3为ScFv(VH‑VLκ)PCR扩增产物；

[0089] 其中，M：DL2000DNA marker；1：VH‑VLκ；

[0090] 图4为猪外周血淋巴细胞T‑A克隆鉴定的质粒PCR扩增结果；

[0091] 其中，M：DL2000相对分子质量标准；1‑22:单克隆菌落的质粒PCR结果；

[0092] 图5为ScFv抗体(VH‑VLκ6)的重链可变区与NCBI网站上发布的猪源抗体可变区序列进行序列的比对结果；

[0093] 图6为ScFv抗体(VH‑VLκ6)的轻链可变区与NCBI网站上发布的猪源抗体可变区序列进行序列的比对结果；

[0094] 图7为ScFv抗体(VH‑VLκ6)基因的诱导表达。

[0095] 其中，M：蛋白质分子质量标准；1：抗非洲猪瘟ScFv抗体(VH‑VLκ6)表达纯化产物。

具体实施方式

[0096] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人
员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进
行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0097] 实施例1抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体(VH‑VLκ6)的制备及其基因序列

[0098] 1.材料与方法

[0099] 1.1材料

[0100] 1.1.1试验动物

[0101] 1头非洲猪瘟免疫耐过猪(5个月，河南新乡猪场)。

[0102] 1.1.2菌株和试剂

[0103] LTS1110猪外周血淋巴细胞分离液Kit购自天津灏洋生物制品公司；PMDTM20‑T载体、E.coli JM109感受态、 HS DNA Polymerase、RNase‑free Water、DL2,
000DNA Marker、6×Loading Buffer均购自宝生物公司；BL21(DE3)感受态购自北京全式
金；Trizol、镍亲和层析树脂、DNA片段回收试剂盒和质粒提取试剂盒为OMEGA产品；分子生
物学试剂来自Sigma公司；其他生化试剂均为国产分析纯。

[0104] 1.2方法

[0105] 1.2.1淋巴细胞分离

[0106] 颈静脉采集猪抗凝血100ml，等量加入全血稀释液，混匀；以体积比为5:9的比例先加淋巴细胞分离液，之后先慢后快加稀释好的抗凝血，水平离心机1800rpm，18‑22℃,
20min；小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释之，水平离心机
1500rpm，18‑22℃,10min；弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机1500rpm，18‑22
℃，10min离心；弃上清，沉淀即为分离到的淋巴细胞，取悬浮细胞上清液并且计数后并悬浮
于RNA保存液(RNAlater)中，置‑70℃保存备用。

[0107] 1.2.2淋巴细胞总mRNA的提取

[0108] 吸取上述淋巴细胞液400ul，加入1mlTRizol，混匀，4℃静置5min；加入250ul三氯甲烷，混匀，4℃静置10min，12000r/min，4℃，离心15min；吸取450ul上清，加等量异丙醇，‑
20℃静置30min，12000r/min，4℃，离心15min；轻弃上清，沉淀加1mL 75％乙醇，12000r/
min，4℃，离心5min；沉淀置通风橱10min使之干燥；25ul无RNA酶的水溶解的沉淀即为收获
的总mRNA，ND2000测得Total mRNA浓度为356ng/ul，纯度OD260/OD280为1.87。

[0109] 1.2.3引物的设计

[0110] 第一轮扩增引物：

[0111] P1:5‑ACGACGACTTCAACGCCTGG‑3

[0112] R1:5‑GAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG‑3

[0113] F1:5‑TTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC‑3

[0114] B11:5‑GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC‑3

[0115] B12:5‑GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC‑3

[0116] B13:5‑GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC‑3

[0117] 第二轮扩增引物：

[0118] P1:5‑ACGACGACTTCAACGCCTGG‑3

[0119] R2:5‑GCCGCCTGACCCTCCGCCACCGAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG‑3

[0120] F2:5‑GGTGGCGGAGGGTCAGGCGGCTTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC‑3

[0121] B11:5‑GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC‑3

[0122] B12:5‑GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC‑3

[0123] B13:5‑GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC‑3

[0124] 第三轮扩增引物：

[0125] P1:5‑ACGACGACTTCAACGCCTGG‑3

[0126] B11:5‑GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC‑3

[0127] B12:5‑GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC‑3

[0128] B13:5‑GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC‑3

[0129] 1.2.4 cDNA合成双链及纯化

[0130] 1.2.4.1全基因cDNA合成

[0131] 在0.2ml的PCR扩增管中依次加入表1所示组分：

[0132] 表1

[0133]

[0134] 混匀后，将PCR扩增管放置于PCR仪，反应程序为：25℃10min，37℃60min，72℃15min。得到的产物即为全基因组cDNA，置‑20℃保存备用。

[0135] 1.2.4.2第一轮扩增

[0136] 在0.2ml的PCR扩增管中分别依次加入表2和表3所示的组分：

[0137] ①:

[0138] 表2

[0139]

[0140] ②:

[0141] 表3

[0142]

[0143] 上述扩增程序分别为①：98℃2min，98℃10s、52℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min；②：98℃2min，98℃10s、54℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min.。将扩增产物电泳，
纯化收集300bp产物，‑20℃保存备用。

[0144] 1.2.4.3第二轮扩增

[0145] 在0.2ml的PCR扩增管中分别依次加入下列表4以及表5所示的组分：

[0146] ①:

[0147] 表4

[0148]

[0149] ②:

[0150] 表5

[0151]

[0152] 上述扩增程序分别为：①：98℃2min，98℃10s、56℃5s、72℃30s、35个循环，72℃10min；②：98℃2min，98℃10s、68℃30s、30个循环，72℃10min。扩增产物电泳，凝胶回收试
剂盒从凝胶中纯化收集320bp产物，置‑20℃保存备用；

[0153] 1.2.4.4第三轮扩增

[0154] 在0.2ml的PCR扩增管中依次加入下列表6以及表7所示的组分：

[0155] ①:

[0156] 表6

[0157]

[0158] ②:补充引物

[0159] 表7

[0160]

[0161] 上述扩增程序分别为：①无引物：98℃2min，98℃10s、68℃30s、10个循环，72℃10min。②有引物：98℃2min，98℃10s、55℃5s、72℃50s、35个循环，72℃10min。扩增产物电
泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集800bp产物，置‑20℃保存备用。

[0162] 1.2.5T‑A克隆鉴定

[0163] 先在0.2mL的PCR扩增管中依次进行下列I和II 2个程序，再在1.5mL离心管中进行程序III：

[0164] I

[0165]

[0166] II

[0167]

[0168] III(转化)

[0169] II全部连接产物           10μl

[0170] E.coli JM109             100μL

[0171] 上述程序分别为I：65℃10min；II：16℃(金属浴)30min；

[0172] III：将转化的菌液均匀涂布于LB‑A+平板上，37℃倒置培养8‑16h直至单克隆出+
现，挑取单克隆菌落于LB‑A液体培养基中培养，提取质粒，送测序。

[0173] 1.2.5基因序列的比对

[0174] 将上述测序结果与NCBI网站上发布的猪源抗体可变区序列进行基因序列的比对，所用比对软件为DNA star，比对结束后，将正确的基因序列送由武汉金开瑞公司进行ScFv‑
PET‑30a质粒的构建。

[0175] 1.2.6抗体的构建与制备

[0176] 准备BL21感受态细胞，每50μL感受态细胞转化1μL VH‑VLκ6‑PET‑30a质粒，将转化+
的菌液均匀涂布于LB‑K 平板上，37℃倒置培养8‑16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于
+
LB‑K 液体培养基中，37℃诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，即
得抗非洲猪瘟ScFv抗体(VH‑VLκ6)。

[0177] 1.2.7抗体的活性鉴定

[0178] 1.2.7.1取纯化的ScFv抗体(VH‑VLκ6)蛋白，按照1:10的比例包被检测板，包被完成后，加入50μL非洲猪瘟全病毒抗原，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，
加入50μL 1:5稀释的非洲猪瘟阳性血清，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，
拍干，加入50μL 1:15000稀释的HRP标记的猪二抗，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液
洗涤4次，拍干，加入50μL TMB底物溶液，37℃温箱孵育15min，加入50μL终止液(H2SO4)，在分
光光度仪上读取反应物的OD450nm值。

[0179] 1.2.7.2取非洲猪瘟全病毒抗原，按照1:10的比例包被检测板，包被完成后，加入50μL1:10稀释的ScFv抗体(VH‑VLκ6)蛋白，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，
拍干，加入50μL 1:5稀释的兔抗猪的抗HIS标签的二抗，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗
涤液洗涤4次，拍干，加入50μL TMB底物溶液，37℃温箱孵育15min，加入50μL终止液(H2SO4)，
在分光光度仪上读取反应物的OD450nm值。

[0180] 2.结果

[0181] 2.1 cDNA合成双链的琼脂糖凝胶电泳

[0182] 取第一轮扩增的ds cDNA产物进行电泳，收集300bp条带。取第二轮扩增的ds cDNA产物进行电泳，收集320bp条带。取第三轮扩增的ds cDNA产物进行电泳，收集800bp条带。如
图1、图2、图3所示。

[0183] 2.2 T‑A克隆后的质粒PCR结果

[0184] 将连接好的PMDTM20‑T‑A进行质粒PCR鉴定，挑选基因大小在800bp左右的质粒送测序，质粒PCR鉴定结果如图4所示，测序结果如SEQ ID NO.1所示。

[0185] 2.3 ScFv抗体基因序列比对

[0186] 将测序合适的基因序列与NCBI网站上发布的猪源抗体可变区序列进行基因序列的比对，结果如图5、6所示。

[0187] 2.3 ScFv抗体(VH‑VLκ6)基因的表达

[0188] 37℃诱导后出现1条大小为27kDa的特异蛋白条带,结果与预期相符(见图7)，并在诱导剂浓度为1/1000，诱导时间为6h时，表达量达高峰。

[0189] 2.4表达的ScFv抗体(VH‑VLκ6)活性鉴定

[0190] 2.4.1表达产物包被检测板

[0191] 将表达产物包被检测板，按照1.2.7.1所述程序进行检测，检测结果如表8所示，表明所表达的产物可以与非洲猪瘟全病毒抗原发生特异性结合。

[0192] 表8

[0193]   ScFv(VH‑VLκ6) 阴性对照OD值 0.818 0.47

[0194] 2.4.2 ASFV全病毒抗原包被检测板

[0195] 将ASFV全病毒抗原包被检测板，按照1.2.7.2所述程序进行检测，检测结果如表9所示，表明非洲猪瘟全病毒抗原与表达产物发生了特异性结合。

[0196] 表9

[0197]   ScFv(VH‑VLκ6) 阴性对照OD值 0.709 0.142