植物组成型启动子OsUbipro及其应用

摘要

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及植物组成型启动子OsUbipro及其应用。本发明的启动子OsUbipro的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的启动子OsUbipro为水稻内源的组成型启动子，能够驱动基因在植物愈伤组织及营养生长期的叶片，特别是3‑5叶期幼苗及生殖器官等各组织中高效稳定的表达，可替代非植物源启动子，对水稻等植物的基因工程十分有利，可有效降低外源DNA引起的转基因植物的潜在安全风险。

权利要求

1.植物组成型启动子OsUbipro，其特征在于，其核苷酸序列为：（1）如SEQ ID NO.1所示； 或（2）与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列完全互补的序列。

2.含有权利要求1所述的启动子OsUbipro的表达盒。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒包括以转录方向彼此功能性连接的启动子OsUbipro、功能基因和终止子。

4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于，所述功能基因为筛选标记基因；所述筛选标记基因包括潮霉素磷酸转移酶基因Hn、水稻乙酰乳酸合酶突变基因ALS、Bar基因、抗性EPSPS基因或NptII基因。

5.含有权利要求1所述的启动子OsUbipro或权利要求2‑4任一项所述的表达盒的载体。

6.权利要求1所述的启动子OsUbipro或权利要求2‑4任一项所述的表达盒或权利要求5所述的载体的如下任一应用：

（1）在驱动DNA在植物愈伤组织和/或营养生长期的组织和/或生殖器官中表达的应用；

（2）在制备转基因植物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述DNA为功能基因、功能基因的反义基因、或能够干扰功能基因表达的小RNA基因；

所述功能基因包括植物农艺性状相关基因或筛选标记基因。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米。

9.扩增权利要求1所述的启动子OsUbipro的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2‑3所示。

10.一种转基因植物的制备方法，其特征在于，将权利要求2‑4任一项所述的表达盒或权利要求5所述的载体导入植物中，通过筛选得到转基因植物。

说明书

植物组成型启动子OsUbipro及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及植物组成型启动子OsUbipro及其应用。

背景技术

[0002] 转基因技术已经成为基因功能研究等基础研究和应用研究领域不可或缺的技术之一。启动子作为驱动基因表达的重要功能顺式作用元件，在转基因技术中占据重要地位。
启动子按其表达方式可分为组成型启动子、诱导型启动子和时空特异型启动子三类。组成
型启动子能够在所有或大多数组织中启动基因转录，使基因表达具有时空持续性和表达恒
定性。诱导型启动子能够在某些物理或化学信号的刺激下启动或大幅提高基因表达量，它
们具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构，并表现出明显的专一性。时空特异型启动子
只在特定的生长阶段或部位中启动基因表达。深入研究启动子的表达模式既有利于理解基
因的表达调控机制和生物学功能，又有助于有效控制外源基因的表达。

[0003] 随着转基因产品的不断推广，人们对转基因产品的态度日趋客观和积极，但对转基因产品的争议仍甚嚣尘上，转基因产品潜在的安全风险问题仍受到普遍关切，因此，转基
因产品仍受到严格的控制和监管。目前，在植物转化过程中应用较多的启动子主要是花椰
菜花病毒的启动子(CaMV35Spro)和玉米多聚泛素蛋白基因启动子(ZmUbipro)。CaMV35Spro
是植物DNA病毒的启动子，在植物转基因中的应用可能引起公众的担忧；ZmUbipr虽然是植
物来源，但在转化时频繁使用同一种启动子易导致转基因沉默。因此，挖掘新的高效的组成
型启动子，尤其是挖掘植物本源的、生物安全低风险的启动子显得尤其重要。

发明内容

[0004] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供植物组成型启动子OsUbipro及其应用。

[0005] 本发明提供的植物组成型启动子OsUbipro来源于水稻泛素Ubi基因的上游序列。泛素‑蛋白酶体途径是降解细胞内蛋白质的主要途径，有机体内蛋白质的合成与降解代谢
无时无刻不在进行着，泛素作为蛋白质降解途径的必须功能因子也应是广泛存在的。本发
明意外发现，水稻Ubi基因的上游序列能够驱动基因在植物的愈伤组织和营养生长期的根、
叶、生殖器官等主要组织中高效表达。

[0006] 本发明提供植物组成型启动子OsUbipro，其具有如下任一核苷酸序列：

[0007] (1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

[0008] (2)与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列互补的序列；

[0009] (3)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等启动子的功能、由(1)衍生的核苷酸序列。

[0010] 其中，对于(2)中所述的与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列互补的序列，本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与启动子OsUbipro核苷酸序列互补的DNA分
子。所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与启动子OsUbipro杂交。因此，具有启动子
活性并在严格条件下能够与启动子OsUbipro或其片段杂交的DNA序列包括在本发明中。

[0011] 严格条件是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因实验其它条件的不同而不同。通过控制
杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，
可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，
探针长度不超过1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。

[0012] 典型地，严格条件是在pH值7.0‑8.3下盐浓度低于大约1.5M Na+，典型地大约+
0.01‑1.0M Na 浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10‑50个核苷酸)至少大约30℃，对长
探针(如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。
低严格条件，例如，包括在30‑35％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液
中37℃杂交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中50‑55℃洗涤。中度
严格条件，例如，包括在40‑45％甲酰胺、1.0M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5
×至1×SSC中55‑60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS的缓
冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60‑65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1％‑
1％的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4‑12小时。

[0013] 特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA‑DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl(Anal Biochem，1984，138：267‑284)的方程
估算:Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)‑0.61(％form)‑500/L；其中M是单价阳离子的
摩尔浓度，％GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交
溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50％互补靶序列与完全配对探针杂交
的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1％的错配需Tm降低大约l℃；因此，Tm杂交和/或洗
涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90％的同一性，
Tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5℃，且
其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)1、2、3
或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃的杂
交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交
和/或洗涤。本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格度的变化而变
化，并应用此方程计算杂交和洗涤组合物和所需的Tm。如果所需的错配程度使Tm低于45℃
(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南
见于Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术一用核酸探针杂交，第I部分，第2章
(Elsevier，New York)；和Ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法第2章(Greene 
Publishing and Wiley‑Interscience,New York)。见Sambrook等人(1989)分子克隆:实验
室手册(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork)。

[0014] 所述严格条件优选为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

[0015] 其中，(3)中所述的由(1)衍生的核苷酸序列为与(1)所述的核苷酸序列相比具有70％以上同源性、80％以上同源性、85％以上同源性、90％以上同源性、95％以上同源性、
98％以上同源性或99％以上同源性，且具有同等功能的核苷酸序列。

[0016] 本发明提供含有所述启动子OsUbipro的表达盒。

[0017] 所述表达盒在启动子OsUbipro的下游连接有目的基因，所述目的基因可以是任意的已知功能或未知功能基因，用于驱动目的基因表达或鉴定基因功能。

[0018] 所述表达盒包括以转录方向彼此功能性连接的启动子OsUbipro、功能基因和终止子。

[0019] 作为本发明的一种实施方式，所述表达盒为植物转基因筛选表达盒，所述功能基因为筛选标记基因，可为植物内源基因或外源基因，包括但不限于植物乙酰乳酸合酶突变
基因ALS、植物抗性EPSPS基因、潮霉素磷酸转移酶基因Hn、Bar基因或NptII基因。

[0020] 作为本发明的一种实施方式，所述植物转基因筛选表达盒包括以转录方向彼此功能性连接的启动子OsUbipro、作为筛选标记基因的水稻乙酰乳酸合酶突变基因(ALSm)以及
Ubi终止子。对于上述筛选标记基因，采用启动子OsUbipro和Ubi终止子配合调控基因转录，
能够更好地控制筛选标记基因的高效、稳定、适度表达，更好地发挥筛选标记功能。

[0021] 所述植物转基因筛选表达盒的核苷酸序列具体可为如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

[0022] 本发明还提供含有所述启动子OsUbipro或所述表达盒的载体。

[0023] 所述载体可为表达载体。

[0024] 作为本发明的一种实施方式，所述载体为植物遗传转化筛选载体，具体为pCUAU，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0025] 本发明还提供含有所述启动子OsUbipro或所述表达盒或所述载体的宿主细胞。

[0026] 本发明还提供含有所述表达盒或所述载体的转基因植物。

[0027] 本发明提供所述启动子OsUbipro、含有所述启动子OsUbipro的表达盒或所述载体或所述宿主细胞的如下任一应用：

[0028] (1)在驱动DNA在植物愈伤组织和/或营养生长期的组织和/或生殖器官中表达的应用；

[0029] (2)在制备转基因植物中的应用。

[0030] 具体地，所述DNA可为功能基因、功能基因的反义基因、或能够干扰内源基因表达的小RNA基因。

[0031] 所述功能基因包括但不限于植物农艺性状相关基因、筛选标记基因。

[0032] 本发明所述植物为水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米。

[0033] 本发明还提供用于扩增所述启动子OsUbipro的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.2‑3所示。

[0034] 本发明提供一种转基因植物的制备方法，包括：将所述表达盒或所述载体导入植物中，通过筛选得到转基因植物。

[0035] 所述转基因植物的制备方法具体包括：将所述植物转基因筛选表达盒或所述植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后，在筛选阶段、分化阶段和生根阶段将愈伤组织或
幼苗接种到添加除草剂的筛选培养基中，进行抗性筛选。所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或
咪唑啉酮类，例如：双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸等。优选地，所述培养基中，含有0.05～10μ
mol/L双草醚、25～1000mg/L灭草烟或25～1000mg/L咪唑乙烟酸。

[0036] 以水稻为例，转基因水稻的制备方法具体包括如下步骤，其他转基因植物的制备方法可参考水稻：

[0037] 1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织，27℃暗培养30‑50天；

[0038] 2)侵染：将步骤1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于携带所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌的悬浮液(将携带所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌悬浮于悬浮培养基
中)中进行侵染，室温静置30分钟，之后晾干待用；

[0039] 3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，22℃暗培养3天，至愈伤组织表面出现菌体；

[0040] 4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的筛选培养基中，27℃暗培养30‑50天，进行抗性筛选；

[0041] 5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的分化培养基上，27℃光照培养25‑40天至分化出幼苗；

[0042] 6)生根：将幼苗接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的生根培养基上生根，30℃光照培养10‑20天，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株种植；

[0043] 以上转基因水稻的制备方法中涉及的培养基可为以现有技术公开的N6、MS、B5等培养基为基础的诱导培养基、继代培养基、筛选培养基、分化培养基、生根培养基等。

[0044] 本发明的有益效果至少包括：本发明的启动子OsUbipro是一个水稻来源的组成型启动子，其可驱动基因在水稻的愈伤组织和营养生长期的主要功能组织(根、叶、花、幼苗、
幼穗等)和/或生殖器官中高效表达，特别是别是3‑5叶期幼苗中高表达：一方面，本发明的
启动子OsUbipro可与植物内源或外源筛选标记基因组成植物转基因筛选表达盒和植物遗
传转化筛选载体，并附加其他功能元件进行植物遗传转化，用于植物组织培养和植物遗传
转化，为植物遗传转化的筛选提供了有效的工具和方法；另一方面，除可驱动基因在组培和
转基因过程中高效表达外，启动子OsUbipro还可驱动基因在后续转化苗的营养生长期地上
和地下部分的主要功能组织中高效表达。启动子OsUbipro为植物内源基因，在转基因过程
中不引入菌源等外源基因片段，不仅丰富了植物转基因的启动子资源，还可有效降低外源
基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众对转基因植物安全性的担忧，有利于转基
因植物的商业化应用，市场价值和社会效益均良好。

附图说明

[0045] 图1为本发明实施例2中qPCR分析OsUbipro启动子的组织表达情况；其中，Callus：继代15d愈伤组织；Seedlings：3‑5叶期幼苗；Flag leaf：孕穗期剑叶；Root，分蘖期根；
Young panicle：孕穗期5‑10cm幼穗。

[0046] 图2为本发明实施例3中pC0310载体图谱。

[0047] 图3为本发明实施例3中本发明实施例3中pCUAU载体经XbaI和HindIII酶切的电泳图；其中，M为Marker，CK为未酶切的pCUAU重组质粒，1‑2为酶切的pCUAU重组质粒，可切出大
小约为2.9kb片段。

[0048] 图4为本发明实施例3中pCUAU载体图谱。

[0049] 图5为本发明实施例4中转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为Marker，1为pCUAU重组质粒阳性对照，2‑8为转pCUAU重组质粒农杆菌单克隆菌液样品。

[0050] 图6为本发明实施例5中双草醚筛选培养基筛选愈伤组织40d结果，1为含pC0310载体的农杆菌侵染后筛选的愈伤，2为包含pCUAU的农杆菌侵染后筛选的愈伤。

[0051] 图7为本发明实施例6中转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为Marker，1为阳性对照、8为ZH11非转基因植株基因组DNA，2‑7为筛选获得的转基因植株基因组DNA。

[0052] 图8为本发明实施例7中转基因T0代株系5叶期喷施20x双草醚抗性测试结果；图中白色箭头所指为野生型对照ZH11，其余为转基因T0代株系，BS20×表示喷施20x浓度双草
醚，0d、3d、7d及14d表示喷施除草剂0天、3天、7天及14天。

具体实施方式

[0053] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技
术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

[0054] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0055] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0056] 实施例1启动子OsUbipro的获得

[0057] 通过启动功能预测软件PlantCARE及PlantPAN等对OsUbi基因上游序列约1756bp序列(SEQ ID NO.1)进行生物信息学分析发现，该序列富含多种与启动子相关的顺式作用
元件如CAAT‑box，TATA‑box等，表明该SEQ ID NO.1序列具有植物细胞启动子的结构特征。
且经PlantPAN分析，其375‑1256bp序列富含CpG岛，而CpG岛也是真核生物启动子的序列特
征之一，因此推测这段序列应具有启动子活性，且其核心序列为375‑1256bp区域。

[0058] 分别截取不同长度的OsUbi基因上游序列进行启动子活性鉴定，经不断筛选和对比，最终确定将SEQ ID NO.1所示的序列作为启动子序列，并将其命名为OsUbipro，启动子
OsUbipro能够驱动基因在水稻的主要组织和器官中高效表达。

[0059] 启动子OsUbipro可采用如下引物扩增得到：

[0060] 0310‑UAU‑F:CGTTTTTAATGTATGCTCCACCATGttggGTCGACCTGATGATTATTTTGTTGATC(SEQ ID NO.2)；

[0061] 0310‑UAU‑Rv1：CGTAGCCATGGCTGCACACACAATTACCGAA(SEQ ID NO.3)。

[0062] 实施例2启动子OsUbipro的表达分析

[0063] 利用qPCR(荧光定量PCR)对OsUbipro下游基因的表达模式进行鉴定，具体方法如下：

[0064] 分别取ZH11的根、叶、幼穗、幼苗、愈伤，提取总RNA，并进行反转录获得cDNA。在Thermo PikoReal96实时荧光定量PCR系统中，以Actin基因为内参，检测OsUbipro下游
OsUbi基因的表达。

[0065] RT‑PCR引物序列：

[0066] OsUbi‑qRtF2：GGCCGCACCTTGGCTGACTA(SEQ ID NO.6)

[0067] OsUbi‑qRtR2：GATCTGCATCCCACCCCTGA(SEQ ID NO.7)

[0068] Actin‑F：AGCATGAAGATCAAGGTGGTC(SEQ ID NO.8)

[0069] Actin‑R：GCCTTGGCAATCCACATC(SEQ ID NO.9)

[0070] 荧光定量PCR反应体系及程序如下：

[0071] 程序：94℃预变性7min，94℃变性15s，65℃退火15s；72℃延伸15s(荧光检测)；40个循环；60℃保温，30s。溶解曲线程序：60‑95℃(每升高0.2℃，保持1s)；20℃保温，10s；结
束。

[0072]

[0073] 程序：94℃预变性7min，94℃变性15s，58℃退火15s；72℃延伸15s(荧光检测)；40个循环。溶解曲线程序：60‑95℃(每升高0.2℃，保持1s)；20℃保温，10s；结束。

[0074]

[0075] 荧光定量PCR扩增结果显示，目标基因和内参基因的熔解曲线峰均为单一峰形，形状锐利。提示各样品熔解温度均一，扩增产物特异性好，未见非特异的双链DNA产物或引物
二聚体。扩增曲线光滑平稳，荧光吸收图谱的S形曲线形状完好，符合定量检测要求。采用比
‑△△Ct
较阀值法(2 法)进行相对定量(Liva K J,Schmittgen T D.Analysis of relative 
gene expression data using real‑time quantitative PCR and 2(‑Delta Delta C
(T))Method[J].Methods,2001,25(4):402‑408.)结果表明，OsUbipro驱动下游基因在检测
的各主要水稻器官组织中高效表达，3‑5叶期幼苗表达量最高，其余组织中均表达量较高，
孕穗期(5‑10cm幼穗)表达量略低，如图1所示。与应用于组培与转基因及后续转化苗地上部
分高效表达需求吻合。

[0076] 实施例3构建含启动子OsUbipro的植物转基因表达盒和载体

[0077] 1、含启动子OsUbipro的植物转基因表达盒的制备

[0078] 本发明的植物转基因表达盒OsUbip‑ALSm‑OsUbiT(序列如SEQ ID NO.4)的构建方法如下：

[0079] 设计引物0310‑UAU‑F/0310‑UAU‑Rv1从水稻基因组中扩增启动子OsUbip片段；利用引物0310‑UAU‑F2/0310‑UAU‑Rv2从合成的水稻ALS突变基因(ALSm1)片段中扩增获得目
的基因ALSm1片段；利用引物0310‑UAU‑F3/0310‑UAU‑Rv从水稻基因组中扩增获得终止子
OsUbiT片段。其中，引物0310‑UAU‑F和0310‑UAU‑Rv的5’端均有15个左右核苷酸序列与载体
相应连接位置重复；相邻片段的上下游引物5’端也有15bp重复(0310‑UAU‑Rv1与0310‑UAU‑
F2，0310‑UAU‑Rv2与0310‑UAU‑F3)，以便后续利用Gibson Assembly重组连接。

[0080] 上述引物序列如下：

[0081] 0310‑UAU‑F:CGTTTTTAATGTATGCTCCACCATGttggGTCGACCTGATGATTATTTTGTTGATC(SEQ ID NO.2)；

[0082] 0310‑UAU‑Rv1：CGTAGCCATGGCTGCACACACAATTACCGAA(SEQ ID NO.3)；

[0083] 0310‑UAU‑F2：TGTGCAGCCATGGCTACGACCGCCGC(SEQ ID NO.10)；

[0084] 0310‑UAU‑Rv2：GGCTGAGGACAGGCCTTTAATACACAGTCCTGCCATCA(SEQ ID NO.11)；

[0085] 0310‑UAU‑F3：ATTAAAGGCCTGTCCTCAGCCATAGAGCTG(SEQ ID NO.12)；

[0086] 0310‑UAU‑Rv:

[0087] TGCCCGGGCCTGCAgGACAAATTTGTTTGTCAGATCAAATTTTTAAGC(SEQ ID NO.13)。

[0088] PCR扩增反应体系如下：

[0089]

[0090] PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55‑65℃退火30s，68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸10min，16℃结束。

[0091] 引物0310‑UAU‑F和0310‑UAU‑Rv1扩增的PCR产物为OsUbiP片段，经1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为1756bp产物；引物0310‑UAU‑F2和0310‑UAU‑Rv2扩增的PCR产物为ALSm1片
段，1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为1941bp；引物0310‑UAU‑F3和0310‑UAU‑Rv扩增的PCR产
物为OsUbiT片段，1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为310bp。

[0092] 2、植物遗传转化载体的构建

[0093] 使用Gibson Assembly方法，将上述1中的扩增产物插入到pC0310载体(pC0310为发明人依托pCAMBIA1300载体骨架，经过改造获得，其中主要删除了其潮霉素筛选元件及相
邻区域不必要区域，以使得T‑Border内部除多克隆位点外不含其它菌源序列。因此，在T‑
Border中后续连入植物源序列，转入植物时降低公众对转基因担忧，载体图谱见图2)BstXI
和PstI双酶切位点间，具体方法如下：

[0094] (1)用BstXI+PstI对载体质粒pC0310进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用E.Z.N.A. Gel Extraction kit(Omega,下同)回收7kb左右大小条带，得到pC0310线性片
段。

[0095] BstXI+PstI双酶切反应体系如下：

[0096]

[0097] (2)2×Lightening Cloning Kit连接试剂盒 连接OsUbip‑ALSm1‑OsUbiT表达盒到pC0310载体上，连接体系如下：

[0098]

[0099] 连接程序：50℃，30min。

[0100] (3)转化：取上述连接产物2μl，加入到大肠杆菌感受态细胞中，轻微混匀，冰浴半小时；用电转仪1.8KV电击转化大肠杆菌感受态细胞；加入LB培养基1ml，37℃220rpm振荡培
养1h，5000rpm离心30s，弃800μl上清，将剩余菌体与培养基混匀，涂布于含卡那霉素的LB平
板上。37℃培养16h左右，挑取单菌落，用特异性引物(0310‑F2和0310‑R2)做菌落PCR验证，
挑选阳性菌落，37℃、220rpm摇菌过夜，利用高纯质粒小提试剂盒(中科瑞泰)提取质粒，酶
切检测正确后(如图3)，保菌并送测序。命名为pCUAU，载体图谱见图4，测序得到其核苷酸序
列如SEQ ID NO.3所示。

[0101] 引物序列：

[0102] 0310‑F2:GGGCCATACTTGTTGGATATCAT(SEQ ID NO.14)；

[0103] 0310‑R2:TTGTTCATGGCGTAATGTCTCC(SEQ ID NO.15)。

[0104] 实施例4农杆菌转化及鉴定

[0105] 取‑80℃保存的农杆菌EHA105感受态细胞加1μl实施例3中得到的测序正确pCUAU质粒，1.8KV电击转化。涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48h
左右，挑取单菌落摇菌过夜，用特异性引物(0310‑F2和0310‑R2)菌液PCR验证(图5)，可扩增
得到约900bp目的片段，挑选阳性克隆(工程农杆菌)，摇菌36‑48h，保存菌液用于侵染。

[0106] 实施例5农杆菌介导遗传转化

[0107] 诱导：将中花11(ZH11)的种子经次氯酸钠消毒后置于诱导培养基(N6+2.4‑D 3mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L)上，28℃常温暗培养30‑40d，得到诱
导的愈伤后继代培养30‑40d；

[0108] 筛选：将实施例4得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化上述愈伤组织，共培养3d后，清洗5‑6遍，转移至含0.8μmol双草醚的筛选培养基上，30℃暗培养30‑
50d，结果如图6所示，其中1为含pC0310载体的农杆菌侵染后筛选的愈伤，愈伤全部褐化死
亡，2为包含pCUAU的农杆菌侵染后筛选的愈伤，可筛选获得抗性愈伤；

[0109] 分化：筛选获得的抗性愈伤转移至含0.5μmol双草醚的分化培养基上，分化25‑30d获得阳性苗；

[0110] 生根：经分化获得的阳性苗转移至含0.5μmol双草醚的生根培养基上，生根7‑15d最后获得阳性转基因植株；

[0111] 炼苗及移栽：将根系生长旺盛的转化株系开启瓶口封口膜，加无菌水覆盖培养基1‑2cm厚，置于室温下与空气接触进行炼苗2‑3d后，移栽至温室栽培。

[0112] 实施例6转基因株系鉴定

[0113] 为了鉴定实施例5获得的株系是否为转基因株系，本实施例对经筛选培养、分化培养和生根培养获得的部分阳性转基因植株进行PCR验证。

[0114] 首先提取样品DNA，DNA提取步骤如下：取约2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μl 1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20‑30min，每
5min颠倒混匀1次；12000rpm离心10min；吸取400μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰
预冷的无水乙醇，‑20℃冰置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入500μl 75％乙醇，颠
倒漂洗，8000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μl ddH2O溶解DNA。

[0115] 为了区分水稻内源基因，设计一对引物(0310‑F3/0310‑R3)对转基因株系基因组DNA样品进行PCR扩增检测，该引物对以内源水稻基因组为模板无法扩增获得片段，以转基
因表达盒为模板扩增获得片段大小为875bp。

[0116] 引物序列如下：

[0117] 0310‑F3:TGCTTCTGTGGCTAACCCAGGT(SEQ ID NO.16)；

[0118] 0310‑R3:AGGCGGGAAACGACAATCTAAG(SEQ ID NO.17)。

[0119] 以转化用质粒DNA作为阳性对照，ZH11基因组DNA作为阴性对照。

[0120] PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，55‑65℃退火45s；72℃延伸1.5min；30‑35个循环；72℃再延伸10min；16℃结束。

[0121] PCR反应体系如下：

[0122]

[0123]

[0124] PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示，结果表明，大部分转基因样品中含有875bp的转基因条带，与载体对照大小相同；而阴性对照ZH11无法扩出条带。

[0125] 实施例7抗性表型鉴定

[0126] 对实施例6鉴定的转基因株系进行抗性表型鉴定，具体如下：

[0127] 选取部分生根材料在移栽7‑14天后(4叶期)，喷施20×(60mg/m2)双草醚。7天后，野生型对照WT(ZH11)叶片已枯黄，转基因T0代植株多数正常生长，未出现黄化。14天后，野
生型对照WT(ZH11)及转基因敏感株系已濒死，存活株系为双草醚抗性株系(图8)。

[0128] 上述结果表明，通过筛选获得的导入OsUbipro启动子驱动的ALS突变基因的转基因水稻株系高抗双草醚。OsUbipro启动子可驱动目的基因在愈伤组织水平，根中，苗期、分
蘖期叶片中稳定表达，是一个高效的组成型启动子。由OsUbipro启动子所组成的转基因筛
选表达盒、表达载体在转基因植物制备中具有较高的效率。

[0129] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰
也应视为本发明的保护范围。