藏药甘青青兰DtC4H基因及其应用

摘要

本发明公开了藏药甘青青兰DtC4H基因及其应用，藏药甘青青兰DtC4H基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3第48至1565位所示，该基因能够在甘青青兰迷迭香酸代谢相关途径中发挥重要作用，因此可以利用该基因构建超表达载体获得高含量的迷迭香酸发根，对未来实现迷迭香酸等甘青青兰次生代谢工程具有重要意义，具有良好的应用前景。

权利要求

1.藏药甘青青兰DtC4H基因在提高植物迷迭香酸含量中的应用，其特征在于：所述藏药甘青青兰DtC4H基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3第48至1565位所示；所述植物为甘青青兰。

2.含有藏药甘青青兰DtC4H基因的重组表达载体在提高植物迷迭香酸含量中的应用，其特征在于：所述藏药甘青青兰DtC4H基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3第48至1565位所示；所述植物为甘青青兰。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体由SEQ ID NO.3第48至

1565位连入PHB载体的SacI和BamHI酶切位点。

说明书

藏药甘青青兰DtC4H基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及藏药甘青青兰DtC4H基因，还涉及藏药甘青青兰DtC4H基因的应用。

背景技术

[0002] 甘青青兰(Dracocephalum tanguticum Maxim.)又名唐古特青兰，为常用藏药，藏药名音译“知羊格”、“知羊高”。甘青青兰为多年生草本，有特殊气味，茎直立高35‑55cm，钝
四棱形，上部被倒向小毛，中部以下几无毛，节多，节间长2.5‑6cm，在叶腋中生有短枝。产甘
肃西南，青海东部，四川西部(南至乡城)及西藏东南部(察隅)；生于干燥河谷的河岸、田野、
草滩或松林边缘，海拔1900‑4000m，全草入药，治胃炎、肝炎、头晕、神疲、关节炎及疖疮。据
《中国藏药》第一卷记载甘、苦，凉；清肝热、胃热，止血，愈疮，甲水，主治肝热病、胃热病、黄
水病、便血、疮疡不愈；幼苗用于腹水、浮肿。青甘青青兰的化学成分主要可分为挥发油类、
黄酮及黄酮苷类、植物甾醇类、有机酸及其酯类、无机元素等，其中甘青青兰的有效药用成
分之一为迷迭香酸。迷迭香酸(rosmarinic acid)是从迷迭香中分离得到的一种水溶性天
然酚酸类化合物，以唇形科和紫草科中含量最高。迷迭香酸用途广泛，在制药、食品、保健
品、化妆品等领域具有重要价值，特别是在医药方面具有显著的抗炎、抗氧化、抗过敏、抗肿
瘤、抗抑郁等活性。迷迭香酸代谢途径由苯丙烷代谢途径和酪氨酸代谢途径组成，其中在苯
丙烷代谢途径中肉桂酸‑4‑羟化酶(C4H)具有重要作用，肉桂酸‑4‑羟化酶属细胞色素P450
单加氧酶超家族，催化反式肉桂酸对位转变成4‑羟基肉桂酸，属于迷迭香酸合成途径中的
一个关键酶。利用发根农杆菌Ri质粒诱导药用植物产生的毛状根具有操作简单、生长迅速、
可提高次生代谢产物含量等优点，已成为药用植物次生代谢产物生产的一种新手段。本发
明通过克隆甘青青兰DtC4H基因，转化甘青青兰发根可以作为生物反应器，对较高产量生产
迷迭香酸提供了方法。

发明内容

[0003] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种藏药甘青青兰DtC4H基因；本发明的目的之二在于提供含有所述藏药甘青青兰DtC4H基因的重组表达载体；本发明的目的之三在
于提供所述藏药甘青青兰DtC4H基因在提高植物迷迭香酸含量中的应用。

[0004] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0005] 1、藏药甘青青兰DtC4H基因，所述藏药甘青青兰DtC4H基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3第48至1565位所示。

[0006] 2、含有所述藏药甘青青兰DtC4H基因的重组表达载体。

[0007] 优选的，所述重组表达载体由SEQ ID NO.3第48至1565位连入PHB载体的SacI和BamHI酶切位点。

[0008] 3、所述藏药甘青青兰DtC4H基因在提高植物迷迭香酸含量中的应用。

[0009] 优选的，所述植物为甘青青兰。

[0010] 本发明的有益效果在于：本发明克隆获得了甘青青兰DtC4H基因，该基因能够在甘青青兰迷迭香酸代谢相关途径中发挥重要作用，因此可以利用该基因构建超表达载体获得
高含量的迷迭香酸发根。本发明对甘青青兰的发根体系进行探索，建立了甘青青兰的发根
体系；本发明构建了高效的生产迷迭香酸的发根生物反应器，未来实现迷迭香酸等甘青青
兰次生代谢工程具有重要意义，具有良好的应用前景。

附图说明

[0011] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

[0012] 图1为DtC4H基因酶切验证图(M： Plus DNA Marker；1：PHB‑DtC4H酶切图，DtC4H片段为1641bp)。

[0013] 图2为除菌完毕的甘青青兰转基因(DtC4H)发根在MS培养基上生长图。

[0014] 图3为甘青青兰DtC4H转基因发根阳性根系筛选图(M： Plus DNA Marker；1‑4为不同发根的筛选图，其中具有较亮条带为阳性发根，如图中2与3两个发根
系)。

[0015] 图4为通过UPLC检测甘青青兰转化C4H基因发根含量。

具体实施方式

[0016] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0017] 实施例1、克隆甘青青兰DtC4H基因序列

[0018] 提取甘青青兰总RNA，经反转录试剂盒(Promega)反转录获得cDNA。根据现有的甘青青兰转录组库，筛选正确的DtC4H基因，设计甘青青兰DtC4H基因上、下游引物对：

[0019] 上游引物序列C4H‑F：5’‑tcagtcctaaccaccattctcc‑3’(SEQ ID NO.1)；

[0020] 下游引物序列C4H‑R：5’‑gcaatgttcatgccaatgccag‑3’(SEQ ID NO.2)；

[0021] 以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；最后72℃后延伸5min，进行PCR扩
增，扩增产物经回收后经测序获得甘青青兰C4H基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0022] 实施例2、构建甘青青兰PHB‑DtC4H载体

[0023] 如SEQ ID NO.3所示的甘青青兰C4H基因序列使用带酶切位点的引物进行PCR，其中上游引物为：5’‑cggatccatggatctcatcctcctcgagaag‑3’(SEQ ID NO.4)所示，其中带酶
切位点的下游引物为：5’‑cgagctcatgttcatgccaatgccagag‑3’(SEQ ID NO.5)，扩增条件为
95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；最后72℃后延伸
8min，‑20℃保存，扩增产物为带酶切位点的C4H基因，如SEQ ID NO.7所示。

[0024] 然后对PHB载体与带酶切位点DtC4H基因用SacI和BamHI进行双酶切，使用胶回收试剂盒回收。将回收后的DtC4H基因与PHB载体片段按照摩尔浓度3:1的比例使用T4 DNA连
接酶进行连接，连接条件为4℃，12～16h，构成PHB‑DtC4H超表达载体。将构建的载体进行
SacI和BamHI酶切验证，结果如图1所示。

[0025] 转化大肠杆菌，转化条件为：从超低温冰柜中取出DH5α感受态，融化后冰浴5min，取2μL连接产物加入10μL感受态轻轻混匀冰浴30min；42℃热激90s，迅速放于冰中4min，超
净台中加入800μL LB培养基，37℃，220rpm培养1h；进行离心12000rpm，30s，涂板后37℃过
夜培养。挑取单克隆进行跨载体PCR检测，以上游引物SEQ ID NO.4和载体rRBC引物5’‑
gcattgaacttgacgaacgttgtcga‑3’(SEQ ID NO.6)进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性
8min；94℃变性30s，58℃退火0.5min，72℃延伸2min，共33个循环；最后72℃延伸5min。挑选
阳性菌株提取PHB‑C4H质粒，‑20℃保存。

[0026] 实施例3、甘青青兰转化发根的条件

[0027] 首先获取甘青青兰无菌苗，采用种子消毒无菌萌发法获得，实验过程为，首先选取饱满无虫害无霉菌种子，然后在超净工作台中，用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗3‑5次，再
用2.5％次氯酸钠消毒10min，用无菌水冲洗5次，最后，用无菌吸水纸吸干种子表面液体，整
齐摆放在MS固体培养基上，在20℃，2000Lux光照强度的条件培养。取培养15d的幼苗，剪取
甘青青兰无菌苗的子叶，叶柄部位保留2mm的长度，放入空MS固体培养基预培养3d。取预培
养叶片在农杆菌MS悬液中浸泡12min，用无菌吸水纸吸干表面余菌，转到共培养培养基MS
上。黑暗条件共培养2d，用400mg/L头孢水冲洗2次，用无菌吸水纸吸掉多余液体，更换到筛
选培养基继续培养，培养条件为黑暗，温度为15℃到20℃之间，除菌完毕后转入不含抗生素
的MS基本培养基培养。

[0028] 所用培养基配方如下：

[0029] MS固体培养基：MS粉3.47g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L，pH 5.8；

[0030] MS共培养培养基：MS粉3.47g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L+乙酰丁香酮20，pH 5.8；

[0031] MS除菌筛选培养基：MS粉3.47g/L+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L+潮霉素B 3mg/L+头孢200mg/L，pH 5.8。

[0032] 获得的发根如图2所示。

[0033] 实施例4、转基因发根的检测

[0034] 将甘青青兰发根除菌完成，在无抗生素的MS培养基上培养无农杆菌污染。减取适量的发根提取DNA，然后利用PCR技术检测，以上游引物SEQ ID NO.4和载体rRBC引物SEQ ID 
NO.6进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性8min；94℃变性30s，58℃退火0.5min，72℃延伸
2min，共35个循环，检测结果如图3所示，确认获得转基因发根，将阳性个体进行液体培养，
下一步将挑选迷迭香酸含量高的进行大量培养，为大量提取迷迭香酸提供一种可行的方
法。

[0035] 实施例5、迷迭香酸含量检测

[0036] 通过UPLC检测甘青青兰转化C4H基因发根含量，检测结果如图4所示。结果显示，转基因根系中C4H‑2的含量最高，达到了59.97mg/g，而对照组CK含量为41.5mg/g。整体而言，
甘青青兰转C4H基因的12个根系中，含量相对于对照提高的有9个，说明C4H基因作为迷迭香
酸合成途径的关键酶基因，对于提高甘青青兰迷迭香酸含量具有明显作用。

[0037] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明
的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。