本发明公开了一种快速对番茄果实中花青素进行种类解析和含量测定的方法。本发明使用甲醇/甲酸(9:1,v/v)为溶剂，加入内标后，对番茄果实中花青素进行液液萃取，4℃提取12h后，离心取上清，过膜后，对花青素的质谱信息和光谱信息进行同时采集，对番茄果实中花青素进行定量，并进行结构解析。该检测方法前处理过程简易，检测结果精确，不需要繁琐的前处理提纯步骤。该发明可用于对番茄果实中花青素进行定性定量分析。
1.一种对番茄果实中花青素进行种类解析和含量测定的方法，包括：
1）将原料冷冻磨碎后，使用提取剂a提取，得到提取液a；离心，收集上清液，氮气吹干，再加入提取剂b重新溶解，过滤，收集滤液，得到提取液b；
所述提取步骤中，所述提取剂a为含内标的溶液；所述内标为芍药素3‑葡萄糖苷；
所述提取剂a中，溶剂为由甲醇和甲酸组成的混合液；所述甲醇和甲酸的体积比为7‑9：
1；所述提取剂a中，内标的浓度为1‑5 µg/mL；
所述提取剂b为由甲醇和甲酸组成的混合液；所述甲醇和甲酸的体积比为7‑9：1；
2）将所述提取液b用液相色谱和质谱联用进行花青素种类的解析；
所述步骤2）中，液相色谱检测的条件如下：色谱柱类型：ACQUITY UPLC CSH C18；
色谱柱参数：2.1 mm × 100 mm i.d., 1.7 μm；
流动相A：由体积比为95:5的由乙腈和甲酸组成的混合液；
流动相B：由体积比为95:5的由水和甲酸组成的混合液；
梯度洗脱程序为：所述流动相A初始体积比例为2.5%，流动相A在5 min内从2.5%到10%，然后在15 min内从10%升到25%，保持5 min，然后在5 min内从25%变为2.5%；
所述步骤2）中，所述质谱检测的条件如下：质谱为正离子模式；
母离子采集范围：900 m/z‑1000 m/z；
光谱条件：二极管阵列检测器波长范围为190 nm‑800 nm；
所述步骤2）中，解析所得花青素的种类包括飞燕草素‑3‑（顺式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑（咖啡酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、飞燕草素‑3‑（反式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、飞燕草素‑3‑（阿魏酸酰氧基）‑芸香糖苷‑
5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑（顺式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑（反式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑（阿魏酸酰氧基）‑芸香糖苷‑
5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑（顺式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑（反式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑（阿魏酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑（反式‑对香豆酸酰氧基‑鼠李糖苷）‑葡萄糖苷‑5‑葡萄糖苷和锦葵素‑3‑（对甲氧基‑反式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷；
3）对所述提取液b所得不同种类花青素的含量进行定量分析，完成所述番茄果实中花青素的种类解析和含量测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述甲醇和甲酸的体积比为9:1；
所述提取剂a中，内标的浓度为3.75 µg/mL；
所述提取剂a与所述原料的用量比为0.2 ‑ 0.8 g：1 ‑ 4 mL；
所述提取步骤中，温度为‑20℃至5℃；时间为10 ‑ 14h；所述提取剂b中，所述甲醇和甲酸的体积比为9:1；所述提取剂b与所述上清液的体积比为：0.5 ‑ 2；
所述离心步骤中，转速为2500 ‑ 4500rpm；时间为18 ‑ 22min。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述提取步骤中，温度为4℃；时间为12 h；
所述离心步骤中，转速为3900 rpm；时间为20 min。
4.根据权利要求1‑3中任一所述的方法，其特征在于：所述飞燕草素‑3‑（顺式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为11.41min；MS保留时间为11.55min；
所述矮牵牛素‑3‑（咖啡酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为11.71min；
所述飞燕草素‑3‑（反式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为
11.86min；MS保留时间为11.97min；
所述飞燕草素‑3‑（阿魏酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为12.45min；
所述矮牵牛素‑3‑（顺式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为
13.01min；MS保留时间为13.16min；
所述矮牵牛素‑3‑（反式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为
13.35min；MS保留时间为13.52min；
所述矮牵牛素‑3‑（阿魏酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为13.95min；
所述锦葵素‑3‑（顺式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为
14.61min；MS保留时间为14.77min；
所述锦葵素‑3‑（反式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为
14.99min；MS保留时间为15.08min；
所述锦葵素‑3‑（阿魏酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为15.33min；MS保留时间为15.68min；
所述矮牵牛素‑3‑（反式‑对香豆酸酰氧基‑鼠李糖苷）‑葡萄糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为15.73min；MS保留时间为15.90min；
所述锦葵素‑3‑（对甲氧基‑反式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为16.07min；MS保留时间为16.18min。
5.根据权利要求1‑3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3）定量分析中，定量方法为内标当量进行半定量；以所述花青素在535 nm处紫外吸收色谱图的峰面积进行定量。
6.根据权利要求1‑3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，线性范围为1 ‑
标准曲线为y=221.941 x‑346.284；其中，y为内标物峰面积；x为内标物的浓度值，单位为μg/mL；
7.根据权利要求1‑3中任一所述的方法，其特征在于：所述花青素选自矮牵牛素‑3‑（顺式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑（顺式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑（反式‑对香豆酸酰氧基‑鼠李糖苷）‑葡萄糖苷‑5‑葡萄糖苷和锦葵素‑3‑（对甲氧基‑反式‑对香豆酸酰氧基）‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷中至少一种。
8.一种对番茄果实中花青素进行种类解析的方法，包括：权利要求1‑7中任一所述步骤
9.一种对番茄果实中花青素进行含量测定的方法，包括：权利要求1‑7中任一所述步骤
一种快速对番茄果实中花青素进行种类解析和含量测定的
方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种快速对番茄果实中花青素进行种类解析和含量测定的方法。
背景技术
[0002] 由于氧自由基吸收能力，花青素是一类对人体健康有益的物质，同时也具有药用价值。在植物中，花青素可以提高植物抵抗逆境的能力。因此，花青素的识别，纯化及其结构解析成为研究的热点。花青素的结构母核是2‑苯基苯并吡喃阳离子，主要包括矢车菊素(cyanindin)、天竺葵素(pelargonidin)、飞燕草素(delphinidin)、芍药素(peonidin)、矮牵牛素(petunidin)和锦葵素(malvidin)几大类。花青素的结构解析很重要，但因其结构相似度高，解析困难。
[0003] 花青素是通过类黄酮代谢通路合成的，如图1所示。苯丙氨酸在一系列酶的作用下，合成花青素，包括PAL，苯丙氨酸氨裂解酶；CA4H，肉桂酸4‑羟化酶；4CL，4‑香豆酸辅酶A连接酶；CHS，查尔酮合成酶；CHI，查耳酮异构酶；F3H，黄烷酮‑3‑羟化酶；FLS，黄酮醇合酶；F3’H，类黄酮3'‑羟化酶；F3’5’H，类黄酮‑3',5'‑羟化酶；OMT1，黄酮3'‑O‑甲基转移酶1；
DFR，二氢黄酮醇还原酶等。最后经过糖基化修饰和酰基化修饰形成花青素后，运输到液泡中存储。
[0004] 番茄中的花青素是在光诱导下进行生物合成的。目前，番茄中报道的花青素有9种。其中，矮牵牛素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷是番茄花青素的主要成分。番茄是一种市场很受欢迎的果实，但是其果实花青素含量并没有优化。因此，有必要通过研究花青素的合成机理优化番茄中花青素的含量。尽管，研究者通过尝试已经提高了番茄果实中的花青素含量，但是其精确调控还很困难。其中，重要的一个原因就是番茄中合成的花青素详细结构并未被完全解析。花青素的结构修饰包括羟基化、甲基化、糖基化和酰基化。羟基化和甲基化是花青素结构被羟基和甲基直接修饰。糖基化是在2‑苯基苯并吡喃阳离子的羟基上由单糖、二糖或三糖进行修饰。酰基化修饰是在糖基化修饰后，在糖苷的羟基上进一步加香豆酸、咖啡酸和阿魏酸等进行修饰。这些结构修饰会增加花青素的稳定性。
[0005] 前处理及检测过程对花青素的快速定量及其结构的精确解析有重要影响。之前的研究，大多采用冻干法处理样品。由于冻干时间较长，花青素在此过程会有部分损失。花青素提取后的纯化多采用柱层析法或固相萃取法。柱层析除了需要特殊的柱子，实验技术要求高。固相萃取法需要特殊的设备及纯化柱，价格昂贵，并且要经过活化、平衡、上样、清洗和洗脱等步骤。由于处理流程长，在纯化过程中，含量较少的花青素可能会丢失，如锦葵素类花青素。为了保证前处理完后，有足够的花青素用于检测，需要采集大量样品，如1kg番茄果皮。同时，也要使用大量的溶剂已达到完全萃取的目的。另外，萃取溶剂中加酸会增加花青素的稳定性，但是无机酸可能会导致样品降解，如盐酸可能导致糖苷键的水解。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种快速对番茄果实中花青素进行种类解析和含量测定的方法。
[0007] 本发明提供了一种对番茄果实中花青素进行种类解析和含量测定的方法，该方法包括：
[0008] 1)将原料冷冻磨碎后，使用提取剂a提取，得到提取液a；离心，收集上清液，氮气吹干，再加入提取剂b重新溶解，过滤，收集滤液，得到提取液b；
[0009] 所述原料为分开的番茄果皮和番茄果肉；
[0010] 2)将所述提取液b用液相色谱和质谱联用进行花青素种类的解析；
[0011] 3)对所述提取液b所得不同种类花青素的含量进行定量分析，完成所述番茄果实中花青素的种类解析和含量测定。
[0012] 本发明还提供了一种对番茄果实中花青素进行种类解析的方法，该方法包括：前述方法的步骤1)和步骤2)。
[0013] 本发明还提供了一种对番茄果实中花青素进行含量测定的方法，该方法包括：前述方法的步骤1)‑步骤3)。
[0014] 上述方法的所述步骤1)所述冷冻步骤中，冷冻方式为液氮冷冻；
[0015] 所述提取步骤中，所述提取剂a为含内标的溶液；所述内标具体为芍药素3‑葡萄糖苷(也即peonidin‑3‑glucoside chloride或氯化芍药素‑3‑O‑葡萄糖苷)；
[0016] 所述提取剂a中，溶剂为由甲醇和甲酸组成的混合液；所述甲醇和甲酸的体积比为7‑9：1；具体为9:1；
[0017] 所述提取剂a中，内标的浓度具体为1‑5μg/ml；具体为3.75μg/ml；
[0018] 所述提取剂a与所述原料的用量比具体为0.2‑0.8g：1‑4ml；具体为0.4g：4ml；
[0019] 所述提取步骤中，温度为‑20℃至5℃；具体为4℃；时间为10‑14h；具体为12h；
[0020] 所述提取剂b为由甲醇和甲酸组成的混合液；所述甲醇和甲酸的体积比为7‑9：1；具体为9:1；所述提取剂b与所述上清液的体积比为：0.5‑2；具体为1:2；所述上清液的具体用量为2ml；
[0021] 所述离心步骤中，转速为2500‑4500rpm；具体为3900rpm；时间为18‑22min；具体为20min；
[0022] 所述过滤步骤中，滤膜孔径为0.22μm。
[0023] 所述步骤2)中，液相色谱检测的条件如下：
[0024] 色谱柱类型：ACQUITY UPLC CSH C18；
[0025] 色谱柱参数：2.1mm×100mm i.d.,1.7μm；
[0026] 流动相A：由体积比为95:5的由乙腈和甲酸组成的混合液；
[0027] 流动相B：由体积比为95:5的由水和甲酸组成的混合液；
[0028] 梯度洗脱程序为：所述流动相A初始体积比例为2.5％，流动相A在5min内从2.5％到10％，然后在15min内从10％升到25％，保持5min，然后在5min内从25％变为2.5％；
[0029] 流速：0.15ml/min；
[0030] 柱温：25℃；
[0031] 自动进样器温度：20℃；
[0032] 进样体积：1μl。
[0033] 所述步骤2)中，所述质谱检测的条件如下：
[0034] 质谱为正离子模式；
[0035] 离子源：ESI源；
[0036] 毛细管电压：2.0kV；
[0037] 离子源温度：100℃；
[0038] 脱溶剂气温度：300℃；
[0039] 脱溶剂气流速：800L/h；
[0040] 锥孔气流：50L/h：
[0041] 质谱采集模式：Fast DDA模式；
[0042] 分析模式：分辨率模式；
[0043] 母离子采集范围：900m/z‑1000m/z；
[0044] 子离子采集范围：50m/z‑1000m/z；
[0045] 子离子最多选取5个用于定性分析；
[0046] 碰撞能量范围为6V‑80V；
[0047] 光谱条件：二极管阵列检测器波长范围为190nm‑800nm。
[0048] 所述步骤2)中，解析所得花青素的种类包括飞燕草素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(咖啡酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、飞燕草素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、飞燕草素‑3‑(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基‑鼠李糖苷)‑葡萄糖苷‑5‑葡萄糖苷和锦葵素‑3‑(对甲氧基‑反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷；
[0049] 其中，所述飞燕草素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为11.41min；MS保留时间为11.55min；
[0050] 所述矮牵牛素‑3‑(咖啡酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为11.71min；MS保留时间为11.83min；
[0051] 所述飞燕草素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为11.86min；MS保留时间为11.97min；
[0052] 所述飞燕草素‑3‑(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为12.45min；MS保留时间为12.58min；
[0053] 所述矮牵牛素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为13.01min；MS保留时间为13.16min；
[0054] 所述矮牵牛素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为13.35min；MS保留时间为13.52min；
[0055] 所述矮牵牛素‑3‑(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为13.95min；MS保留时间为14.11min；
[0056] 所述锦葵素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为14.61min；MS保留时间为14.77min；
[0057] 所述锦葵素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为14.99min；MS保留时间为15.08min；
[0058] 所述锦葵素‑3‑(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为15.33min；MS保留时间为15.68min；
[0059] 所述矮牵牛素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基‑鼠李糖苷)‑葡萄糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为15.73min；MS保留时间为15.90min；
[0060] 所述锦葵素‑3‑(对甲氧基‑反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷的UV保留时间为16.07min；MS保留时间为16.18min。
[0061] 所述步骤3)定量分析中，定量方法为内标当量进行半定量；具体为以所述花青素在535nm处紫外吸收色谱图的峰面积进行定量。
[0062] 所述步骤3)中，标准曲线为y＝221.941x‑346.284；其中，y为内标物峰面积；x为内标物浓度值，单位为μg/mL；
[0063] 线性范围为1‑1000μg/mL；
[0064] 定量限<1μg/mL。
[0065] 具体的，所述花青素选自飞燕草素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(咖啡酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、飞燕草素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、飞燕草素‑3‑(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基‑鼠李糖苷)‑葡萄糖苷‑5‑葡萄糖苷和锦葵素‑3‑(对甲氧基‑反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷中至少一种；
[0066] 更具体选自矮牵牛素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基‑鼠李糖苷)‑葡萄糖苷‑5‑葡萄糖苷和锦葵素‑3‑(对甲氧基‑反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷中至少一种。
[0067] 本发明中所述番茄为各种已知种类的番茄；具体可为靛蓝番茄。
[0068] 本发明建立了一种番茄果实中花青素的快速定量方法，同时对其物质结构进行精确解析。本发明使用甲醇/甲酸(9:1,v/v)为溶剂，加入内标后，对番茄果实中花青素进行液液萃取，4℃提取12h后，离心取上清，过膜后，对花青素的质谱信息和光谱信息进行同时采集，对番茄果实中花青素进行定量，并进行结构解析。该方法所用样品量小、溶剂少、环境友好以及提取率高；前处理过程简易，检测结果精确，不需要繁琐的前处理提纯步骤。采用靛蓝番茄作为实验材料进行研究。研究结果显示，共在靛蓝番茄中检测到12种花青素，其中4种花青素未被报道过。本研究为番茄中花青素的进一步改良提供了良好的实验基础。本发明可用于对番茄果实中花青素进行定性定量分析。
附图说明
[0069] 图1为果实中花青素的生物合成途径。PAL，苯丙氨酸氨裂解酶；CA4H，肉桂酸4‑羟化酶；4CL，4‑香豆酸辅酶A连接酶；CHS，查尔酮合成酶；CHI，查耳酮异构酶；F3H，黄烷酮‑3‑羟化酶；FLS，黄酮醇合酶；F3’H，类黄酮3'‑羟化酶；F3’5’H，类黄酮‑3',5'‑羟化酶；OMT1，黄酮3'‑O‑甲基转移酶1；DFR，二氢黄酮醇还原酶。
[0070] 图2为靛蓝番茄果实红熟时期照片。本图展示了果实在植株上(a)，果实俯视图(b)，果实仰视图(c)，果皮撕下后(d)和横切图(e)。图片的比例尺为2cm。
[0071] 图3为液相色谱‑飞行时间质谱采集的靛蓝番茄果实果皮(a)和果肉(b)的色谱图。此外，本实验还采集了花青素的紫外光谱图。在保留时间13.35min(c)和14.99min(d)的花青素紫外光谱图如图所示。本实验还采集了靛蓝番茄果实果皮(e)和果肉(f)在紫外吸收峰
535nm处的色谱图。
[0072] 图4为发现的12种花青素二级质谱图(从图a至图i)。
具体实施方式
[0073] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0074] 仪器：UPLC‑QTOF/PDA(Waters ACQUITY UPLC I‑Class‑Xevo G2‑XS QTOF/PDA eLambda Detector)
[0075] 靛蓝番茄：购买于Johnny’s Selected Seeds(http://www.johnnyseeds.com/)；
[0076] 天平：购买于Sartorius。
[0077] 实施例1、采用液液萃取‑超高效液相色谱‑四级杆飞行时间质谱联用(LLE‑UPLC‑QTOF)对番茄果实中花青素的种类及含量进行分析
[0078] 1)将靛蓝番茄果实洗净，将果皮和果肉分离，靛蓝番茄果实红熟时期照片如图2所示，展示了果实在植株上(a)，果实俯视图(b)，果实仰视图(c)，果皮撕下后(d)和横切图(e)。
[0079] 将果皮和果肉在液氮中冷冻后，磨碎。
[0080] 分别称取果皮和果肉各0.4g在15ml棕色玻璃离心管中。
[0081] 加入4ml含15μg芍药素3‑葡萄糖苷(也即peonidin‑3‑glucoside chloride或氯化芍药素‑3‑O‑葡萄糖苷)的甲醇/甲酸(9:1,v/v)溶液，甲酸可以增加花青素的稳定性，同时又不至于使其水解。内标的当量用于花青素的定量，同时其损失率可以折算样品的损失率，以减少溶剂使用量。
[0082] 将提取液摇匀。
[0083] 在4℃条件下，提取12h。
[0084] 将15ml玻璃离心管3900rpm离心20min。
[0085] 取2ml上清液转入新15ml棕色玻璃离心管中。
[0086] 用氮气吹干2ml上清液。
[0087] 加1ml甲醇/甲酸(9:1,v/v)溶液重新溶解吹干的样品。
[0088] 溶解液过0.22μm有机滤膜至2ml棕色玻璃样品瓶中进行纯化后用于检测，大大简化了纯化步骤。
[0089] 2)色谱条件：色谱柱采用ACQUITY UPLC CSH C18(2.1mm×100mm i.d.,1.7μm)，流动相A为乙腈/甲酸(95:5,v/v)，流动相B为水/甲酸(95:5,v/v)，流速0.15ml/min，流动相A初始体积比例为2.5％，流动相A在5min内从2.5％到10％，然后在15min内从10％升到25％，保持5min，然后在5min内从25％变为2.5％。柱温箱温度保持25℃，自动进样器温度保持20℃。进样体积1μl。
[0090] 质谱条件：质谱为正离子模式，ESI离子源的参数如下：毛细管电压，2.0kV；离子源温度：100℃；脱溶剂气温度：300℃；脱溶剂气流速：800L/h；锥孔气流：50L/h。质谱采集采用Fast DDA模式。分析模式为分辨率模式。母离子采集范围为900m/z到1000m/z。子离子采集范围为50m/z到1000m/z。子离子最多选取5个用于定性分析。碰撞能量范围为6V到80V。
[0091] 光谱条件：二极管阵列检测器波长范围为190nm到800nm。
[0092] 液相色谱‑飞行时间质谱采集的靛蓝番茄果实果皮和果肉的色谱图如图3a和3b所示。此外，本实验还采集了花青素的紫外光谱图。在保留时间13.35min(c)和14.99min(d)的花青素紫外光谱图如图3c和3d所示，最大紫外吸收峰均为535nm。靛蓝番茄果实果皮和果肉在紫外最大吸收峰吸收峰535nm处的色谱图如图3e和3f所示。
[0093] 对花青素的光谱图和质谱信息进行分析，一共检测到12种花青素，12种花青素的子离子信息如图4a至图4i所示。
[0094] 图4a至图4i的子离子及推测的花青素结构如表1所示。
[0095] 表1、色谱图中发现的靛蓝番茄所含花青素及其二级结构信息。
[0096]
[0097]
[0098] *Dpd，飞燕草素；Ptd，矮牵牛素；Mv，锦葵素；Glc，葡萄糖苷；Rha，鼠李糖苷；pCouR，(对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷；CafR，(咖啡酸酰氧基)‑芸香糖苷；FerR，(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖
[0099] 花青素在MS中的保留时间比UV中稍有滞后，这是由于样品采集过程中先经过二极管阵列检测器，然后进入质谱进行检测。
[0100] 检测到的花青素从前到后依次为飞燕草素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(咖啡酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、飞燕草素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、飞燕草素‑3‑(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑(顺式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、锦葵素‑3‑(阿魏酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷、矮牵牛素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基‑鼠李糖苷)‑葡萄糖苷‑5‑葡萄糖苷和锦葵素‑3‑(对甲氧基‑反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷。其中，表1中加粗的四种花青素为本发明新发现的花青素。
[0101] 对12种花青素进行定性分析后，采用内标的当量对其进行定量分析。花青素的定量结果如表2所示。
[0102] 表2、靛蓝番茄果皮和果肉中花青素含量(mg/kg FW)。
[0103]
[0104] *结果为生物学重复的平均值±标准差(n＝3)。
[0105] 靛蓝番茄果皮中花青素含量为3977.93mg/kg，果肉中花青素含量为88.44mg/kg。其中，矮牵牛素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷和锦葵素‑3‑(反式‑对香豆酸酰氧基)‑芸香糖苷‑5‑葡萄糖苷为果皮中花青素主要成分，分别占果皮花青素总量的68.7％和14.2％。
