一种酶-金属核苷酸复合物及其可控构建方法与应用转让专利
申请号 : CN202010367283.9
文献号 : CN111569943B
文献日 : 2021-07-20
发明人 : 娄文勇 , 吴晓玲 , 刘姝利 , 宗敏华 , 熊隽
申请人 : 华南理工大学
摘要 :
本发明公开了一种酶‑金属核苷酸复合物及其可控构建方法与应用，属于催化剂领域。该方法包括：将核苷酸盐、金属盐及酶加入水中，得到混合液，搅拌反应，离心取沉淀，得到酶‑金属离子核苷酸复合物；将酶‑金属离子核苷酸复合物加入水中，分散均匀，得到分散液；将还原剂加入所述分散液中，搅拌反应，离心洗涤，取沉淀，冷冻干燥，得到所述酶‑金属核苷酸复合催化剂。本发明所提出的合成方法制备条件温和，操作简单，重现性好，在生物医药、化工制造、医学检测等领域具有重要应用潜力。
权利要求 :
1.一种酶‑金属核苷酸复合催化剂的可控构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将核苷酸盐、金属盐及酶加入水中，得到混合液，搅拌反应，离心取沉淀，得到酶‑金属离子核苷酸复合物；在所述混合液中，核苷酸盐与金属盐的摩尔浓度比为0.1‑5:1；所述金属盐为氯化铜、硫酸铜、醋酸钯、氯钯酸钠、硝酸银及四氯金酸中的一种以上；在所述混合液中，酶的浓度为0.01‑1mg/mL；所述酶为猪胰脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶A、南极假丝酵母脂肪酶B、褶皱假丝酵母脂肪酶、米黑根毛霉脂肪酶、梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、辣根过氧化物酶、有机磷水解酶中的一种以上；在所述混合液中，核苷酸盐的终摩尔浓度为5‑100mM；
所述核苷酸盐为5'‑单磷酸胞苷二钠、二磷酸胞苷、三磷酸胞苷、5'‑单磷酸腺苷二钠、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、5'‑单磷酸鸟苷二钠、二磷酸鸟苷及三磷酸鸟苷中的一种以上；所述搅拌反应的时间为0.5‑2h；
(2)将步骤(1)所述酶‑金属离子核苷酸复合物加入水中，分散均匀，得到分散液；将还原剂加入所述分散液中，搅拌反应，离心洗涤，取沉淀，冷冻干燥，得到所述酶‑金属核苷酸复合催化剂。
2.根据权利要求1所述的酶‑金属核苷酸复合催化剂的可控构建方法，其特征在于，步骤(2)所述还原剂与步骤(1)所述金属盐的摩尔比为1‑20:1；所述还原剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠和维生素C中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的酶‑金属核苷酸复合催化剂的可控构建方法，其特征在于，步骤(2)所述搅拌反应的时间为1‑30min。
4.根据权利要求1所述的酶‑金属核苷酸复合催化剂的可控构建方法，其特征在于，步骤(2)所述分散液中，金属离子的浓度为30‑50mM。
5.根据权利要求1所述的酶‑金属核苷酸复合催化剂的可控构建方法，其特征在于，步骤(2)所述冷冻干燥的时间为12‑20h。
6.一种由权利要求1‑5任一项所述的可控构建方法制得的酶‑金属核苷酸复合催化剂。
说明书 :
一种酶‑金属核苷酸复合物及其可控构建方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于催化剂制备领域，具体涉及一种酶‑金属核苷酸复合物及其可控构建方法与应用。
背景技术
[0002] 无机金属催化剂与生物催化剂相耦合所构建的多功能高效催化剂，在生物医药、化工制造、医学检测等领域具有巨大的应用前景。多功能催化剂可实现一锅法催化级联反
应，减少反应步骤，降低中间产物的分离纯化，有望提高催化效率，同时降低能耗，减少污
染，有利于发展绿色化工生产。同时，金属催化剂与生物催化剂子在纳米尺度下的耦合，有
望带来催化特性的协同，增强其功能，提高杂化催化剂的催化效率，拓展酶在生产应用中的
潜力和范围。
应，减少反应步骤，降低中间产物的分离纯化，有望提高催化效率，同时降低能耗，减少污
染，有利于发展绿色化工生产。同时，金属催化剂与生物催化剂子在纳米尺度下的耦合，有
望带来催化特性的协同，增强其功能，提高杂化催化剂的催化效率，拓展酶在生产应用中的
潜力和范围。
[0003] 已有的蛋白‑金属复合催化剂的构建方法主要分为两类。一类是先合成金属纳米颗粒，再将金属纳米颗粒和酶分子同时负载到一个惰性载体上，容易造成金属纳米颗粒的
团聚以及金属纳米颗粒与酶催化剂在物理空间上的分离，无法利用其纳米效应。近年来，利
用蛋白分子吸附金属离子，实现其还原，可获得具有高度分散的金属纳米颗粒。专利
CN106729713ASSSS在蛋白的碱性水溶液条件下实现对金属离子的还原，获得金属纳米颗
粒‑蛋白复合物，然而上述工作中，所使用的蛋白没有催化活性，而仅仅将蛋白作为载体。文
献（Nature Catalysis, DOI: 10.1038/s41929‑019‑0305‑8）对酶进行化学修饰，获得在有
机相中具有良好分散性的酶复合物，再将金属离子溶液加入到含醇和高分子‑酶复合物中，
实现了对金属纳米颗粒的尺寸调控。然而其所使用的醇类主要为甲醇或乙醇等容易造成酶
失活的极性有机溶剂，对不耐受有机溶剂的酶分子不适用。
团聚以及金属纳米颗粒与酶催化剂在物理空间上的分离，无法利用其纳米效应。近年来，利
用蛋白分子吸附金属离子，实现其还原，可获得具有高度分散的金属纳米颗粒。专利
CN106729713ASSSS在蛋白的碱性水溶液条件下实现对金属离子的还原，获得金属纳米颗
粒‑蛋白复合物，然而上述工作中，所使用的蛋白没有催化活性，而仅仅将蛋白作为载体。文
献（Nature Catalysis, DOI: 10.1038/s41929‑019‑0305‑8）对酶进行化学修饰，获得在有
机相中具有良好分散性的酶复合物，再将金属离子溶液加入到含醇和高分子‑酶复合物中，
实现了对金属纳米颗粒的尺寸调控。然而其所使用的醇类主要为甲醇或乙醇等容易造成酶
失活的极性有机溶剂，对不耐受有机溶剂的酶分子不适用。
发明内容
[0004] 为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种酶‑金属核苷酸复合物及其可控构建方法与应用。
[0005] 本发明的目的在于提供一种酶‑金属核苷酸复合催化剂及其可控制备的方法。
[0006] 该方法利用金属离子与核苷酸在水溶液中自组装形成的配位化合物作为酶和金属纳米颗粒的载体以及金属纳米颗粒的制备前体，使均匀分散在配位网络中的部分金属离
子原位还原，得到金属纳米颗粒均匀分散的酶‑金属核苷酸复合催化剂。该方法制备条件温
和简便，所构建的酶‑金属核苷酸复合催化剂在药物生产和医学检测治疗领域具有广阔的
应用前景。
子原位还原，得到金属纳米颗粒均匀分散的酶‑金属核苷酸复合催化剂。该方法制备条件温
和简便，所构建的酶‑金属核苷酸复合催化剂在药物生产和医学检测治疗领域具有广阔的
应用前景。
[0007] 本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
[0008] 本发明提供的酶‑金属核苷酸复合催化剂是一种以金属离子‑核苷酸配位化合物负载的酶‑金属纳米颗粒复合催化剂。所述金属离子‑核苷酸配位化合物中的蛋白含量为
0.1%‑5%。所述酶‑金属核苷酸复合催化剂中金属纳米颗粒的负载量为2%‑10%，所述金属纳
米颗粒在复合催化剂中分散性良好，粒径分布在2‑20 nm之间。
0.1%‑5%。所述酶‑金属核苷酸复合催化剂中金属纳米颗粒的负载量为2%‑10%，所述金属纳
米颗粒在复合催化剂中分散性良好，粒径分布在2‑20 nm之间。
[0009] 本发明提供的一种酶‑金属核苷酸复合催化剂的制备方法，包括如下步骤：
[0010] （1）酶‑金属离子核苷酸复合物的制备：将核苷酸盐、金属盐及酶加入水中，搅拌反应，离心取沉淀，得到酶‑金属离子核苷酸复合物；
[0011] （2）将步骤（1）所述酶‑金属离子核苷酸复合物加入水中，分散均匀，得到分散液；将还原剂加入所述分散液中，搅拌反应（还原反应），离心洗涤，取沉淀，冷冻干燥，得到所述
酶‑金属核苷酸复合催化剂。
酶‑金属核苷酸复合催化剂。
[0012] 进一步地，步骤（1）所述核苷酸盐与金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为0.1‑5:1；所述核苷酸盐为5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）、二磷酸胞苷、三磷酸胞苷、5'‑单磷酸腺苷二钠
（AMP）、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、5'‑单磷酸鸟苷二钠（GMP）、二磷酸鸟苷及三磷酸鸟苷中的
一种以上；所述金属盐为氯化铜、硫酸铜、醋酸钯、氯钯酸钠、硝酸银及四氯金酸中的一种以
上。
（AMP）、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、5'‑单磷酸鸟苷二钠（GMP）、二磷酸鸟苷及三磷酸鸟苷中的
一种以上；所述金属盐为氯化铜、硫酸铜、醋酸钯、氯钯酸钠、硝酸银及四氯金酸中的一种以
上。
[0013] 所述核苷酸为含有核苷基团和磷酸基团的核苷酸及其类似物。
[0014] 进一步地，步骤（1）所述核苷酸盐与金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为5‑0.1:1。
[0015] 优选地，在步骤（1）所述混合液中，核苷酸盐的终摩尔浓度为5‑100mM。
[0016] 优选地，步骤（1）所述核苷酸盐与金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为5:3‑1:3。
[0017] 进一步优选地，步骤（1）所述核苷酸盐与金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为5:3, 4:3, 3:3, 2:3, 1:3。
[0018] 进一步地，步骤（1）所述酶的终质量浓度（mg/mL）为0.01‑1 mg/mL；所述酶为猪胰脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶A、南极假丝酵母脂肪酶B、褶皱假丝酵母脂肪酶、米黑根毛霉
脂肪酶、梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、辣根过氧化物酶、有机磷水解酶中的一种以上。
脂肪酶、梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、辣根过氧化物酶、有机磷水解酶中的一种以上。
[0019] 优选地，步骤（1）所述酶的终质量浓度（mg/mL）为0.05‑0.4 mg/mL。
[0020] 进一步优选地，步骤（1）所述酶的终质量浓度（mg/mL）为0.05 mg/mL, 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL。
[0021] 进一步地，步骤（2）所述还原剂与步骤（1）所述金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为1‑20:1；所述还原剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠和维生素C中的一种以上。
[0022] 优选地，步骤（2）所述还原剂与步骤（1）所述金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为2‑10:1。
[0023] 进一步优选地，步骤（2）所述还原剂与步骤（1）所述金属盐的终摩尔浓度比（mM:mM）为2:1、4:1 、6:1、 8:1、 10:1。
[0024] 进一步地，步骤（1）所述搅拌反应的时间为0.5‑2h；搅拌反应的温度为20‑30℃。
[0025] 优选地，步骤（1）所述搅拌反应的时间为0.5h，步骤（1）所述搅拌反应的温度为25℃。
[0026] 步骤（1）所述酶‑金属离子核苷酸复合物（酶‑金属离子核苷酸配位化合物）中的蛋白含量为0.1%‑5%；优选为0.21% 1.68%。
~
~
[0027] 进一步优选地，步骤（1）所述酶‑金属离子核苷酸复合物（酶‑金属离子核苷酸配位化合物）中的蛋白含量为0.21%、0.42%、0.84%、1.26%或1.68%。
[0028] 优选地，在步骤（1）所述混合液中，核苷酸盐的终摩尔浓度为10‑50mM。
[0029] 进一步优选地，在步骤（1）所述混合液中，核苷酸盐的终摩尔浓度为10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM。
[0030] 进一步地，步骤（2）所述搅拌反应的时间为1‑30min，搅拌反应的温度为20‑30℃。
[0031] 优选地，步骤（2）所述搅拌反应的时间为1‑20min，步骤（2）所述搅拌反应的温度为25℃。
[0032] 进一步优选地，步骤（2）所述搅拌反应的时间为1min, 3min, 5min, 10min, 20min。
[0033] 进一步地，步骤（2）所述分散液中，金属离子的浓度为30‑50mM。
[0034] 优选地，步骤（2）所述分散液中，金属离子的浓度为43mM。
[0035] 进一步地，步骤（2）所述冷冻干燥的时间为12‑20h。
[0036] 优选地，步骤（2）所述冷冻干燥的时间为15h。
[0037] 本发明提供一种由上述的制备方法制得的酶‑金属核苷酸复合催化剂。
[0038] 本发明提供的制备方法包括金属离子与核苷酸及酶分子复合物的构建以及金属离子在复合物上的原位还原，实现对金属纳米颗粒的尺寸调控，获得具有良好分散性的酶‑
金属核苷酸复合催化剂。
金属核苷酸复合催化剂。
[0039] 所述酶‑金属核苷酸复合催化剂的金属纳米颗粒粒径分布为5‑15 nm，负载在金属离子核苷酸复合物上。
[0040] 本发明提供的酶‑金属核苷酸复合物能够应用在级联催化反应中。
[0041] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
[0042] （1）本发明提供的酶‑金属核苷酸复合催化剂可通过调控还原反应时间等调控金属颗粒的尺寸和其在复合物上的负载量。反应时间越长，金属尺寸越大，金属负载量越大，
反应时间为1‑30min，金属颗粒尺寸在5‑15nm，负载量在2%‑10%之间；
反应时间为1‑30min，金属颗粒尺寸在5‑15nm，负载量在2%‑10%之间；
[0043] （2）本发明提供的的酶‑金属核苷酸复合催化剂兼具酶的催化活性和金属纳米颗粒的催化活性，其中，酶的催化活性为相对于游离酶的1.7‑25%，金属纳米颗粒的催化活性
‑2 ‑1
为反应常数k为1‑8（10 s ）；
‑2 ‑1
为反应常数k为1‑8（10 s ）；
[0044] （3）本发明构建的的酶‑金属核苷酸复合物可用于催化化学‑酶级联反应，在药物生产和医学检测治疗领域具有良好的应用前景。
附图说明
[0045] 图1a为实施实例1制得的铜离子核苷酸复合物（Cu/CMP）的扫描电镜图；
[0046] 图1b为实施实例2制得的脂肪酶‑铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP）的扫描电镜图；
[0047] 图1c为实施实例2制得的脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）的扫描电镜图；
[0048] 图1d为实施实例2制得的脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）的透射电镜图；
[0049] 图2为实施实例2制得的脂肪酶‑铜核苷酸复合催化剂（PPL&Cu@MNC）的X‑射线衍射谱图；
[0050] 图3为购自阿拉丁试剂有限公司的5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）、实施例1制得的铜离子核苷酸复合物（Cu/CMP）、实施例2制得的脂肪酶‑铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP）和脂
肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）的红外光谱图；
肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）的红外光谱图；
[0051] 图4为实施实例3制得的脂肪酶‑铜核苷酸复合催化剂（PPL&Cu@MNC）的酶催化活性；
[0052] 图5为实施实例3制得的脂肪酶‑铜核苷酸复合催化剂（PPL&Cu@MNC）的金属催化活性；
[0053] 图6为实施实例4制得的脂肪酶‑铜核苷酸复合催化剂（PPL&Cu@MNC）的酶催化活性；
[0054] 图7为实施实例4制得的脂肪酶‑铜核苷酸复合催化剂（PPL&Cu@MNC）的金属催化活性；
[0055] 图8为实施实例5制得的脂肪酶‑铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP）的固定化效率和酶催化活性；
[0056] 图9为实施实例6制得的脂肪酶‑铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP、PPL@Cu/AMP、PPL@Cu/GMP）的固定化效率和酶催化活性；
[0057] 图10为实施实例7制得的脂肪酶‑铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP）的固定化效率和酶催化活性。
具体实施方式
[0058] 以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实
现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
[0059] 实施实例1
[0060] 一种金属核苷酸复合物的制备方法，具体包括如下步骤：
[0061] （1）称取5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）0.367 g，金属盐二水合氯化铜0.511 g；
[0062] （2）将上述配比的原料各自配置成水溶液，其中5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）溶液浓度为100 mM，二水合氯化铜溶液浓度为300 mM；
[0063] （3）将5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）溶液，去离子水，二水合氯化铜溶液以5:4:1（v/v/v）的比例混合搅拌反应0.5h，离心后所得到的铜离子核苷酸复合物命名为Cu/CMP，其扫描
电镜图如图1a所示，Cu / CMP表现为盘状聚集体。
电镜图如图1a所示，Cu / CMP表现为盘状聚集体。
[0064] 实施实例2
[0065] 一种酶‑金属核苷酸复合催化剂的制备方法，具体包括如下步骤：
[0066] （1）称取5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）0.367 g，猪胰脂肪酶0.01 g，金属盐二水合氯化铜0.511 g，还原剂硼氢化钠0.151 g；
[0067] （2）将上述配比的原料各自配置成水溶液，其中5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）溶液浓度为100 mM，猪胰脂肪酶液质量浓度为1 mg/mL，二水合氯化铜溶液浓度为300 mM，还原剂
硼氢化钠溶液浓度为400mM；
硼氢化钠溶液浓度为400mM；
[0068] （3）将上述前3种溶液以5:4:1（v/v/v）的比例混合搅拌反应0.5h，离心后获得酶‑金属离子核苷酸复合物，并将其重新分散在水中，得到分散液，分散液中的金属离子摩尔浓
度为43mM。所得到的酶‑铜离子核苷酸复合物命名为PPL@Cu/CMP，扫描电镜图如图1b所示，
从图1b中可看出将PPL封装到Cu / CMP中不会改变支撑材料的形态；
度为43mM。所得到的酶‑铜离子核苷酸复合物命名为PPL@Cu/CMP，扫描电镜图如图1b所示，
从图1b中可看出将PPL封装到Cu / CMP中不会改变支撑材料的形态；
[0069] （4）向上述分散液中加入还原剂溶液（硼氢化钠溶液），分散液与还原剂溶液比例（v/v）为7:3，使溶液中终浓度[NaBH4]/[Cu] (mM/mM)=4，搅拌反应1min，离心洗涤，取沉淀，
冷冻干燥，得到猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合催化剂（即所述酶‑金属核苷酸复合催化剂），命
名为PPL&Cu@MNC。
冷冻干燥，得到猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合催化剂（即所述酶‑金属核苷酸复合催化剂），命
名为PPL&Cu@MNC。
[0070] 扫描电镜图如图1c所示，从图1c中可看出硼氢化钠还原铜离子导致其与CMP部分分离，因此，PPL＆Cu @ MNC分解成较小的颗粒聚集体。PPL&Cu@MNC的透射电镜图如图1d所
示，其中观察到原位还原后分散分布的铜纳米颗粒，平均直径约为10 nm。
示，其中观察到原位还原后分散分布的铜纳米颗粒，平均直径约为10 nm。
[0071] PPL&Cu@MNC的X‑射线衍射谱图如图2所示，进一步证明了铜纳米颗粒的成功制备，分别在43.3°，50.4°和74.1°处的衍射峰分别对应于铜的（111），（200）和（220）晶格面，与铜
的晶体结构非常吻合（JCPDS04‑0836）。
的晶体结构非常吻合（JCPDS04‑0836）。
[0072] 铜离子与CMP之间的配位关系通过傅里叶变换红外光谱（FT‑IR）进行了研究，图3是5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）、铜离子核苷酸复合物（Cu/CMP）、酶‑铜离子核苷酸复合物
（PPL@Cu/CMP）和脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）的红外光谱图。如图3所示，与Cu/
‑1 ‑1
CMP相比，CMP中1645 cm 处的归因于C = O键的谱带和1492 cm 处的归因于C = N键的谱
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
带分别移至1652 cm 和1513 cm 处，而位于1082 cm 处的磷酸基团的峰移至1071 cm 处，
‑1
表明CMP中的磷酸根和胞苷都参与了铜离子与CMP之间的配位。脂肪酶包封后，在1652 cm
‑1 ‑1 ‑1
和1071 cm 处的条带进一步移动到1653 cm 和1063 cm ，这可能是由于PPL和Cu / CMP之
‑1 ‑1 ‑1
间的相互作用所致。铜离子还原后，在1653 cm 、1513 cm 和1063 cm 处的谱带移至1655
‑1 ‑1 ‑1
cm 、1535 cm 和1086 cm ，表明Cu纳米颗粒，PPL和Cu / CMP之间的相互作用。
（PPL@Cu/CMP）和脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）的红外光谱图。如图3所示，与Cu/
‑1 ‑1
CMP相比，CMP中1645 cm 处的归因于C = O键的谱带和1492 cm 处的归因于C = N键的谱
‑1 ‑1 ‑1 ‑1
带分别移至1652 cm 和1513 cm 处，而位于1082 cm 处的磷酸基团的峰移至1071 cm 处，
‑1
表明CMP中的磷酸根和胞苷都参与了铜离子与CMP之间的配位。脂肪酶包封后，在1652 cm
‑1 ‑1 ‑1
和1071 cm 处的条带进一步移动到1653 cm 和1063 cm ，这可能是由于PPL和Cu / CMP之
‑1 ‑1 ‑1
间的相互作用所致。铜离子还原后，在1653 cm 、1513 cm 和1063 cm 处的谱带移至1655
‑1 ‑1 ‑1
cm 、1535 cm 和1086 cm ，表明Cu纳米颗粒，PPL和Cu / CMP之间的相互作用。
[0073] 实施实例3
[0074] 一种酶‑金属核苷酸复合催化剂的制备方法，具体步骤为：
[0075] （1）称取5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）0.367 g，猪胰脂肪酶0.01 g，金属盐二水合氯化铜0.511 g，还原剂硼氢化钠0.151g；
[0076] （2）将上述配比的原料各自配置成水溶液，其中5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）溶液浓度为100 mM，猪胰脂肪酶液质量浓度为1 mg/mL，二水合氯化铜溶液浓度为300 mM，还原剂
硼氢化钠溶液浓度为400mM；
硼氢化钠溶液浓度为400mM；
[0077] （3）将上述前3种溶液以5:4:1（v/v/v）的比例混合搅拌反应0.5h，离心后获得酶‑金属离子核苷酸复合物，并将其重新分散在水中，得到分散液,分散液中的金属摩尔浓度为
43mM，得到的酶‑铜离子核苷酸复合物；
43mM，得到的酶‑铜离子核苷酸复合物；
[0078] （4）向上述分散液中加入还原剂溶液（硼氢化钠溶液），分散液与还原剂溶液比例（v/v）为7:3，使溶液中终浓度[NaBH4]/[Cu] (mM/mM)=4，搅拌反应时间分别为1min, 3min,
5min, 10min, 20min, 离心洗涤，取沉淀，冷冻干燥，得到一系列猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复
合催化剂PPL&Cu@MNC（即所述酶‑金属核苷酸复合催化剂），其酶催化活性和铜催化活性分
别如图4，图5所示。
5min, 10min, 20min, 离心洗涤，取沉淀，冷冻干燥，得到一系列猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复
合催化剂PPL&Cu@MNC（即所述酶‑金属核苷酸复合催化剂），其酶催化活性和铜催化活性分
别如图4，图5所示。
[0079] 酶‑金属核苷酸复合催化剂中酶的活性和金属催化性能的测定具体步骤为：
[0080] a.将制备得到的猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）用去离子水分散，得到待测液，待测液中的金属摩尔浓度为30mM，重悬均匀后待测；
[0081] b.脂肪酶活力的测定：脂肪酶催化反应的速度通过分光光度法检测单位时间内对硝基苯酚的生成量来计算。活力测定过程为：取900μL浓度为2mM的对硝基苯丁酸酯溶液，加
入100μL待测液或相同浓度的游离酶液，混合均匀，反应5min，10000rpm离心1min，测定400
nm处吸光值，以游离酶液的活力为对照得出待测液的相对活力；
入100μL待测液或相同浓度的游离酶液，混合均匀，反应5min，10000rpm离心1min，测定400
nm处吸光值，以游离酶液的活力为对照得出待测液的相对活力；
[0082] c.铜催化性能的测定：铜纳米粒子具有在NaBH4辅助下加氢还原对硝基苯酚（p‑NP）到对氨基苯酚（p‑AP）的活性。反应底物和产物分别在400 nm和300 nm处有最大吸收，计
算反应t min后相对于初始吸光度的In(At/A0)值，做出t‑ In（At/A0）图后对其进行线性拟
合，得到反应常数k，用于表示比较其催化性能。
算反应t min后相对于初始吸光度的In(At/A0)值，做出t‑ In（At/A0）图后对其进行线性拟
合，得到反应常数k，用于表示比较其催化性能。
[0083] 从图4可以看出，以游离脂肪酶活性为100%，猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）的酶活性为游离酶的13‑25%；从图5可以看出，猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&
‑2
Cu@MNC）中的铜组分可以还原对硝基苯酚为对氨基苯酚，反应常数k为1.69‑7.14（10 s
‑1
）；说明猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）既具有酶活性又具有金属组分铜的催
化活性，可催化硝基苯丁酸酯（p‑NPB）到对氨基苯酚（p‑AP）的级联反应。
‑2
Cu@MNC）中的铜组分可以还原对硝基苯酚为对氨基苯酚，反应常数k为1.69‑7.14（10 s
‑1
）；说明猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）既具有酶活性又具有金属组分铜的催
化活性，可催化硝基苯丁酸酯（p‑NPB）到对氨基苯酚（p‑AP）的级联反应。
[0084] 实施实例4
[0085] 一种酶‑金属核苷酸复合催化剂的制备方法，具体步骤为：
[0086] (1)称取5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）0.367 g，猪胰脂肪酶0.01 g，金属盐二水合氯化铜0.511 g，还原剂硼氢化钠0.378g；
[0087] (2)将上述配比的原料各自配置成水溶液，其中5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）溶液浓度为100 mM，猪胰脂肪酶液质量浓度为1 mg/mL，二水合氯化铜溶液浓度为300 mM，还原剂
硼氢化钠溶液浓度分别为200mM, 400mM, 600mM, 800mM, 1M；
硼氢化钠溶液浓度分别为200mM, 400mM, 600mM, 800mM, 1M；
[0088] (3)将上述前3种溶液以5:4:1（v/v/v）的比例混合搅拌反应0.5h，离心后获得酶‑金属离子核苷酸复合物，并将其重新分散在水中，得到分散液，分散液中的金属摩尔浓度为
43mM，得到的酶‑铜离子核苷酸复合物；
43mM，得到的酶‑铜离子核苷酸复合物；
[0089] (4)向上述分散液中分别加入不同摩尔浓度的还原剂溶液（硼氢化钠溶液），分散液与还原剂溶液比例（v/v）均为7:3，使溶液中终浓度[NaBH4]/[Cu] (mM/mM)=2,4,6,8,10,
搅拌反应5min，离心洗涤，取沉淀，冷冻干燥，得到一系列猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合催化剂
PPL&Cu@MNC（即所述酶‑金属核苷酸复合催化剂），其酶催化活性和铜催化活性分别如图6，
图7所示。酶‑金属核苷酸复合催化剂中酶的活性和金属催化性能的测定具体步骤同实施实
例3。
搅拌反应5min，离心洗涤，取沉淀，冷冻干燥，得到一系列猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合催化剂
PPL&Cu@MNC（即所述酶‑金属核苷酸复合催化剂），其酶催化活性和铜催化活性分别如图6，
图7所示。酶‑金属核苷酸复合催化剂中酶的活性和金属催化性能的测定具体步骤同实施实
例3。
[0090] 从图6可以看出，以游离脂肪酶活性为100%，猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）的酶活性为游离酶的1.7‑23%；从图7可以看出，猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&
‑2
Cu@MNC）中的铜组分可以还原对硝基苯酚为对氨基苯酚,反应常数k为1.01‑4.92（10 s
‑1
）；说明猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）既具有酶活性又具有金属组分铜的催
化活性，可催化硝基苯丁酸酯（p‑NPB）到对氨基苯酚（p‑AP）的级联反应。
‑2
Cu@MNC）中的铜组分可以还原对硝基苯酚为对氨基苯酚,反应常数k为1.01‑4.92（10 s
‑1
）；说明猪胰脂肪酶‑铜核苷酸复合物（PPL&Cu@MNC）既具有酶活性又具有金属组分铜的催
化活性，可催化硝基苯丁酸酯（p‑NPB）到对氨基苯酚（p‑AP）的级联反应。
[0091] 实施实例5
[0092] 一种酶‑金属核苷酸复合催化剂的制备方法，具体步骤为：
[0093] (1)称取5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）0.367 g，猪胰脂肪酶0.01 g，金属盐二水合氯化铜0.511 g；
[0094] (2)将上述配比的原料各自配置成水溶液，其中5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）溶液浓度为100 mM，猪胰脂肪酶液质量浓度分别为0.125mg/mL, 0.25mg/mL, 0.5mg/mL, 0.75mg/
mL, 1 mg/mL, 二水合氯化铜溶液浓度为300 mM；
mL, 1 mg/mL, 二水合氯化铜溶液浓度为300 mM；
[0095] (3)将上述前3种溶液以5:4:1（v/v/v）的比例混合,使混合液中酶的终浓度分别为0.05mg/mL, 0.1mg/mL, 0.2mg/mL, 0.3mg/mL, 0.4 mg/mL, 搅拌反应0.5h, 离心后得到
一系列酶‑金属离子核苷酸复合物PPL@Cu/CMP，其固定化效率和酶催化活性如图8所示。
一系列酶‑金属离子核苷酸复合物PPL@Cu/CMP，其固定化效率和酶催化活性如图8所示。
[0096] 酶‑金属离子核苷酸复合催化剂中酶的固定化效率和酶催化活性的测定具体步骤为：
[0097] a. 将制备得到的猪胰脂肪酶‑铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP）用去离子水分散，得到待测液，待测液中的金属摩尔浓度为30mM，重悬均匀后待测；
[0098] b. 脂肪酶活力的测定：脂肪酶催化反应的速度通过分光光度法检测单位时间内对硝基苯酚的生成量来计算。活力测定过程为：取900μL浓度为2mM的对硝基苯丁酸酯溶液，
加入100μL待测液或相同浓度的游离酶液，混合均匀，反应5min，10000rpm离心1min，测定
400 nm处吸光值，以游离酶液的活力为对照得出待测液的相对活力；
加入100μL待测液或相同浓度的游离酶液，混合均匀，反应5min，10000rpm离心1min，测定
400 nm处吸光值，以游离酶液的活力为对照得出待测液的相对活力；
[0099] c. 酶的固定化效率的测定：通过考马斯亮蓝法测定蛋白负载量。测定过程为：取步骤（3）中离心后得到的上清液400μL，加入到2 mL考马斯亮蓝试剂中，混合均匀，反应
5min，测定595nm处吸光值，得到上清液中蛋白含量，算出固定的酶浓度进而得到固定化效
率。从图8可以看出，猪胰脂肪酶‑铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP）的固定化效率较高，为
80‑100%；以游离脂肪酶活性为100%，酶活性为游离酶的84‑131%，当用于固定的酶浓度为
0.4mg/mL时，相对活力最高，超过130％。
5min，测定595nm处吸光值，得到上清液中蛋白含量，算出固定的酶浓度进而得到固定化效
率。从图8可以看出，猪胰脂肪酶‑铜离子核苷酸复合物（PPL@Cu/CMP）的固定化效率较高，为
80‑100%；以游离脂肪酶活性为100%，酶活性为游离酶的84‑131%，当用于固定的酶浓度为
0.4mg/mL时，相对活力最高，超过130％。
[0100] 在这项工作中，金属核苷酸框架可能为包裹在其中的酶提供了疏水环境，并导致脂肪酶两亲性α‑螺旋盖子打开，活性位点周围的疏水残基暴露于反应介质中，这促进了酶
与其底物之间的相互作用，从而增强了催化活性。
与其底物之间的相互作用，从而增强了催化活性。
[0101] 实施实例6
[0102] 一种酶‑金属核苷酸复合催化剂的制备方法，具体步骤为：
[0103] （1）称取5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）0.367 g，5'‑单磷酸腺苷二钠（AMP）0.391 g，5'‑单磷酸鸟苷二钠（GMP）0.407 g，猪胰脂肪酶0.01 g，金属盐二水合氯化铜0.511 g；
[0104] （2）将上述配比的原料各自配置成水溶液，其中核苷酸（CMP, AMP, GMP）溶液浓度为100 mM，猪胰脂肪酶液质量浓度为1 mg/mL，二水合氯化铜溶液浓度为300 mM；
[0105] （3）将上述前3种溶液以5:4:1（v/v/v）的比例混合搅拌反应0.5h，离心后得到一系列酶‑金属离子核苷酸复合物PPL@Cu/CMP, PPL@Cu/AMP和PPL@Cu/GMP，其固定化效率和酶
催化活性如图9所示。酶‑金属离子核苷酸复合催化剂中酶的固定化效率和酶催化活性的测
定具体步骤同实施实例5。
催化活性如图9所示。酶‑金属离子核苷酸复合催化剂中酶的固定化效率和酶催化活性的测
定具体步骤同实施实例5。
[0106] 从图9可以看出，使用不同核苷酸制备的猪胰脂肪酶‑铜离子核苷酸复合物的固定化效率为43‑100%；以游离脂肪酶活性为100%，酶活性为游离酶的115‑155%。核苷酸的类型
决定了脂肪酶的包封环境，因此表现出不同的活化作用，与PPL @ Cu / AMP和PPL @ Cu /
GMP相比，PPL @ Cu / CMP表现出最高的固定化效率和相对活性。
决定了脂肪酶的包封环境，因此表现出不同的活化作用，与PPL @ Cu / AMP和PPL @ Cu /
GMP相比，PPL @ Cu / CMP表现出最高的固定化效率和相对活性。
[0107] 实施实例7
[0108] 一种酶‑金属核苷酸复合催化剂的制备方法，具体步骤为：
[0109] (1)称取5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）0.367 g，猪胰脂肪酶0.01 g，金属盐二水合氯化铜0.511 g，还原剂硼氢化钠0.151 g；
[0110] (2)将上述配比的原料各自配置成水溶液，其中5'‑单磷酸胞苷二钠（CMP）溶液浓度分别为100 mM, 80mM, 60mM, 40mM, 20mM, 猪胰脂肪酶液质量浓度为1 mg/mL，二水合
氯化铜溶液浓度为300 mM，还原剂硼氢化钠溶液浓度为400mM；
氯化铜溶液浓度为300 mM，还原剂硼氢化钠溶液浓度为400mM；
[0111] (3)将上述前3种溶液以5:4:1（v/v/v）的比例混合,使溶液中终浓度[CMP]/[CuCl2] (mM/mM)=5:3, 4:3, 3:3, 2:3, 1:3, 搅拌反应0.5h, 离心后得到一系列酶‑金
属离子核苷酸复合物PPL@Cu/CMP，其固定化效率和酶催化活性如图10所示。酶‑金属离子核
苷酸复合催化剂中酶的固定化效率和酶催化活性的测定具体步骤同实施实例5。
属离子核苷酸复合物PPL@Cu/CMP，其固定化效率和酶催化活性如图10所示。酶‑金属离子核
苷酸复合催化剂中酶的固定化效率和酶催化活性的测定具体步骤同实施实例5。
[0112] 从图10可以看出，制备的核苷酸与铜离子的摩尔比为5:3至1:3的一系列猪胰脂肪酶‑铜离子核苷酸复合物PPL@Cu/CMP的固定化效率均接近100%；以游离脂肪酶活性为100%，
2+
酶活性为游离酶的110‑153%。通过固定Cu 的浓度来改变比例，随着CMP浓度的增加，沉淀量
逐渐增加，当比例为5:3时，PPL @ Cu / CMP表现出最高的固定化效率和相对活性。当更多
的有机配体与金属离子配位时，固定化效率的提高可能归因于致密的骨架，并且，这种致密
的骨架导致脂肪酶中的盖子更开放，因此被包囊的脂肪酶表现出最高的催化活性。
2+
酶活性为游离酶的110‑153%。通过固定Cu 的浓度来改变比例，随着CMP浓度的增加，沉淀量
逐渐增加，当比例为5:3时，PPL @ Cu / CMP表现出最高的固定化效率和相对活性。当更多
的有机配体与金属离子配位时，固定化效率的提高可能归因于致密的骨架，并且，这种致密
的骨架导致脂肪酶中的盖子更开放，因此被包囊的脂肪酶表现出最高的催化活性。
[0113] 以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保
护范围。
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