一种用荧光法快速检测水痘病毒滴度的方法

摘要

本发明提供了一种检测水痘‑带状疱疹病毒(VZV)病毒滴度的抗体及相关检测方法，包括将二倍体细胞接种于96孔板中进行培养，然后感染接种未知病毒滴度的样品，经过培养后，通过加入所述特异性结合VZV病毒的抗体、FITC标记的二抗，进行荧光染色，镜下观察被感染后的病变数，得出该样品病毒滴度的方法。本发明所提供的方法，特异性强、敏感、快速、易观察，能够取得与传统蚀斑法相同的检测准确度，并能显著缩短检测时间。

权利要求

1.一种检测水痘‑带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将二倍体细胞接种于96孔板中，并置于二氧化碳孵箱培养；

(2)将备检病毒样品经稀释后接种至上述96孔板，补加维持液后继续置于二氧化碳孵箱培养；

(3)将步骤(2)中经培养后96孔板取出，弃去培养液后，经固定液固定后，加入一抗孵育，所述一抗为特异性VZV单抗；

(4)步骤(3)中经一抗孵育的96孔板经洗涤后，加入荧光标记的二抗继续孵育，所述二抗为抗种属抗体；

(5)步骤(4)中经二抗孵育的96孔板经洗涤后，用荧光定量检测仪进行检测，计算样品的病毒滴度；

其中，所述特异性VZV单抗为人IgG型单抗，所述单抗轻链可变区序列如SEQ ID No：3所示，所述单抗重链可变区序列如SEQ ID No：4所示。

2.根据权利要求1所述的检测水痘‑带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法，其特征在于，所述的二倍体细胞为对水痘‑带状疱疹病毒敏感的二倍体细胞，为人胚肺二倍体细胞2BS细胞株、MRC‑5细胞株或KMB‑17细胞株；

所述二抗为经荧光素标记的抗种属抗体，包括抗人的抗种属抗体。

3.根据权利要求1‑2任一项所述的检测水痘‑带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法，其特

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征在于，所述步骤(1)中的细胞接种数为2×10‑5×10/ml，培养条件为35‑40℃、二氧化碳浓度为4‑6％，培养时间为20‑48小时；步骤(2)中培养条件为35‑40℃、4‑6％二氧化碳浓度，培养60‑84小时。

4.根据权利要求3所述的检测水痘‑带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法，其特征在于，

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所述步骤(1)中的细胞接种数为2×10 ‑4×10/ml，培养条件为37℃、二氧化碳浓度为5％，培养时间为24小时；

所述步骤(2)中培养条件为37℃、5％二氧化碳浓度，培养72小时。

5.根据权利要求4所述的检测水痘‑带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述稀释为经稀释液稀释，稀释后每孔接种50μl，每个稀释度接种4‑8孔；所述稀释液为：PBS+50％蔗糖+10％谷氨酸钠+10％胎牛血清，或者MEM+2％新生牛血清+1％谷氨酰胺+2％NaHCO3。

6.根据权利要求5所述的检测水痘‑带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法，其特征在于，每50μl含有病毒数量为2‑50PFU。

7.根据权利要求1所述的检测水痘‑带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的维持液的配方为：MEM+5％新生牛血清+1％谷氨酰胺，每孔补加150微升维持液；

所述步骤(3)中的固定液为90％乙醇+10％甲醛；所述固定为每孔加入100‑300微升固定液，室温放置10‑30分钟。

8.根据权利要求7所述的检测水痘‑带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法，其特征在于，所述固定液为90％乙醇+10％甲醛；所述固定为每孔加入固定液100微升，室温放置15分钟。

9.根据权利要求1所述的检测水痘‑带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法，其特征在于，所述步骤(3)和(4)中的孵育条件为：37℃或者室温，孵育0.5‑2小时；或者2‑8℃，孵育18‑24小时；

所述步骤(4)和(5)中的洗涤使用的洗液为PBST洗涤液，其配方为：PBS+0.5‰‑2‰Tween20，洗涤次数为2‑5次。

说明书

一种用荧光法快速检测水痘病毒滴度的方法

技术领域：

[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及水痘带状疱疹病毒滴度检测，以及一种用荧光免疫方法建立的、高通量、快速检测水痘‑带状疱疹病毒滴度的方法。
背景技术：

[0002] 水痘‑带状疱疹病毒(varicella‑zoster virus，VZV)，属于人疱疹病毒属，人类疱疹病毒3型。最早由日本学者高桥(Taka‑hashiM)于1971年从水痘患儿的皮肤疱疹液中分离
得到。后续研究表明，VZV属疱疹病毒α亚科，为双链DNA病毒，由124.9kb组成，直径为150～
200nm，含71个基因组，编码67种蛋白，但病毒本身只有一个血清型，具有嗜神经性。VZV没有
动物储存宿主，人是唯一自然宿主。皮肤是病毒的主要靶器官。人类初次感染VZV会引发水
痘，随后VZV会潜伏在神经节中，当机体免疫力下降时，再次激活引起带状疱疹。

[0003] VZV感染表现两种不同的临床症状。初次感染一般发生于儿童，表现为水痘，其后病毒进入背根神经节并潜伏，在免疫力衰退或免疫抑制等情况下，病毒可能会将被重新激
活，表现为带状疱疹(Zerboni,L.等人,2014.NatRev Microbiol12(3):197‑210)。带状疱疹
常伴随疱疹后神经痛，疱疹后神经痛疼痛剧烈，可持续数年之久，极大影响患者生活质量。
带状疱疹及疱疹后神经痛的发生概率随年龄增大而增大，这给老龄化社会造成了较大的社
会负担。

[0004] 当前对于水痘带状疱疹病毒感染最主要的预防措施为注射疫苗。当前市场上有水痘减毒活疫苗来预防水痘，重组亚单位带状疱疹疫苗和带状疱疹减毒活疫苗来预防带状疱
疹(Brisson,M.etal,2003.J Med Virol 70suppl 1:S31‑37；Oxman,N.etal,2005.N Med 
352(22):2271‑2284)对于已经发病的个体，当前并没有有效的、特异的治疗手段，而只是通
过抗病毒药物来进行治疗。虽然疫苗和系统性抗病毒剂都已带来重大改进，但是该疾病仍
持续存在。更有效地检测和阻断VZV在种群中感染和繁殖的新抗体和抗体片段的鉴定以及
生产，对于建立这种感染性疾病的治疗和/或预防的改进治疗是特别重要的。

[0005] 对于疫苗企业来说，水痘减毒活疫苗的疫苗滴度的检测是非常重要的。蚀斑法是目前我国使用的对水痘病毒滴度测定的常规方法，其简要过程如下：首先在6孔板内接种细
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胞，一般为2x10‑4x10 /ml，每孔接种3ml；37℃、5％CO2条件下培养3天；接种病毒；37℃、5％
CO2条件下培养7天；最后用考马斯亮蓝染色，人工计数每孔蚀斑数量。

[0006] 蚀斑法滴度检测方法滴定复孔数是2个，存在复孔数不足带来的方法上的不准确性；蚀斑法整个流程检测时间为10天，不能短时间得到实验结果；蚀斑法需要实验人员用肉
眼计数斑点，人为误差难于控制。因此，目前急需一种能够快速准确的检测水痘‑带状疱疹
病毒滴度的方法。

[0007] 本发明人将荧光免疫方法的灵敏性、特异性应用于病毒滴度检测上，开发了一种用于水痘带状疱疹病毒滴度检测的方法。荧光法是利用抗原抗体结合的特异性和荧光法的
高灵敏性相结合的方法应用于病毒滴度检测领域。首先该方法在实验中可以设置4‑8个复
孔，显著提高滴度检测的准确性；其次该方法整个实验流程耗时为5天，相比于蚀斑法全程
需要10天，实验时间减少一半；再次该方法可以在荧光酶联免疫斑点分析仪上自动读板计
数，实现了自动化，减少了人工成本，降低了劳动强度和实验的人为误差；再有该方法的自
动化读板和计数符合GMP数据完整性的要求。该方法具有快速、特异、准确、通量高，可以自
动化计数等优点，可望成为水痘带状疱疹病毒滴度检测的备选(替代)方法。两种方法的比
较见下表。

[0008] 蚀斑法与荧光法的比较

[0009]

[0010] 本发明人在进行VZV病毒相关抗体研究过程中，对已有针对VZV包膜蛋白gE的抗体进行突变，得到一种突变的抗体，并意外发现该突变抗体尤其适合用于VZV病毒滴度的检
测，尤其用于荧光法检测时，能够取得与传统蚀斑法相当的准确度，但其检测时间却显著缩短。

[0011] 因此，本申请提供一种检测水痘‑带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法；所述方法检测迅速、准确，便于产业化应用。

发明内容

[0012] 本发明提供了一种水痘‑带状疱疹病毒检测的新方法，利用抗原抗体特异性结合的特点，结合荧光信号检测的高灵敏度的优势，本发明方法检测更快捷、准确。而且能够使
用仪器读板，减少人为判定误差。

[0013] 具体的，本发明涉及一种检测水痘‑带状疱疹病毒滴度的荧光检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

[0014] (1)将二倍体细胞接种于96孔板中，并置于二氧化碳孵箱培养；

[0015] (2)将备检病毒样品经稀释后接种至上述96孔板，补加维持液后继续置于二氧化碳孵箱培养；

[0016] (3)将步骤(2)中经培养后96孔板取出，弃去培养液后，经固定液固定后，加入一抗孵育，所述一抗为特异性VZV单抗；

[0017] (4)步骤(3)中经一抗孵育的96孔板经洗涤后，加入荧光标记的二抗继续孵育，所述二抗为抗种属抗体；

[0018] (5)步骤(4)中经二抗孵育的96孔板经洗涤后，用荧光定量检测仪进行检测，计算样品的病毒滴度。

[0019] 本发明所述二倍体细胞为任选的对水痘‑带状疱疹病毒敏感的二倍体细胞，优选为人胚肺二倍体细胞2BS细胞株、或MRC‑5细胞株、或KMB‑17细胞株；更有选为人胚肺二倍体
细胞2BS细胞株。

[0020] 本发明所述检测的病毒为水痘‑带状疱疹病毒，包括减毒水痘带状疱疹病毒和未减毒的水痘带状疱疹病毒。

[0021] 本发明所述的特异性VZV抗体为针对VZV及其糖蛋白E(VZV‑gE)、糖蛋白B(VZV‑gB)、糖蛋白H(VZV‑gH)的多克隆抗体和单克隆抗体。

[0022] 本发明所述的二抗为经荧光素标记的抗种属抗体，包括抗鼠(mouse)、抗鼠(rats)、抗兔和抗人的抗种属抗体。

[0023] 本发明所述的步骤(1)中的细胞接种数为2×105‑5×105/ml，培养条件为35‑40℃、二氧化碳浓度为4‑6％，培养时间为20‑48小时。

[0024] 本发明所述步骤(2)中培养条件为35‑40℃、二氧化碳浓度为4‑6％，培养时间为48‑96小时。

[0025] 进一步的，优化条件为，步骤(1)细胞接种数为2×105‑4×105/ml，培养条件为37℃、二氧化碳浓度为5％，培养时间为24小时；

[0026] 进一步的，优化条件为，步骤(2)中培养条件为37℃、二氧化碳浓度为5％，培养时间为72小时。

[0027] 本发明所述步骤(2)中所述稀释为经稀释液稀释，稀释后每孔接种50微升，每个稀释度接种4‑8孔；所述稀释液为：PBS+50％蔗糖+10％谷氨酸钠+10％胎牛血清，或者MEM+2％
新生牛血清+1％谷氨酰胺+2％NaHCO3。

[0028] 本发明所述步骤(2)中所述稀释为经稀释液稀释，稀释每50微升含有病毒数量为2‑50PFU。

[0029] 进一步的，优化条件为，所述步骤(2)中，每50μl含有病毒数量为5‑30PFU。

[0030] 本发明所述步骤(2)中的维持液的配方为：MEM+5％新生牛血清+1％谷氨酰胺，每孔补加150微升维持液。

[0031] 本发明所述步骤(3)中的固定液为90％乙醇+10％甲醛；所述固定为每孔100‑300微升固定液，室温放置10‑30分钟。

[0032] 进一步的，优化条件为，所述步骤(3)中的固定液为90％乙醇+10％甲醛；所述固定过程优化为，每孔加入固定液100微升，固定条件为室温放置15分钟。

[0033] 本发明所述步骤(3)中的一抗孵育条件为：37℃或者25℃或者室温，孵育0.5‑2小时；或者2‑8℃，孵育18‑24小时。

[0034] 进一步的，优化条件为孵育温度为37℃，孵育时间为1h。

[0035] 本发明所述步骤(4)中的二抗孵育条件为：37℃或者25℃或者室温，孵育0.5‑2小时或者2‑8℃，孵育18‑24小时。

[0036] 进一步的，优化条件为孵育温度为37℃，孵育时间为0.5h。

[0037] 本发明所述步骤(3)和(4)中的洗涤过程使用的洗液为PBST洗涤液，其配方为：PBS+0.5‰‑2‰Twwen20；洗涤次数为2‑5次。

[0038] 进一步的，优化条件为洗涤液为PBS+1‰Twwen20，洗涤次数为3次。

[0039] 本申请发明人在研究中发现，虽然荧光法在多方面优于蚀斑法，但仍存在检测结果不稳定等现象，研究发现存在因现有特异性VZV抗体与抗原结合能力不稳定等因素导致，
推测所述抗体在培养的单层细胞中与抗原VZV的结合受到细胞环境影响，导致其结合不稳
定，并导致检测结果出现不稳定。对此，本申请发明人通过随机突变方式得到本发明的突变
型抗VZV抗体，所述突变型抗VZV抗体相比与野生型，获得了改进的抗原结合特性，在实验中
表明，能够与VZV稳定结合，用于本申请的检测方法，能够取得与传统蚀斑法相当的检测准
确度，但能够显著缩减检测时间，取得了令人惊讶的技术效果。本申请发明人在研究中选择
以申请号CN201510884880.8中公开的抗VZV抗体为原型(定义为野生型抗体)，进行突变筛
选，得到所述抗体为人IgG型抗体，其恒定区为人IgG恒定区。所述抗体的轻链可变区序列如
SEQ ID No：3所示，所述抗体重链可变区序列如SEQ ID No：4所示。

[0040] 本发明方法与现有的病毒滴度检测方法相比，主要具有以下几方面的优点：

[0041] (1)检测速度快，相比于传统蚀斑法检测需要10天，用该方法检测只需要5天。

[0042] (2)检测通量大，可以机器读板，自动化程度高，显著减少人为判定的劳作强度；

[0043] (3)操作简便、快速，检测准确度高，能够取得与传统蚀斑法相当的检测准确度。

[0044] (4)特异性强。

附图说明

[0045] 图1：本发明荧光检测方法96孔板单孔检测图；

[0046] 图2：本发明荧光检测方法中使用荧光检测仪检测96孔板检测图。

具体实施方式

[0047] 以下实施方式进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤和条件所作的修改或替换，均属于本
发明的范围。

[0048] 用荧光法检测水痘‑带状疱疹病毒滴度，最关键的技术在于病毒稀释倍数的选择及荧光染色，选择合适的病毒稀释范围，及正确的荧光染色方法，才能得到准确的病毒滴度。

[0049] 1.试验材料

[0050] (1)细胞基质：二倍体细胞，如MRC‑5细胞、2BS细胞、KMB‑17细胞等；

[0051] (2)细胞培养液：MEM+10％新生牛血清+1％谷氨酰胺+2％NaHCO3；

[0052] (3)病毒稀释液：MEM+2％新生牛血清+1％谷氨酰胺+2％NaHCO3，或PBS+50％蔗糖+10％谷氨酸钠+10胎牛血清；

[0053] (4)病毒维持液：MEM+5％新生牛血清+1％谷氨酰胺；

[0054] (5)固定液：90％乙醇+10％甲醛；

[0055] (6)抗水痘‑带状疱疹病毒抗体

[0056] (7)荧光标记二抗(如羊抗鼠FITC‑IgG)

[0057] (8)洗液：PBS+1‰Tween20

[0058] 2.荧光检测方法

[0059] 第一步细胞培养：二倍体细胞(MRC‑5细胞或2BS细胞或KMB‑17细胞)经计数2.0‑5
2.5×10 /ml接种96孔板中，每孔0.1ml，所述生长液为MEM培养液，内含10％新生牛血清，
1％谷氨酰胺，并用NaHCO3调PH值至7.2左右，在37℃、5％二氧化碳孵箱培养24小时。

[0060] 第二步接种病毒样品：将待测病毒样品经稀释液稀释至5‑30PFU/50μl，接种至步骤一所述96孔板单层细胞中，每孔50μl,每个稀释度样品接种4‑8孔，每孔补加维持液150μ
l，置37℃、5％二氧化碳孵箱培养72小时。

[0061] 第三步细胞固定：弃96孔板旧液，每孔加细胞固定液200μl，室温固定15分钟，弃固定液，用PBST洗板3次。

[0062] 第四步染色：每孔加适宜浓度的本发明所述抗水痘病毒抗体100μl，置37℃、5％二氧化碳孵箱孵育1小时，用PBST洗板3次后，每孔加适宜浓度的荧光标记抗体(二抗)100μl，
置37℃、5％二氧化碳孵箱孵育40分钟，用PBST洗板3次.

[0063] 第五步读板：荧光显微镜下观察每孔蚀斑数量，或用荧光计数仪检测结果，计算病毒滴度。检测结果见图1和图2。

[0064] 由图1可知，本发明所述荧光检测方法的检测结果肉眼清晰可辨，能够有效减少人为误判因素的影响。而图2中，结合荧光检测仪器更是可以快速准确的对检测结果进行自动
检测，显著降低误判。

[0065] 3.荧光检测方法与传统蚀斑法对比实验

[0066] 设置4组检测对比实验，每组分别以本发明所述荧光检测方法和传统蚀斑法进行检测，而荧光检测方法分别选择本发明所述野生型抗VZV抗体和突变型抗VZV抗体进行检
测，检测结果如表1所示。

[0067] 表1：荧光检测法与传统蚀斑法对比实验结果

[0068]

[0069] 由上述表1中结果可知，本发明的荧光检测方法能够有效减少检测时间(仅需5天)，远快于传统蚀斑法的10天检测时间，显著提交了检测效率；且对比结果表明，使用本发
明的突变型抗体能够取得与传统蚀斑法相当的实验结果；而野生型抗体组，其检测结果明
显存在一定稳定性不足的问题，结果起伏较为明显。

[0070] 4.本发明荧光检测方法检测结果重复性评价

[0071] 对设置的每组样品进行多孔检测(3孔)评价，包括以野生型与突变型的对比结果，结果见表。

[0072] 表2(1)：荧光法的样品重复滴度测定结果(突变型)：(可限范围0.25logPFU/ml)

[0073] 样品 样品1 样品2 样品3 样品4孔1 4.36 4.46 3.74 4.15
孔2 4.28 4.51 3.90 4.09
孔3 4.33 4.39 3.82 4.18

[0074] 表2(2)：荧光法的样品重复滴度测定结果(野生型)：(可限范围0.25logPFU/ml)

[0075] 样品 样品1 样品2 样品3 样品4孔1 4.38 4.21 3.22 3.78
孔2 4.01 4.58 3.76 4.22
孔3 3.89 4.08 3.46 4.01

[0076] 由表2(1)结果可知，本发明所述的抗体及所述荧光检测方法对同一样品的多次检测结果均非常相近，误差较小。

[0077] 由表2(2)结果可知，野生型抗体的检测结果虽然能够很好检测样品病毒滴度，但其检测结果波动较大，对检测结果造成一定的误差，推测应为野生型抗体受到检测环境等
影响，其结合稳定性存在一定不足。

[0078] 也就是说，本发明所述的抗体及检测方法能够显著缩短VZV病毒滴度检测时间，且检测结果准确可靠，操作简便。

[0079]

[0080]

[0081]