一种纳米乳液药物载体及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种纳米乳液药物载体及其制备方法与应用。本发明利用β‑环糊精具有增加疏水性药物水溶性的性能，将其接枝到具有生物粘附性的壳聚糖季铵盐上，对他克莫司或其他疏水性药物进行负载，再利用聚阳离子与聚阴离子通过静电作用形成聚电解质复合物的原理，将负载了药物的β‑环糊精‑壳聚糖季铵盐与羧甲基纤维素钠溶液结合，得到目标药物制剂；如果省略对他克莫司或其他疏水性药物进行负载，那么得到的是纳米乳液药物载体。本发明所述纳米乳液药物载体载药后具有良好的生物相容性，实现双重缓释，可达到长效治疗的效果，所得乳液制剂稳定性好，粒径均一，安全无毒性作用，具有广泛的应用。

权利要求

1.一种纳米乳液药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以溶剂为反应介质，将β-环糊精和顺丁烯二酸酐在60～90℃下反应8～12h，沉淀，洗涤，抽滤，干燥，得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯；

（2）将β-环糊精顺丁烯二酸单酯溶于水，加入交联剂活化2～3h，然后加入壳聚糖季铵盐水溶液，室温反应12～36h，透析，冻干，得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐；

（3）将羧甲基纤维素钠溶于水中，酸化1～2h，将壳聚糖和β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐混合均匀后加入到酸化后的体系中，搅拌，得到纳米乳液药物载体。

2.根据权利要求1所述一种纳米乳液药物载体的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述β-环糊精和顺丁烯二酸酐的摩尔比为1：（1～2）；

步骤（2）所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯与交联剂的摩尔比为（2～4）：1；

步骤（2）所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯与壳聚糖季铵盐水溶液中的壳聚糖季铵盐单体的摩尔比为（1～2）：1；

步骤（3）所述羧甲基纤维素钠与壳聚糖的质量比为1：（1～2）；所述壳聚糖和β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐的质量比为1：（0.25～0.5）；

步骤（2）所述交联剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合物，其中NHS与EDC的质量比为1：（1～3）。

3.根据权利要求1或2所述一种纳米乳液药物载体的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述β-环糊精在溶剂中的浓度为0.1 0.2 mol/L；步骤（2）所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯溶于~水所得溶液的浓度为4～8 wt%；步骤（2）所述壳聚糖季铵盐水溶液的浓度为3～6 wt%；步骤（3）所述羧甲基纤维素钠溶于水所得溶液的浓度为1 2 wt%；步骤（3）所述酸化指向体系中~加入浓度为18.2～36.5 wt%的盐酸进行酸化，其中盐酸与羧甲基纤维素钠水溶液的体积比为（1 2）：30；步骤（3）所述搅拌的转速为1000～1200rpm，时间为4～10h。

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4.权利要求1～3任一项所述方法制得的一种纳米乳液药物载体。

5.权利要求4所述一种纳米乳液药物载体在药物制备中的应用。

6.一种他克莫司纳米乳滴眼液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以溶剂为反应介质，将β-环糊精和顺丁烯二酸酐在60～90℃下反应8～12h，沉淀，洗涤，抽滤，干燥，得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯；

（2）将β-环糊精顺丁烯二酸单酯溶于水，加入交联剂活化2～3h，然后加入壳聚糖季铵盐水溶液，室温反应12～36h，透析，冻干，得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐；

（3）在搅拌状态下，将他克莫司乙醇溶液加入到β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐水溶液中，超声，搅拌，离心收集溶液，冷冻干燥，得到他克莫司包含物；

（4）将羧甲基纤维素钠溶于水中，酸化1～2h，将壳聚糖和他克莫司包含物混合均匀后加入到酸化后的体系中，搅拌，得到他克莫司纳米乳滴眼液。

7.根据权利要求6所述一种他克莫司纳米乳滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述β-环糊精和顺丁烯二酸酐的摩尔比为1：（1～2）；步骤（2）所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯与交联剂的摩尔比为（2～4）：1；

步骤（2）所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯与壳聚糖季铵盐水溶液中的壳聚糖季铵盐单体的摩尔比为（1～2）：1；

步骤（3）所述他克莫司乙醇溶液的浓度为2 4wt%；所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝~壳聚糖季铵盐水溶液的浓度为9.8 19.6wt%；

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步骤（3）所述他克莫司乙醇溶液中的他克莫司与β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐水溶液中的β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐的质量比为1:（49～98）；

步骤（4）所述羧甲基纤维素钠与壳聚糖的质量比为1：（1～2）；所述壳聚糖和他克莫司包含物的质量比为（2～4）：1。

8.根据权利要求6或7所述一种他克莫司纳米乳滴眼液的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述β-环糊精在溶剂中的浓度为0.1 0.2 mol/L；步骤（2）所述β-环糊精顺丁烯二酸单~酯溶于水所得溶液的浓度为4～8 wt%；步骤（2）所述交联剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合物，其中NHS与EDC的质量比为1：（1～3）；

步骤（2）所述壳聚糖季铵盐水溶液的浓度为3 6 wt%；步骤（4）所述羧甲基纤维素钠溶~于水所得溶液的浓度为1 2 wt%；步骤（4）所述酸化指向体系中加入浓度为18.2 36.5 wt%~ ~的盐酸进行酸化，其中盐酸与羧甲基纤维素钠水溶液的体积比为（1 2）：30；步骤（4）所述搅~拌的转速为1000～1200rpm，时间为4～10h。

9.权利要求6～8任一项所述方法制得的一种他克莫司纳米乳滴眼液。

10.权利要求9所述一种他克莫司纳米乳滴眼液在药物制备中的应用。

说明书

一种纳米乳液药物载体及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医用高分子技术领域，具体涉及一种纳米乳液药物载体及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 干眼症是泪液和眼表面的多因素疾病，表现为眼部不适、视觉障碍和泪膜不稳定，并对眼表面造成潜在损害，常常与眼表面炎症相关。干眼症看似一个小问题，但影响着人们的生活质量，已经是一个日益严重的公共健康问题，促使数百万人寻求眼科护理。其发病机制十分复杂，各种诱因可通过不同的途径影响泪腺的正常功能，泪液的减少使眼表处于相对干燥的环境，导致对眼表神经的过量刺激，同时激活了自身免疫机制，引发眼表和泪腺的免疫性炎症，导致眼表上皮的实质性损害。临床上干眼症的治疗主要为局部滴人工泪液或使用促泪液分泌的药物等，人工泪液可以缓解轻度干眼症患者眼表干涩的症状，暂时稳定泪膜。作为传统的眼用制剂，滴眼剂虽然配制过程简单，给药方便，作用也迅速，但因为药物以溶液形式存在，无生物粘附性，因而容易被泪液稀释并随着泪液从泪道排出，导致生物利用度较低，同时，药物的作用时间也非常短，这就意味着需要频繁给药，极为不便。另外，眼膏剂因其粘度较大，延长了药物在眼部的滞留时间，从而提高了生物利用度。但在眼膏剂中，由于水溶性药物以晶粒形式存在，只有接触到泪液时才溶解，意味着药物的有效浓度降低，且眼膏剂基质会使眼部产生异物感，加上透明度差造成视力受到影响，导致病人的顺应性差。相对之下，近年出现的眼科药物缓释系统提供了新型的给药方法，正逐渐显示其独特的优势和前景，其中包括胶粒系统如聚合物胶束、微乳、脂质体等；微粒系统如纳米粒、纳米囊、纳米混悬剂、微球、纳米结构脂质载体和固体脂质纳米粒等；凝胶系统如原位凝胶和生物黏附性凝胶等；插入剂与植入剂等。

[0003] 自从认识到炎症在干眼症中的作用，针对干眼症眼表免疫性治疗成为治疗干眼症的一个新的方向。他克莫司(FK506)为临床上常见使用的免疫抑制剂，能够抑制眼部表面炎性介质的表达，从而恢复健康泪膜的分泌，减少症状和体征，达到治疗干眼症的效果。而他克莫司是一种高亲脂性大环内酯，其疏水性和相对高分子量使得它很难以溶解的形式存在于角膜表面，这阻碍了它在角膜和结膜的转运或渗透。此外，鼻泪管引流、泪液冲洗、局部溶液的短停留时间更是降低了他克莫司的生物利用度。因此，需要开发能够改善药物溶解度、增强渗透性和延长角膜前停留时间的眼科药物载体及制剂。

发明内容

[0004] 为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种纳米乳液药物载体的制备方法。该制备方法是利用β-环糊精具有增加疏水性药物水溶性的性能，将其接枝到具有生物粘附性的壳聚糖季铵盐上，再利用聚阳离子与聚阴离子通过静电作用形成聚电解质复合物的原理，将β-环糊精-壳聚糖季铵盐与羧甲基纤维素钠溶液结合，得到米乳液药物载体。

[0005] 本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的一种纳米乳液药物载体。

[0006] 本发明的另一目的在于提供上述一种纳米乳液药物载体的应用。

[0007] 本发明的再一目的在于提供一种他克莫司纳米乳滴眼液及其制备方法，该他克莫司纳米乳滴眼液是利用β-环糊精具有增加疏水性药物水溶性的性能，将其接枝到具有生物粘附性的壳聚糖季铵盐上，对他克莫司进行负载，再利用聚阳离子与聚阴离子通过静电作用形成聚电解质复合物的原理，将负载了他克莫司的β-环糊精-壳聚糖季铵盐与羧甲基纤维素钠溶液结合，得到载药聚电解质复合物纳米乳滴眼液。该滴眼液具有良好的生物相容性，对人体安全无毒性作用，可以治疗干眼症。

[0008] 本发明目的通过以下技术方案实现：

[0009] 一种纳米乳液药物载体的制备方法，包括以下步骤：

[0010] (1)以溶剂为反应介质，将β-环糊精(β-CD)和顺丁烯二酸酐在60～90℃下反应8～12h，沉淀，洗涤，抽滤，干燥，得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯(CM)；

[0011] (2)将β-环糊精顺丁烯二酸单酯溶于水，加入交联剂活化2～3h，然后加入壳聚糖季铵盐(HACC)水溶液，室温反应12～36h，透析，冻干，得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐(CMH)；

[0012] (3)将羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶于水中，酸化1～2h，将壳聚糖和β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐(CMH)混合均匀后加入到酸化后的体系中，搅拌，得到纳米乳液药物载体。

[0013] 优选的，步骤(1)所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、吡啶和二甲基亚砜中的至少一种。

[0014] 优选的，步骤(1)所述β-环糊精(β-CD)和顺丁烯二酸酐的摩尔比为1：(1～2)。

[0015] 优选的，步骤(1)所述β-环糊精(β-CD)在溶剂中的浓度为0.1～0.2mol/L。

[0016] 优选的，步骤(1)所述反应β-环糊精(β-CD)和顺丁烯二酸酐加入溶剂后，可以先在室温下搅拌至完全溶解，再升温反应。

[0017] 优选的，步骤(1)所述沉淀所用的沉淀剂为二氯甲烷，所述洗涤所用的洗涤剂为丙酮，所述干燥为真空干燥。

[0018] 优选的，步骤(2)所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯溶于水所得溶液的浓度为4～8wt％。

[0019] 优选的，步骤(2)所述交联剂为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合物，其中NHS与EDC的质量比为1：(1～3)。

[0020] 优选的，步骤(2)所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯与交联剂的摩尔比为(2～4)：1。

[0021] 优选的，步骤(2)所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯与壳聚糖季铵盐水溶液中的壳聚糖季铵盐单体的摩尔比为(1～2)：1。

[0022] 优选的，步骤(2)所述壳聚糖季铵盐(HACC)水溶液的浓度为3～6wt％[0023] 优选的，步骤(2)所述透析指在水中透析2～3次，每次透析12～24h；所述冻干的条件为：-90℃的冷冻干燥机中干燥24～36h。

[0024] 优选的，步骤(3)所述羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶于水所得溶液的浓度为1～2wt％。

[0025] 优选的，步骤(3)所述酸化指向体系中加入浓度为18.2～36.5wt％的盐酸进行酸化，其中盐酸与羧甲基纤维素钠水溶液的体积比为(1～2)：30。

[0026] 优选的，步骤(3)所述羧甲基纤维素钠与壳聚糖的质量比为1：(1～2)；所述壳聚糖和β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐的质量比为1：(0.25～0.5)。

[0027] 优选的，步骤(3)所述搅拌的转速为1000～1200rpm，时间为4～10h。

[0028] 上述方法制得的一种纳米乳液药物载体。

[0029] 上述一种纳米乳液药物载体的应用。

[0030] 一种他克莫司纳米乳滴眼液的制备方法，包括以下步骤：

[0031] (1)以溶剂为反应介质，将β-环糊精(β-CD)和顺丁烯二酸酐在60～90℃下反应8～12h，沉淀，洗涤，抽滤，干燥，得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯(CM)；

[0032] (2)将β-环糊精顺丁烯二酸单酯溶于水，加入交联剂活化2～3h，然后加入壳聚糖季铵盐(HACC)水溶液，室温反应12～36h，透析，冻干，得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐(CMH)；

[0033] (3)在搅拌状态下，将他克莫司(FK506)乙醇溶液加入到β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐水溶液中，超声，搅拌，离心收集溶液，冷冻干燥，得到他克莫司包含物；

[0034] (4)将羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶于水中，酸化1～2h，将壳聚糖(CS)和他克莫司包含物混合均匀后加入到酸化后的体系中，搅拌，得到他克莫司纳米乳滴眼液。

[0035] 优选的，步骤(1)所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、吡啶和二甲基亚砜中的至少一种。

[0036] 优选的，步骤(1)所述β-环糊精(β-CD)和顺丁烯二酸酐的摩尔比为1：(1～2)。

[0037] 优选的，步骤(1)所述β-环糊精(β-CD)在溶剂中的浓度为0.1～0.2mol/L。

[0038] 优选的，步骤(1)所述β-环糊精(β-CD)和顺丁烯二酸酐加入溶剂后，可以先在室温下搅拌至完全溶解，再升温反应。

[0039] 优选的，步骤(1)所述沉淀所用的沉淀剂为二氯甲烷，所述洗涤所用的洗涤剂为丙酮。

[0040] 优选的，步骤(2)所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯溶于水所得溶液的浓度为4～8wt％。

[0041] 优选的，步骤(2)所述交联剂为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)混合物，其中NHS与EDC的质量比为1：(1～3)。

[0042] 优选的，步骤(2)所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯与交联剂的摩尔比为(2～4)：1。

[0043] 优选的，步骤(2)所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯与壳聚糖季铵盐水溶液中的壳聚糖季铵盐单体的摩尔比为(1～2)：1。

[0044] 优选的，步骤(2)所述壳聚糖季铵盐(HACC)水溶液的浓度为3～6wt％。

[0045] 优选的，步骤(2)所述透析指在水中透析2～3次，每次透析12～24h；所述冻干的条件为：-90℃的冷冻干燥机中干燥24～36h。

[0046] 优选的，步骤(3)所述他克莫司乙醇溶液的浓度为2～4wt％；所述β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐水溶液的浓度为9.8～19.6wt％。

[0047] 优选的，步骤(3)所述他克莫司乙醇溶液中的他克莫司与β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐水溶液中的β-环糊精顺丁烯二酸单酯接枝壳聚糖季铵盐的质量比为1:(49～98)。

[0048] 优选的，步骤(3)所述加入指在2～10min内将他克莫司乙醇溶液滴加到β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐水溶液中。

[0049] 优选的，步骤(3)所述超声时间为5～10min；搅拌时间为12～24h。

[0050] 优选的，步骤(3)所述冷冻干燥的条件为：-90℃的冷冻干燥机中干燥24～36h。

[0051] 优选的，步骤(4)所述羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶于水所得溶液的浓度为1～2wt％。

[0052] 优选的，步骤(4)所述酸化指向体系中加入浓度为18.2～36.5wt％的盐酸进行酸化，其中盐酸与羧甲基纤维素钠水溶液的体积比为(1～2)：30。

[0053] 优选的，步骤(4)所述羧甲基纤维素钠与壳聚糖的质量比为1：(1～2)；所述壳聚糖和他克莫司包含物的质量比为(2～4)：1。

[0054] 优选的，步骤(4)所述搅拌的转速为1000～1200rpm，时间为4～10h。

[0055] 上述方法制得的一种他克莫司纳米乳滴眼液。

[0056] 上述一种他克莫司纳米乳滴眼液在药物制备中的应用。

[0057] 本发明所用壳聚糖是由单体β-(1-4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖构成的碱性多糖，无刺激作用，具有良好的生物相容性、生物粘附性和生物可降解性，其降解产物无毒，能被生物体完全吸收，作为理想药物载体一直受到广泛关注。β-环糊精分子因其独特的结构而使β-环糊精外侧呈亲水性，而内侧为疏水空腔，可以以此来包含疏水性的化合物分子，从而增加化合物的溶解性。该纳米乳滴眼液将β-环糊精接枝到具有生物粘附性的壳聚糖季铵盐上，对他克莫司等疏水性的药物进行负载，具有一定的缓释功能，再利用聚阳离子与聚阴离子通过静电作用形成聚电解质复合物的原理，将负载了他克莫司等疏水性的药物的β-环糊精-壳聚糖季铵盐与羧甲基纤维素钠溶液结合，得到载药聚电解质复合物纳米乳滴眼液，实现双重缓释，达到长效治疗。

[0058] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

[0059] (1)本发明利用β-环糊精接枝到生物粘附性好的壳聚糖季铵盐上，再利用β-环糊精的疏水空腔结构负载上他克莫司等疏水性药物，再与羧甲基纤维素钠溶液结合，得到载药聚电解质复合物纳米乳滴眼液或其他药物制剂，其具有良好的生物相容性，实现双重缓释，可达到长效治疗的效果。

[0060] (2)本发明制备的他克莫司纳米乳滴眼液，稳定性好，粒径均一，安全无毒性作用，生物粘附性好，从而降低用药频率，提高生物利用度。

[0061] (3)本发明制备的纳米乳液药物载体，不仅适用于他克莫司，还可适用其他疏水性的小分子药物，具有广泛的应用。

附图说明

[0062] 图1为实施例1所得的β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐的红外谱图。

[0063] 图2为实施例1所得的他克莫司纳米乳滴眼液的DSC谱图，其中CMC-Na为羧甲基纤维素钠，CS为壳聚糖，FK506为他克莫司。

[0064] 图3为实施例1所得的他克莫司纳米乳滴眼液和实施例6所得纳米乳液药物载体(无FK506乳液)的粒径电位图。

[0065] 图4为实施例7中药物缓释效果。

[0066] 图5为实施例8中细胞毒性结果。

具体实施方式

[0067] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0068] 本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0069] 实施例1

[0070] (1)β-环糊精顺丁烯二酸单酯的制备：室温下，将11.34gβ-环糊精和9.8g顺丁烯二酸酐经搅拌溶解在50ml N,N-二甲基甲酰胺中，升温加热到60℃反应8h，经二氯甲烷沉淀和丙酮洗涤，抽滤收集产物，烘干得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯。

[0071] (2)β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐的制备：在50ml水中溶解4g步骤(1)得到的β-环糊精顺丁烯二酸单酯，加入交联剂1g NHS和1g EDC活化2h；将3g壳聚糖季铵盐溶解在50ml水中，在磁力搅拌下加入到上述溶液中，室温反应12h，经透析3次，每次12h，冻干，收集产物，得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐。

[0072] (3)他克莫司包含物的制备：在10ml水中溶解0.98g步骤(2)得到的β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐；将0.02g他克莫司溶解于1ml无水乙醇中，在磁力搅拌下在2mins的时间内滴加到上述溶液中，经超声5min，搅拌12h，离心收集溶液，置于-20℃中存放凝固结冰，-90℃冷冻干燥24h得到他克莫司包含物；所述的β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐和他克莫司的质量比为49:1。

[0073] (4)纳米乳滴眼液的制备：于30ml水中加入0.6g羧甲基纤维素钠，在转速为1000rpm下搅拌溶解至溶液澄清透明，加入1ml浓度为36.5wt％的盐酸酸化1h；将0.6g壳聚糖与0.3g他克莫司包含物混合均匀，加入到上述溶液中，继续搅拌4h，最终得到聚电解质纳米乳滴眼液。

[0074] 实施例2

[0075] (1)β-环糊精顺丁烯二酸单酯的制备：室温下，将11.34gβ-环糊精和19.6g顺丁烯二酸酐经搅拌溶解在100ml N,N-二甲基甲酰胺中，升温加热到90℃反应12h，经二氯甲烷沉淀和丙酮洗涤，抽滤收集产物，烘干得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯。

[0076] (2)β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐的制备：在50ml水中溶解2g步骤(1)得到的β-环糊精顺丁烯二酸单酯，加入交联剂0.5g NHS和1.5g EDC活化3h；将1.5g壳聚糖季铵盐溶解在25ml水中，在磁力搅拌下加入到上述溶液中，室温反应36h，经透析3次，每次24h，冻干，收集产物，得到β-环糊精顺丁烯单酯接壳聚糖季铵盐。

[0077] (3)他克莫司包含物的制备：在10ml水中溶解1.96g步骤(2)得到的β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐；将0.02g他克莫司溶解于0.5ml无水乙醇中，在磁力搅拌下在2mins的时间内滴加到上述溶液中，经超声10min，搅拌24h，离心收集溶液，置于-20℃中存放凝固结冰，-90℃冷冻干燥36h得到他克莫司包含物；所述的β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐和他克莫司的质量比为98:1。

[0078] (4)纳米乳滴眼液的制备：于30ml水中加入0.6g羧甲基纤维素钠，转速为1200rpm搅拌溶解至溶液澄清透明，加入2ml浓度为18.2wt％的盐酸酸化2h；将1.2g壳聚糖与0.6g他克莫司包含物混合均匀，加入到上述溶液中，继续搅拌10h，最终得到聚电解质纳米乳滴眼液。

[0079] 实施例3

[0080] (1)β-环糊精顺丁烯二酸单酯的制备：室温下，将11.34gβ-环糊精和14.4g顺丁烯二酸酐经搅拌溶剂在75ml吡啶中，升温加热到75℃反应10h，经二氯甲烷沉淀和丙酮洗涤，抽滤收集产物，烘干得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯。

[0081] (2)β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐的制备：在50ml水中溶解4g步骤(1)得到的β-环糊精顺丁烯单酯，加入交联剂1g NHS和1.5g EDC活化2.5h；将3g壳聚糖季铵盐溶解在100ml水中，在磁力搅拌下加入到上述溶液中，室温反应24h，经透析3次，每次18h，冻干，收集产物，得到β-环糊精顺丁烯单酯接壳聚糖季铵盐。

[0082] (3)他克莫司包含物的制备：在10ml水中溶解1.47g步骤(2)得到的β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐；将0.02g他克莫司溶解于0.75ml无水乙醇中，在磁力搅拌下在2min的时间内滴加到上述溶液中，经超声7min，搅拌18h，离心收集溶液，置于-20℃中存放凝固结冰，-90℃冷冻干燥30h得到他克莫司包含物；所述的β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐和他克莫司的质量比为73.5:1。

[0083] (4)纳米乳滴眼液的制备：于30ml水中加入0.3g羧甲基纤维素钠，转速为1100rpm搅拌溶解至溶液澄清透明，加入1ml浓度为18.2wt％的盐酸酸化1.5h；将0.45g壳聚糖与0.15g他克莫司包含物混合均匀，加入到上述溶液中，继续搅拌7h，最终得到聚电解质纳米乳滴眼液。

[0084] 实施例4

[0085] (1)β-环糊精顺丁烯二酸单酯的制备：室温下，11.34gβ-环糊精和9.8g顺丁烯二酸酐经搅拌溶解在60ml N,N-二甲基甲酰胺中，升温加热到60℃反应12h，经二氯甲烷沉淀和丙酮洗涤，抽滤收集产物，烘干得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯。

[0086] (2)β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐的制备：在50ml水中溶解4g步骤(1)得到的β-环糊精顺丁烯二酸单酯，加入交联剂1g NHS和2g EDC活化2h；将3g壳聚糖季铵盐溶解在75ml水中，在磁力搅拌下加入到上述溶液中，室温反应36h，经透析3次，每次12h，冻干，收集产物，得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐。

[0087] (3)他克莫司包含物的制备：在10ml水中溶解步骤(2)得到的0.98gβ-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐；将0.02g他克莫司溶解于1ml无水乙醇中，在磁力搅拌下在2mins的时间内滴加到上述溶液中，经超声10min，搅拌12h，离心收集溶液，置于-20℃中存放凝固结冰，-90℃冷冻干燥24h得到他克莫司包含物；所述的β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐和他克莫司的质量比为49:1。

[0088] (4)纳米乳滴眼液的制备：于30ml水中加入0.45g羧甲基纤维素钠，转速为1200rpm搅拌溶解至溶液澄清透明，加入1ml浓度为22.5wt％的盐酸酸化1h；将0.6g壳聚糖与0.3g他克莫司包含物混合均匀，加入到上述溶液中，继续搅拌10h，最终得到聚电解质纳米乳滴眼液。

[0089] 实施例5

[0090] (1)β-环糊精顺丁烯二酸单酯的制备：室温下，将11.34gβ-环糊精和19.6g顺丁烯二酸酐经搅拌溶解在100ml二甲基亚砜中，升温加热到90℃反应8h，经二氯甲烷沉淀和丙酮洗涤，抽滤收集产物，烘干得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯。

[0091] (2)β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐的制备：在50ml水中溶解3g步骤(1)得到的β-环糊精顺丁烯二酸单酯，加入交联剂0.5g NHS和0.5gEDC活化3h；将2.25g壳聚糖季铵盐溶解在50ml水中，在磁力搅拌下加入到上述溶液中，室温反应12h，经透析3次，每次24h，冻干，收集产物，得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐。

[0092] (3)他克莫司包含物的制备：在10ml水中溶解0.98g步骤(2)得到的β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐；将0.02g他克莫司溶解于0.5ml无水乙醇中，在磁力搅拌下在2mins的时间内滴加到上述溶液中，经超声5min，搅拌24h，离心收集溶液，置于-20℃中存放凝固结冰，-90℃冷冻干燥24h得到他克莫司包含物。

[0093] (4)纳米乳滴眼液的制备：于30ml水中加入0.6g羧甲基纤维素钠，转速为1000rpm搅拌溶解至溶液澄清透明，加入1ml浓度为36.5wt％的盐酸酸化2h；将1.2g壳聚糖与0.3g他克莫司包含物混合均匀，加入到上述溶液中，继续搅拌4h，最终得到聚电解质纳米乳滴眼液。

[0094] 实施例6纳米乳液药物载体(无FK506乳液)的制备

[0095] (1)β-环糊精顺丁烯二酸单酯的制备：室温下，将11.34gβ-环糊精和9.8g顺丁烯二酸酐经搅拌溶解在80ml N,N-二甲基甲酰胺中，升温加热到60℃反应8h，经二氯甲烷沉淀和丙酮洗涤，抽滤收集产物，烘干得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯。

[0096] (2)β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐的制备：在50ml水中溶解4g步骤(1)得到的β-环糊精顺丁烯单酯，加入交联剂1g NHS和1g EDC活化2h；将3g壳聚糖季铵盐溶解在50ml水中，在磁力搅拌下加入到上述溶液中，室温反应12h，经透析3次，每次12h，冻干，收集产物，得到β-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐。

[0097] (3)纳米乳液药物载体(无FK506乳液)的制备：于30ml水中加入0.6g羧甲基纤维素钠，在转速为1000rpm下搅拌溶解至溶液澄清透明，加入1ml浓度为36.5wt％的盐酸酸化1h；将0.6g壳聚糖与0.3gβ-环糊精顺丁烯二酸单酯接壳聚糖季铵盐混合均匀，加入到上述溶液中，继续搅拌4h，最终得到纳米乳液药物载体(无FK506乳液)。

[0098] 实施例7药物缓释实验

[0099] 按照实施例1的方法制备的他克莫司纳米乳滴眼液，装入透析袋中，于0.01mol/L pH为7.4的PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)中，37℃下摇床震荡，定时取出2mL上述含药物的PBS溶液，同时立即补入2mL新鲜的PBS溶液，检测所取液(含药物的PBS溶液)的光吸收值，探究药物缓释规律。

[0100] 如图4所示，药物的释放过程可以分为三个阶段，在第一阶段0～60小时，药物较快释放，累计释放率达到了43％；第二阶段60～90小时为药物的零级释放阶段，药物的累计释放率达到了57％；90小时后为药物释放第三阶段，药物释放速率开始减缓，最终在120小时达到平衡，累计释放率为68％；可以得出药物缓慢释放，最后趋于稳定，具有长效缓释效果。

[0101] 实施例8他克莫司纳米乳滴眼液细胞毒性测定实验

[0102] 细胞毒性的测定采用小鼠成纤维细胞L929，使用CCK8试剂盒检测。方案如下：将复苏的L929细胞在高糖的DMEM(10％的血清)培养基中培养(37℃，5％CO2的条件下)，取对数生长期细胞备用；将细胞密度为2×104cells/mL的细胞悬液接种到96孔板中(200μL/孔)，培养24小时；4小时后取出96孔板中的培养基，并用PBS缓冲液淋洗细胞培养板，然后每孔加入实施例1制得的他克莫司纳米乳滴眼液(10、20、50、100、200μL)，每组重复3次，接着培养24小时，到达预设时间后，加入CCK8溶液(20μL/孔)，继续孵育4小时，在450nm处测定在溶液的吸光度。同样地，每孔中加入不含他克莫司药物的纳米乳液药物载体(实施例6所得)，其他实验条件与实验组一致，进行细胞毒性测定，作为阴性对照组；每孔中加入0.09％生理盐水，其他实验条件与实验组一致，进行细胞毒性测定，作为空白对照组。

[0103] 根据吸光度结果，计算小鼠成纤维细胞的存活率，存活率大于75％认为无细胞毒性；存活率小于50％，认为有细胞毒性。

[0104] 细胞存活率计算公式如下：

[0105]

[0106] 由图5可以看出L929细胞的存活率随着他克莫司纳米乳滴眼液投加量的增加变化不明显，L929细胞的存活率始终保持在75％以上，表明在该投加量范围内他克莫司纳米乳滴眼液并无细胞毒性。

[0107] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。