蛋白质GhPEL76_Dt及其编码基因与应用转让专利
申请号 : CN201910136757.6
文献号 : CN111606982B
文献日 : 2021-12-17
发明人 : 喻树迅 , 孙会茹 , 魏恒玲 , 王寒涛 , 马亮 , 苏政政
申请人 : 中国农业科学院棉花研究所
摘要 :
本发明公开了蛋白质GhPEL76_Dt及其编码基因与应用。蛋白质GhPEL76_Dt的氨基酸序列如序列表中序列2所示。实验证明，向野生型拟南芥Ler生态型中导入GhPEL76_Dt基因，得到转GhPEL76_Dt基因拟南芥；与野生型拟南芥Ler生态型相比，转GhPEL76_Dt基因拟南芥的表皮毛的长度显著增加、表皮毛的密度显著降低、叶柄长度显著增加和叶片宽度显著降低。本发明具有重要的应用价值。
权利要求 :
1.蛋白质GhPEL76_Dt的应用，为如下X1）‑X4）中的至少一种：X1）增加拟南芥表皮毛的长度；
X2）降低拟南芥表皮毛的密度；
X3）增加拟南芥叶柄长度；
X4）降低拟南芥叶片宽度；
所述蛋白质GhPEL76_Dt为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质GhPEL76_Dt的核酸分子的应用，为如下X1）‑X4）中的至少一种：
X1）增加拟南芥表皮毛的长度；
X2）降低拟南芥表皮毛的密度；
X3）增加拟南芥叶柄长度；
X4）降低拟南芥叶片宽度。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下b1）或b2）所示的DNA分子：
b1）编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；
b2）核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物的应用，为如下X1）‑X4）中的至少一种：X1）增加拟南芥表皮毛的长度；
X2）降低拟南芥表皮毛的密度；
X3）增加拟南芥叶柄长度；
X4）降低拟南芥叶片宽度。
5.权利要求1所述蛋白质GhPEL76_Dt、权利要求2或3所述核酸分子或含有权利要求2或
3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物，在培育表皮毛的长度增加和/或表皮毛的密度降低和/或叶柄长度增加和/或叶片宽度降低的转基因拟南芥中的应用。
6.一种培育转基因拟南芥的方法，包括如下步骤：向出发拟南芥导入编码权利要求1中所述蛋白质GhPEL76_Dt的核酸分子，得到转基因拟南芥；与出发拟南芥相比，转基因拟南芥的表皮毛的长度增加和/或表皮毛的密度降低和/或叶柄长度增加和/或叶片宽度降低。
7.一种拟南芥育种方法，包括如下步骤：向出发拟南芥导入编码权利要求1中所述蛋白质GhPEL76_Dt的核酸分子，从而增加表皮毛的长度和/或降低表皮毛的密度和/或增加叶柄长度和/或降低叶片宽度。
说明书 :
蛋白质GhPEL76_Dt及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质GhPEL76_Dt及其编码基因与应用。
背景技术
[0002] 棉花是我国重要的经济作物，在我国民经济发展中占有十分重要的地位，其纤维是最大的可再生纺织原料。棉纤维是由胚珠表皮细胞经分化、发育形成的单细胞，其发育过
程可分为4个相互重叠的时期：起始期、伸长期、次生壁增厚期和成熟期。不同发育阶段对棉
花纤维的产量和品质有着不同的影响，伸长期对最终的纤维长度起着重要的作用。纤维在
伸长过程中伴随着细胞壁的合成、松弛、骨架重排等结构和形态的改变。
程可分为4个相互重叠的时期：起始期、伸长期、次生壁增厚期和成熟期。不同发育阶段对棉
花纤维的产量和品质有着不同的影响，伸长期对最终的纤维长度起着重要的作用。纤维在
伸长过程中伴随着细胞壁的合成、松弛、骨架重排等结构和形态的改变。
[0003] 纤维是研究细胞分化、伸长和细胞壁形态改变的理想模型。研究表明，棉花纤维和拟南芥表皮毛都是起源于表皮细胞的单细胞，两者的发育机制存在一定的相似性(Zhang
Y，He P，Yang Z，Huang G，Wang L，Pang C，Xiao H，Zhao P，Yu J，Xiao G:A Genome‑Scale
Analysis of the PIN Gene Family Reveals Its Functions in Cotton Fiber
Development.Frontiers in plant science 2017，8:461.Wang S，Wang JW，Yu N，Li CH，
Luo B，Gou JY，Wang LJ，Chen XY:Control of plant trichome development by a
cotton fiber MYB gene.The Plant cell 2004，16(9):2323‑2334.Zhao B，Cao JF，Hu
GJ，Chen ZW，Wang LY，Shangguan XX，Wang LJ，Mao YB，Zhang TZ，Wendel JF et al:Core
cis‑element variation confers subgenome‑biased expression of a transcription
factor that functions in cotton fiber elongation.The New phytologist2018，218
(3):1061‑1075.)
Y，He P，Yang Z，Huang G，Wang L，Pang C，Xiao H，Zhao P，Yu J，Xiao G:A Genome‑Scale
Analysis of the PIN Gene Family Reveals Its Functions in Cotton Fiber
Development.Frontiers in plant science 2017，8:461.Wang S，Wang JW，Yu N，Li CH，
Luo B，Gou JY，Wang LJ，Chen XY:Control of plant trichome development by a
cotton fiber MYB gene.The Plant cell 2004，16(9):2323‑2334.Zhao B，Cao JF，Hu
GJ，Chen ZW，Wang LY，Shangguan XX，Wang LJ，Mao YB，Zhang TZ，Wendel JF et al:Core
cis‑element variation confers subgenome‑biased expression of a transcription
factor that functions in cotton fiber elongation.The New phytologist2018，218
(3):1061‑1075.)
发明内容
[0004] 本发明的目的是增加植物表皮毛的长度，例如增加棉花表皮毛(即纤维)的长度。
[0005] 本发明首先保护蛋白质GhPEL76_Dt，来源于陆地棉TM‑1。所述蛋白质GhPEL76_Dt可为如下a1)或a2)或a3)：
[0006] a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
[0007] a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0008] a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物表皮毛的长度和/或与植物表皮毛的密度和/或与植物叶柄长度和/或与
植物叶片宽度相关的蛋白质。
植物叶片宽度相关的蛋白质。
[0009] 其中，序列表中序列2由439个氨基酸残基组成。
[0010] 为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0011] 表1.标签的序列
[0012]标签 残基 序列
Poly‑Arg 5‑6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep‑tag II 8 WSHPQFEK
c‑myc 10 EQKLISEEDL
Poly‑Arg 5‑6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep‑tag II 8 WSHPQFEK
c‑myc 10 EQKLISEEDL
[0013] 上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0014] 上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0015] 上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端
和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0016] 编码所述蛋白质GhPEL76_Dt的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0017] 所述编码蛋白质GhPEL76_Dt的核酸分子具体可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：
[0018] b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0019] b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0020] b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于棉花且编码所述蛋白质GhPEL76_Dt的DNA分子；
[0021] b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于棉花且编码所述蛋白质GhPEL76_Dt的DNA分子。
[0022] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0023] 其中，序列表中序列1由1320个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。
[0024] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质GhPEL76_Dt的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，
具有与本发明分离得到的所述蛋白质GhPEL76_Dt的核苷酸序列75％或者更高同一性的核
苷酸，只要编码所述蛋白质GhPEL76_Dt，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发
明的序列。
具有与本发明分离得到的所述蛋白质GhPEL76_Dt的核苷酸序列75％或者更高同一性的核
苷酸，只要编码所述蛋白质GhPEL76_Dt，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发
明的序列。
[0025] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质GhPEL76_Dt的核苷酸序列具有
75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸
序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的
同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸
序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的
同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0026] 所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)棉花；c5)陆地棉TM‑1；c6)十字花科植物；c7)拟南芥；c8)野生型拟南芥Ler生
态型。
态型。
[0027] 含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
[0028] 所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。
[0029] 所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为实施例提及的重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt。所述重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt可为将pBI121质粒的限制性内切酶
XbaI识别序列和限制性内切酶SmaI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表的
序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。
XbaI识别序列和限制性内切酶SmaI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表的
序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。
[0030] 所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
[0031] 所述出发微生物可为农杆菌或大肠杆菌。所述农杆菌具体可为根癌农杆菌GV3101。
[0032] 所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为实施例提及的GV3101/pBI121‑GhPEL76_Dt(即将重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt导入根癌农杆菌GV3101，得到的重
组农杆菌)。
组农杆菌)。
[0033] 所述转基因细胞系不包括繁殖材料。
[0034] 本发明还保护上述任一所述蛋白质GhPEL76_Dt，或，上述任一所述核酸分子，或，含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，的应用，可
为如下X1)‑X4)中的至少一种：
为如下X1)‑X4)中的至少一种：
[0035] X1)调控植物表皮毛的长度；
[0036] X2)调控植物表皮毛的密度；
[0037] X3)调控植物叶柄长度；
[0038] X4)调控植物叶片宽度。
[0039] 上述应用中，所述调控植物表皮毛的长度可为植物表皮毛的长度增加或植物表皮毛的长度降低。所述调控植物表皮毛的密度可为植物表皮毛的密度降低或植物表皮毛的密
度增加。所述调控植物叶柄长度可为植物叶柄长度增加或植物叶柄长度降低。所述调控植
物叶片宽度可为植物叶片宽度降低或植物叶片宽度增加。
度增加。所述调控植物叶柄长度可为植物叶柄长度增加或植物叶柄长度降低。所述调控植
物叶片宽度可为植物叶片宽度降低或植物叶片宽度增加。
[0040] 本发明还保护上述任一所述蛋白质GhPEL76_Dt，或，上述任一所述核酸分子，或，含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育植物
的表皮毛的长度增加和/或表皮毛的密度降低和/或叶柄长度增加和/或叶片宽度降低的转
基因植物中的应用。
的表皮毛的长度增加和/或表皮毛的密度降低和/或叶柄长度增加和/或叶片宽度降低的转
基因植物中的应用。
[0041] 上述任一所述的应用中，所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)棉花；c5)陆地棉TM‑1；c6)十字花科植物；c7)拟南
芥；c8)野生型拟南芥Ler生态型。
芥；c8)野生型拟南芥Ler生态型。
[0042] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中上述任一所述蛋白质GhPEL76_Dt的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转
基因植物的表皮毛的长度增加和/或表皮毛的密度降低和/或叶柄长度增加和/或叶片宽度
降低。
基因植物的表皮毛的长度增加和/或表皮毛的密度降低和/或叶柄长度增加和/或叶片宽度
降低。
[0043] 所述“提高出发植物中上述任一所述蛋白质GhPEL76_Dt的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到提高蛋白质GhPEL76_
Dt的表达量和/或活性的效果。
Dt的表达量和/或活性的效果。
[0044] 上述方法中，所述“提高出发植物中蛋白质GhPEL76_Dt的表达量和/或活性”可通过向出发植物导入编码上述任一所述蛋白质GhPEL76_Dt的核酸分子实现。
[0045] 上述任一所述的方法中，所述编码蛋白质GhPEL76_Dt的核酸分子具体可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：
[0046] b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0047] b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0048] b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于棉花且编码所述蛋白质GhPEL76_Dt的DNA分子；
[0049] b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于棉花且编码所述蛋白质GhPEL76_Dt的DNA分子。
[0050] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0051] 其中，序列表中序列1由1320个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。
[0052] 所述“向出发植物导入编码上述任一所述蛋白质GhPEL76_Dt的核酸分子”具体可通过向出发植物导入含有编码上述任一所述蛋白质GhPEL76_Dt的核酸分子的重组载体实
现。所述“含有编码上述任一所述蛋白质GhPEL76_Dt的核酸分子的重组载体”具体可为所述
重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt。
现。所述“含有编码上述任一所述蛋白质GhPEL76_Dt的核酸分子的重组载体”具体可为所述
重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt。
[0053] 本发明还保护一种植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中上述任一所述蛋白质GhPEL76_Dt的含量和/或活性，从而增加表皮毛的长度和/或降低表皮毛的密度和/或
增加叶柄长度和/或降低叶片宽度。
增加叶柄长度和/或降低叶片宽度。
[0054] 上述任一所述植物可为如下c1)至c8)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)棉花；c5)陆地棉TM‑1；c6)十字花科植物；c7)拟南芥；c8)野生型拟
南芥Ler生态型。
南芥Ler生态型。
[0055] 上文中，棉花(如陆地棉TM‑1)表皮毛即棉花纤维。
[0056] 实验证明，向野生型拟南芥Ler生态型中导入重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt，得到转GhPEL76_Dt基因拟南芥；与野生型拟南芥Ler生态型相比，转GhPEL76_Dt基因拟南芥的表
皮毛的长度显著增加、表皮毛的密度显著降低、叶柄长度显著增加和叶片宽度显著降低。棉
花纤维和拟南芥表皮毛都是起源于表皮细胞的单细胞，两者的发育机制基本相同。因此可
以预见，向出发棉花中导入重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt，得到转GhPEL76_Dt基因棉花；与
出发棉花相比，转GhPEL76_Dt基因棉花的表皮毛(即转GhPEL76_Dt基因棉花的纤维)的长度
也显著增加。本发明具有重要的应用价值。
皮毛的长度显著增加、表皮毛的密度显著降低、叶柄长度显著增加和叶片宽度显著降低。棉
花纤维和拟南芥表皮毛都是起源于表皮细胞的单细胞，两者的发育机制基本相同。因此可
以预见，向出发棉花中导入重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt，得到转GhPEL76_Dt基因棉花；与
出发棉花相比，转GhPEL76_Dt基因棉花的表皮毛(即转GhPEL76_Dt基因棉花的纤维)的长度
也显著增加。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
[0057] 图1为拟南芥幼苗中GhPEL76_Dt基因的相对表达量。
[0058] 图2为拟南芥植株真叶上表皮毛的生长状态。
[0059] 图3为拟南芥植株真叶上表皮毛的长度和密度统计结果。
[0060] 图4为拟南芥植株的生长状态、叶柄长度的统计结果和叶片宽度的统计结果。
具体实施方式
[0061] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
[0062] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0063] 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0064] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0065] 陆地棉TM‑1记载于如下文献中：Tronlinder NL et al，1989，Plant Cell Rep 8:133‑136.。公众可以从中国农业学院棉花研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。在
下文中，陆地棉TM‑1简称为TM‑1。
下文中，陆地棉TM‑1简称为TM‑1。
[0066] 根癌农杆菌GV3101记载于如下文献中：郑银英，崔百明，常明进，彭明.转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究.西北植物学报.2009年29卷1期.75‑79.公众可以从中国
农业学院棉花研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。
农业学院棉花研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。
[0067] 野生型拟南芥Ler生态型记载于如下文献中：Piotr A，Ziolkowski，Grzegorz，Koczyk，Lukasz，Galganski，Jan，Sadowski.Genome sequence comparison of Col and
Ler lines reveals the dynamic nature of Arabidopsis chromosomes.[J].Nucleic
acids research，2009，37(10):3189‑201.。公众可以从中国农业科学院棉花研究所(即申
请人处)获得，以重复本申请实验。在下文中，野生型拟南芥Ler生态型简称野生型拟南芥。
Ler lines reveals the dynamic nature of Arabidopsis chromosomes.[J].Nucleic
acids research，2009，37(10):3189‑201.。公众可以从中国农业科学院棉花研究所(即申
请人处)获得，以重复本申请实验。在下文中，野生型拟南芥Ler生态型简称野生型拟南芥。
[0068] 反转录试剂盒为TaKaRa公司的产品，产品目录号为DRR037A；5×Buffer、 RT Enzyme Mix、Oligo dT Primer和Random 6mers均为反转录试剂
盒中的组件。LA HS为TaKaRa公司的产品，产品目录号为DRR042；10×LA PCR Buffer
2+
II(Mg Plus)为LA HS中的组件。
盒中的组件。LA HS为TaKaRa公司的产品，产品目录号为DRR042；10×LA PCR Buffer
2+
II(Mg Plus)为LA HS中的组件。
[0069] 实施例1、蛋白质GhPEL76_Dt的编码基因(GhPEL76_Dt基因)的克隆
[0070] 1、在陆地棉TM‑1的盛花期，采集开花后10d(即days post‑anthesis10，DPA10)的纤维，得到陆地棉TM‑1纤维。
[0071] 将陆地棉TM‑1纤维于液氮中冷冻，然后‑80℃保存。
[0072] 2、完成步骤1后，提取所述陆地棉TM‑1纤维的总RNA，然后按照反转录试剂盒的操作步骤反转录出第一链cDNA，得到陆地棉TM‑1的cDNA。
[0073] 反应体系为10μL，由2μL5× Buffer、0.5μ RT Enzyme Mix、0.5μLOligodT Primer(浓度为50μM)、0.5μLRandom 6mers(浓度为100μM)、陆
地棉TM‑1纤维的总RNA(约500ng)和RNase Free ddH2O组成。
地棉TM‑1纤维的总RNA(约500ng)和RNase Free ddH2O组成。
[0074] 反应条件为：37℃15min；85℃5s。
[0075] 3、完成步骤2后，将1体积份陆地棉TM‑1的cDNA和7体积份水混合，得到陆地棉TM‑1的cDNA稀释液。
[0076] 4、完成步骤3后，以陆地棉TM‑1的cDNA稀释液为模板，采用上游引物F：5’‑ATGGCTTTACTCCCCTCTA‑3’和下游引物R：5’‑TCAGCAACGAGAACCTTT‑3’组成的引物对进行PCR
扩增，得到PCR扩增产物。
扩增，得到PCR扩增产物。
[0077] 反应体系为50μL，由1μL模板、0.5μLLA HS(浓度为5U/μL)、5μL 10×LA PCR 2
BufferII(Mg +Plus)、8μL dNTP Mixture(2.5mM each)、1μL上游引物F水溶液(浓度为10μ
M)、1μL下游引物R水溶液(浓度为10μM)和33.5μL ddH2O组成。
BufferII(Mg +Plus)、8μL dNTP Mixture(2.5mM each)、1μL上游引物F水溶液(浓度为10μ
M)、1μL下游引物R水溶液(浓度为10μM)和33.5μL ddH2O组成。
[0078] 反应条件为：94℃2min；94℃30s，60℃45s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
[0079] 5、将步骤4得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
[0080] 结果表明，PCR扩增产物中含有约1320bp的DNA片段。
[0081] 将约1320bp的DNA片段进行测序。测序结果表明，该DNA片段(GhPEL76_Dt基因)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0082] GhPEL76_Dt基因编码序列表中序列2所示的蛋白质GhPEL76_Dt。经生物信息学分析，蛋白质GhPEL76_Dt的相对分子量为48.14kDa，等电点为8.02。
[0083] 实施例2、转GhPEL76_Dt基因拟南芥的获得及鉴定
[0084] 一、重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt的获得
[0085] 1、以 实施 例1 中步骤 4得到的 PCR扩 增产物为 模板 ，采用5’‑CTAGTCTAGAATGGCTTTACTCCCCTCTA‑3’(下划线为限制性内切酶XbaI的识别位点)和5’‑
TCCCCCGGGTCAGCAACGAGAACCTTT‑3’(下划线为限制性内切酶SmaI的识别位点)组成的引物
对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
TCCCCCGGGTCAGCAACGAGAACCTTT‑3’(下划线为限制性内切酶SmaI的识别位点)组成的引物
对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0086] 2、取步骤1得到的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，然后回收约1340bp的DNA片段。
[0087] 3、取步骤2回收的DNA片段，用限制性内切酶XbaI和SmaI酶切，回收约1330bp的酶切产物。
[0088] 4、取pBI121质粒(优宝生物公司的产品)，用限制性内切酶XbaI和SmaI酶切，回收约14kb的载体骨架。
[0089] 5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架进行连接，得到重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt。
[0090] 将重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt进行测序。根据测序结果，对重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt进行结构描述如下：将pBI121质粒的限制性内切酶XbaI识别序列和限制性内切
酶SmaI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表的序列1所示的DNA分子。
酶SmaI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表的序列1所示的DNA分子。
[0091] 重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt表达序列表中序列2所示的蛋白质GhPEL76_Dt。
[0092] 二、GV3101/pBI121‑GhPEL76_Dt的获得
[0093] 将重组质粒pBI121‑GhPEL76_Dt导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pBI121‑GhPEL76_Dt。
[0094] 三、转GhPEL76_Dt基因拟南芥的获得
[0095] 1、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floraldip：asimplified method for Agrobacterium‑mediated transformation
of Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735‑743.)，将步骤二中1获得的GV3101/
pBI121‑GhPEL76_Dt转至野生型拟南芥中，获得T1代转GhPEL76_Dt基因拟南芥种子。
of Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735‑743.)，将步骤二中1获得的GV3101/
pBI121‑GhPEL76_Dt转至野生型拟南芥中，获得T1代转GhPEL76_Dt基因拟南芥种子。
[0096] 2、将步骤1获得的T1代转GhPEL76_Dt基因拟南芥种子播种于含有50mg/L的卡那霉素的1/2MS培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代转GhPEL76_Dt基因阳性苗，
T1代转GhPEL76_Dt基因阳性苗收到的种子即为T2代转GhPEL76_Dt基因拟南芥种子。
T1代转GhPEL76_Dt基因阳性苗收到的种子即为T2代转GhPEL76_Dt基因拟南芥种子。
[0097] 3、将步骤2筛选出的不同株系的T2代转GhPEL76_Dt基因拟南芥种子播种于含有50mg/L的卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性
苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为GhPEL76_
Dt基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转GhPEL76_Dt基因拟
南芥种子。
苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为GhPEL76_
Dt基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转GhPEL76_Dt基因拟
南芥种子。
[0098] 4、将步骤3筛选出的T3代转GhPEL76_Dt基因拟南芥种子再次播种于含有50mg/L的卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合转GhPEL76_Dt基因拟南
芥。
芥。
[0099] 四、转GhPEL76_Dt基因拟南芥的鉴定
[0100] 1、分子鉴定
[0101] 分别提取各个T3代纯合转GhPEL76_Dt基因拟南芥株系叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用上游引物F：5’‑ATGGCTTTACTCCCCTCTA‑3’和下游引物R：5’‑
TCAGCAACGAGAACCTTT‑3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果PCR扩增产物
中含有约1320bp的DNA片段，则相应的拟南芥株系鉴定为转GhPEL76_Dt基因拟南芥纯合株
系。
TCAGCAACGAGAACCTTT‑3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。如果PCR扩增产物
中含有约1320bp的DNA片段，则相应的拟南芥株系鉴定为转GhPEL76_Dt基因拟南芥纯合株
系。
[0102] 结果表明，9个T3代纯合转GhPEL76_Dt基因拟南芥株系鉴定为转GhPEL76_Dt基因拟南芥纯合株系，依次命名为OE‑4至OE‑12。
[0103] 2、Real‑Time PCR检测转GhPEL76_Dt基因拟南芥中GhPEL76_Dt基因的表达量待测拟南芥种子为OE‑4的T3代种子、OE‑5的T3代种子、OE‑6的T3代种子、OE‑7的T3代种子、OE‑8的
T3代种子、OE‑9的T3代种子、OE‑10的T3代种子、OE‑11的T3代种子、OE‑12的T3代种子或野生型
拟南芥种子。
T3代种子、OE‑9的T3代种子、OE‑10的T3代种子、OE‑11的T3代种子、OE‑12的T3代种子或野生型
拟南芥种子。
[0104] (1)取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；再用0.2％(v/v)的次氯酸钠浸泡10min，无菌水洗涤3次，然后铺于1/2MS固体培养基上，4℃春化
2天。
2天。
[0105] (2)完成步骤(1)后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)7天，得到待测拟南芥幼苗。
[0106] (3)完成步骤(2)后，取所述待测拟南芥幼苗，放入液氮保存，得到相应的待测样本。
[0107] (4)提取待测样本的总RNA，然后按照反转录试剂盒的操作步骤反转录出第一链cDNA，得到待测样本的cDNA。
[0108] (5)以待测样本的cDNA作为模板，实时定量PCR检测GhPEL76_Dt基因的相对表达量(以UBQ10基因作为内参)。
[0109] 检测GhPEL76_Dt基因的引物为5’‑CCCCACGCCCATTCCTTC‑3’和5’‑GGGGATTAGGAGAGAAGTGAAGA‑3’，目的片段如序列表中序列1自5’末端第28至159位所示。
[0110] 检测UBQ10基因的引物为5’‑AGATCCAGGACAAGGAAGGTATTC‑3’和5’‑CGCAGGACCAAGTGAAGAGTAG‑3’。
[0111] 将野生型拟南芥幼苗中GhPEL76_Dt基因的相对表达量作为1，部分拟南芥幼苗中GhPEL76_Dt基因的相对表达量见图1(WT为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相
比，9个T3代纯合转GhPEL76_Dt基因拟南芥株系(OE‑4、OE‑5、OE‑6、OE‑7、OE‑8、OE‑9、OE‑10、
OE‑11和OE‑12)中GhPEL76_Dt基因的相对表达量均显著提高。
比，9个T3代纯合转GhPEL76_Dt基因拟南芥株系(OE‑4、OE‑5、OE‑6、OE‑7、OE‑8、OE‑9、OE‑10、
OE‑11和OE‑12)中GhPEL76_Dt基因的相对表达量均显著提高。
[0112] 3、表型鉴定
[0113] 待测拟南芥种子为OE‑4的T3代种子、OE‑5的T3代种子、OE‑6的T3代种子、OE‑7的T3代种子、OE‑8的T3代种子、OE‑9的T3代种子、OE‑10的T3代种子、OE‑11的T3代种子、OE‑12的T3
代种子或野生型拟南芥种子。
代种子或野生型拟南芥种子。
[0114] 实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
[0115] (1)取30粒待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；再用0.2％(v/v)的次氯酸钠浸泡10min，无菌水洗涤3次，然后铺于1/2MS固体培养基上，4℃春
化2天。
化2天。
[0116] (2)完成步骤(1)后，取待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)3周，得到拟南芥植株。
[0117] (3)取拟南芥植株的真叶，观察真叶上表皮毛的生长状态，并统计真叶上表皮毛的长度和密度。
[0118] 部分拟南芥植株真叶上表皮毛的生长状态见图2(A为野生型拟南芥，B为OE‑11)。部分拟南芥植株真叶上表皮毛的长度统计结果见图3中A(WT为野生型拟南芥，35S：：PEL76_
Dt为OE‑11)。部分拟南芥植株真叶上表皮毛的密度统计结果见图3中B(WT为野生型拟南芥，
35S：：PEL76_Dt为OE‑11)。结果表明，与野生型拟南芥相比，9个T3代纯合转GhPEL76_Dt基因
拟南芥株系(OE‑4、OE‑5、OE‑6、OE‑7、OE‑8、OE‑9、OE‑10、OE‑11和OE‑12)真叶上表皮毛的长
度显著增加、密度显著降低。
Dt为OE‑11)。部分拟南芥植株真叶上表皮毛的密度统计结果见图3中B(WT为野生型拟南芥，
35S：：PEL76_Dt为OE‑11)。结果表明，与野生型拟南芥相比，9个T3代纯合转GhPEL76_Dt基因
拟南芥株系(OE‑4、OE‑5、OE‑6、OE‑7、OE‑8、OE‑9、OE‑10、OE‑11和OE‑12)真叶上表皮毛的长
度显著增加、密度显著降低。
[0119] (4)完成步骤(1)后，取待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)4周，得到待测拟南芥植株。
[0120] (5)取完成步骤(4)待测拟南芥植株，观察拟南芥植株的生长状态，统计叶柄长度和叶片宽度。
[0121] 部分拟南芥植株的生长状态见图4中A。部分拟南芥植株叶柄长度的统计结果见图4中B(WT为野生型拟南芥)。部分拟南芥植株叶片宽度的统计结果见图4中C(WT为野生型拟
南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，9个T3代纯合转GhPEL76_Dt基因拟南芥株系(OE‑4、
OE‑5、OE‑6、OE‑7、OE‑8、OE‑9、OE‑10、OE‑11和OE‑12)的叶柄长度显著增加、叶片宽度显著降
低。
南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，9个T3代纯合转GhPEL76_Dt基因拟南芥株系(OE‑4、
OE‑5、OE‑6、OE‑7、OE‑8、OE‑9、OE‑10、OE‑11和OE‑12)的叶柄长度显著增加、叶片宽度显著降
低。
[0122] 总之，与野生型拟南芥相比，转GhPEL76_Dt基因拟南芥的表皮毛的长度显著增加、表皮毛的密度显著降低、叶柄长度显著增加和叶片宽度显著降低。