一种用于五种石斑鱼的分子鉴别引物、试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种用于五种石斑鱼的分子鉴别引物、试剂盒及方法。本发明首先提供了一种用于五种石斑鱼的分子鉴别引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；所述五种石斑鱼为云龙杂交斑、虎龙杂交斑、红龙杂交斑、赤点石斑鱼或斜带石斑鱼中的任意一种或几种。利用该引物，采用线粒体基因组DNA条形码与限制性核酸内切酶技术相结合的方法能够快速、有效的对五种石斑鱼进行鉴别，其反应稳定、重复性好；与传统的形态学鉴定相比，该方法具有检测准确性高、客观性强的特点；与单纯的线粒体基因组DNA条形码测序鉴定方法相比，该方法具有直观性强、判断简易的特点；因此，本发明提供的引物在鉴别五种石斑鱼或制备用于鉴别五种石斑鱼的试剂盒中具有广泛的应用前景。

权利要求

1.一种鉴别五种石斑鱼的方法，其特征在于，以待测样品的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物后酶切，将酶切产物电泳，根据电泳结果判定待测样品的石斑鱼类型；所述五种石斑鱼为云龙杂交斑、虎龙杂交斑、红龙杂交斑、赤点石斑鱼和斜带石斑鱼；

所述SEQ ID NO:1的核苷酸序列为TCGCCTGTTTATCAAAAACATCGC，所述SEQ ID NO:2的核苷酸序列为TCCGGTCTGAACTCAGATCACGTA；

所述酶切所用的内切酶为内切酶MluC I、内切酶BsrD I和内切酶Hinf I；

所述根据电泳结果判定待测样品的石斑鱼类型的方法为：当用内切酶MluC I和BsrD I进行双酶切时，如待测样品电泳图谱显示出2条大小分别为215～225bp和175～185bp的条带，则鉴定为云龙杂交斑；如待测样品电泳图谱显示出1条大小为215～225bp的条带，则鉴定为虎龙杂交斑；如待测样品电泳图谱显示出2条大小分别为255～265bp和175～185bp的条带，则鉴定为红龙杂交斑；当用内切酶BsrD I进行酶切时，如待测样品电泳图谱显示出1条大小为645～655bp的条带，则鉴定为赤点石斑鱼；如待测样品电泳图谱显示出1条大小为

435～455bp的条带，则鉴定为虎龙杂交斑；当用内切酶Hinf I进行酶切时，如待测样品电泳图谱显示出1条大小为645～655bp的条带，则鉴定为虎龙杂交斑；如待测样品电泳图谱显示出2条大小分别为295～305bp和345～355bp的条带，则鉴定为斜带石斑鱼。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：95～105ng模板DNA、45～55μL Premix Taq、3.5～4.5μL上游引物、3 .5～4  .5μL下游引物、去离子水补齐至100μL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，52～58℃退火30s，72℃延伸1min，共38个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

4.一种用于鉴别五种石斑鱼的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和权利要求1中酶切所用的内切酶；所述五种石斑鱼为云龙杂交斑、虎龙杂交斑、红龙杂交斑、赤点石斑鱼和斜带石斑鱼。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，判定待测样品的石斑鱼类型的方法为权利要求1所述的方法。

说明书

一种用于五种石斑鱼的分子鉴别引物、试剂盒及方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种用于五种石斑鱼的分子鉴别引物、试剂盒及方法。

背景技术

[0002] 鱼类线粒体基因组DNA包括：1个主要的非编码区(D‑loop)、1个轻链复制起始区(OL)、2个核糖体RNA基因(12rRNA和16S rRNA)、22个转运RNA基因(tRNA)以及13个蛋白质编码基因。石斑鱼(Epinephelus spp.)，是石斑鱼属(Epinephelus)的总称，属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinate)。在我国沿海记录的石斑鱼种类有40多种，其主要产自南海及东海南部，由于其肉质鲜美、营养丰富、抗逆性强、生长快，已越来越受到消费者和养殖者的青睐。近年来，杂交育种作为鱼类新品种改良的有效手段得到了普遍的应用。

[0003] 在石斑鱼属中，赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)和斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)在我国具有较高养殖规模和经济产量。而目前，在国内开展的杂交石斑鱼研究包括云纹石斑鱼(Epinehelus moara)(♀)×鞍带石斑鱼(Epinephelus Lanceolatus)(♂)的F1子代云龙杂交斑，棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)(♀)×鞍带石斑鱼(Epinephelus Lanceolatus)(♂)的F1子代虎龙杂交斑，赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)(♀)×鞍带石斑鱼(Epinephelus Lanceolatus)(♂)的F1子代红龙杂交斑等。由于赤点石斑鱼、斜带石斑鱼、云龙杂交斑、虎龙杂交斑和红龙杂交斑在形态学特征上有很多相似之处，尤其在鱼苗阶段，很难通过肉眼对其进行区分，这给苗种场的鱼苗筛选和管理带来很多不便。CN108588241A公开了一种鉴别棕点石斑鱼的分子特异性标记引物及方法，但是该引物仅适用于鉴别棕点石斑鱼，而不适用于棕点石斑鱼与其他石斑鱼的杂交F1子代、以及其他石斑鱼的分子鉴定。因此，研发一种能够同时快速、有效的鉴别多种石斑鱼的方法，对于水产养殖中的鱼种鉴定具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是克服现有上述现有技术的缺陷和不足，提供一种用于五种石斑鱼(云龙杂交斑、虎龙杂交斑、红龙杂交斑、赤点石斑鱼和斜带石斑鱼)的分子鉴别引物、试剂盒及方法。

[0005] 本发明的目的是提供一种用于五种石斑鱼的分子鉴别引物。

[0006] 本发明另一目的是提供所述引物在鉴别五种石斑鱼或制备用于鉴别五种石斑鱼的试剂盒中的应用。

[0007] 本发明另一目的是提供所述引物在制备用于鉴别五种石斑鱼的试剂盒中的应用。

[0008] 本发明又一目的是提供一种鉴别五种石斑鱼的方法。

[0009] 本发明再一目的是提供一种用于鉴别五种石斑鱼的试剂盒。

[0010] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0011] 本发明首先提供了一种用于五种石斑鱼的分子鉴别引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；所述五种石斑鱼为云龙杂交斑、虎龙杂交斑、红龙杂交斑、赤点石斑鱼或斜带石斑鱼中的任意一种或几种。

[0012] 上游引物(SEQ ID NO:1)：5，‑TCGCCTGTTTATCAAAAACATCGC‑3，；

[0013] 下游引物(SEQ ID NO:2)：5，‑TCCGGTCTGAACTCAGATCACGTA‑3，。

[0014] 所述引物在鉴别五种石斑鱼或制备用于鉴别五种石斑鱼的试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

[0015] 本发明还提供了一种鉴别五种石斑鱼的方法，以待测样品的基因组DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增，回收PCR扩增产物后酶切，将酶切产物电泳，根据电泳结果判定待测样品的石斑鱼类型。

[0016] 优选地，所述酶切所用的内切酶为内切酶MluC I、内切酶BsrD I或内切酶Hinf I中的任意一种或几种。

[0017] 优选地，所述根据电泳结果判定待测样品的石斑鱼类型的方法为：

[0018] 当用内切酶MluC I和BsrD I进行双酶切时，如待测样品电泳图谱显示出2条大小分别为215～225bp和175～185bp的条带，则鉴定为云龙杂交斑；如待测样品电泳图谱显示出1条大小为215～225bp的条带，则鉴定为虎龙杂交斑；如待测样品电泳图谱显示出2条大小分别为255～265bp和175～185bp的条带，则鉴定为红龙杂交斑；

[0019] 当用内切酶BsrD I进行酶切时，如待测样品电泳图谱显示出1条大小为645～655bp的条带，则鉴定为赤点石斑鱼；如待测样品电泳图谱显示出1条大小约为435～455bp的条带，则鉴定为虎龙杂交斑；

[0020] 当用内切酶Hinf I进行酶切时，如待测样品电泳图谱显示出1条大小为645～655bp的条带，则鉴定为虎龙杂交斑；如待测样品电泳图谱显示出2条大小分别为295～
305bp和345～355bp的条带，则鉴定为斜带石斑鱼。

[0021] 优选地，所述PCR扩增的体系为：95～105ng模板DNA、45～55μl Premix Taq、3.5～4.5μl上游引物、3.5～4.5μl下游引物、去离子水补齐至100μl。

[0022] 更优选地，所述PCR扩增的体系为：100ng模板DNA、50μl Premix Taq、4μl上游引物、4μl下游引物、去离子水补齐至100μl。

[0023] 优选地，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，52～58℃退火30s，72℃延伸1min，共38个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

[0024] 更优选地，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共38个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

[0025] 另外，本发明还提供了一种用于鉴别五种石斑鱼的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物。

[0026] 优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂。

[0027] 优选地，利用所述试剂盒判定待测样品的石斑鱼类型的方法为上述根据电泳结果判定待测样品的石斑鱼类型的方法。

[0028] 本发明具有以下有益效果：

[0029] 本发明首先提供了一种用于五种石斑鱼的分子鉴别引物，利用该引物能够快速、有效的鉴别云龙杂交斑、虎龙杂交斑、红龙杂交斑、赤点石斑鱼或斜带石斑鱼中的任意一种或几种，并基于该引物建立了一种鉴别五种石斑鱼的方法和试剂盒；本发明采用了线粒体基因组DNA条形码与限制性核酸内切酶技术相结合的方法对五种石斑鱼进行鉴别，其反应稳定、重复性好；与传统的形态学鉴定相比，该方法具有检测准确性高、客观性强的特点；与单纯的线粒体基因组DNA条形码测序鉴定方法相比，该方法具有直观性强、判断简易的特点；本发明提供的方法弥补了形态学鉴定与分子测序鉴定的不足，更加有利于石斑鱼苗种场的科学管理，对于水产养殖中的鱼种鉴定具有重要意义。

附图说明

[0030] 图1是云龙杂交斑、虎龙杂交斑和红龙杂交斑的PCR扩增产物电泳结果图；其中，1‑7为云龙杂交斑的7个样品；8‑14为虎龙杂交斑的7个样品；15‑21为红龙杂交斑的7个样品。

[0031] 图2是赤点石斑鱼和虎龙杂交斑的PCR扩增产物电泳结果图；其中，M为DNA分子量标记(从上至下分别为1000bp，750bp，500bp，400bp，300bp，200bp)；1‑10为赤点石斑鱼的10个样品；11‑20为虎龙杂交斑的10个样品。

[0032] 图3是虎龙杂交斑和斜带石斑鱼的PCR扩增产物电泳结果图；其中，M为DNA分子量标记(从上至下分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1‑10为的虎龙杂交斑的10个样品；11‑20为斜带石斑鱼的10个样品。

[0033] 图4是内切酶MluC I和BsrD I对回收产物进行双酶切的结果图；1‑7为云龙杂交斑的7个样品；8‑14为虎龙杂交斑的7个样品；15‑21为红龙杂交斑的7个样品。

[0034] 图5是内切酶BsrD I对回收产物进行酶切的结果图；其中，M为DNA分子量标记(从上至下分别为1000bp，750bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)；1‑10为赤点石斑鱼的10个样品；11‑20为虎龙杂交斑的10个样品。

[0035] 图6是内切酶Hinf I对回收产物进行酶切的结果图；其中，M为DNA分子量标记(从上至下分别为1000bp，750bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)；1‑10为虎龙杂交石斑鱼的10个样品；11‑20为斜带石斑鱼的10个样品。

具体实施方式

[0036] 以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0037] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0038] 实施例1一种用于五种石斑鱼的分子鉴别方法

[0039] 一种用于五种石斑鱼的分子鉴别方法，包括以下步骤：

[0040] (1)DNA提取

[0041] 采集待测石斑鱼样品的鳍条，利用DNA提取法提取其基因组DNA。

[0042] (2)PCR扩增

[0043] 利用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物、按照以下PCR反应体系和PCR反应程序对步骤(1)得到的待测石斑鱼样品的基因组DNA进行PCR扩增；

[0044] 上游引物(SEQ ID NO:1)：5，‑TCGCCTGTTTATCAAAAACATCGC‑3，；

[0045] 下游引物(SEQ ID NO:2)：5，‑TCCGGTCTGAACTCAGATCACGTA‑3，。

[0046] PCR反应体系为(混匀后短暂离心)：

[0047]

[0048] PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

[0049] (3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定

[0050] 将步骤(2)得到的PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，拍照记录电泳结果。

[0051] (4)回收

[0052] 将步骤(3)电泳出的DNA片段直接回收，并测定DNA浓度(ng/ul)。

[0053] (5)酶切

[0054] 1)内切酶MluC I和BsrD I对回收产物进行双酶切

[0055] 若步骤(3)的PCR扩增产物电泳结果在靠近Marker 750bp位置的下方大约650bp处显示出1条特异性DNA条带(图1)，则利用内切酶MluC I和BsrD I对回收产物进行双酶切，具体如下：

[0056] 利用内切酶MluC I进行第一次酶切，反应体系为：

[0057]

[0058] 反应程序为：37℃水浴5‑15min。

[0059] 再利用内切酶BsrD I进行第二次酶切：在第一次酶切产物中加入1ul内切酶BsrD I和5ul Buffer 2.1(10×)，65℃水浴5‑15min。

[0060] 2)内切酶BsrD I对回收产物进行酶切

[0061] 若步骤(3)的PCR扩增产物电泳结果在靠近Marker 750bp位置的下方大约650bp处显示出1条特异性DNA条带(图2)，则利用内切酶BsrD I对回收产物进行酶切，反应体系为：

[0062]

[0063] 反应程序为：65℃水浴5‑15min。

[0064] 3)内切酶Hinf I对回收产物进行酶切

[0065] 若步骤(3)的PCR扩增产物电泳结果在靠近Marker 750bp位置的下方大约650bp处显示出1条特异性DNA条带(图3)，则利用内切酶Hinf I对回收产物进行酶切，反应体系为：

[0066]

[0067] 反应程序为：37℃水浴5‑15min。

[0068] (6)酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定和结果判定

[0069] 将步骤(5)得到的酶切产物用2.5％的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，拍照记录电泳结果，根据电泳结果判定待测样品的石斑鱼类型。

[0070] 判定待测样品的石斑鱼类型的方法如下：

[0071] 根据内切酶MluC I和BsrD I对回收产物进行双酶切的结果(图4)，可以看出，如待测样品在靠近Marker 250bp位置的下方显示出2条大小相近的DNA条带，分别为大约220bp和180bp，则鉴定为云龙杂交斑；如待测样品在靠近Marker 250bp位置的下方大约220bp处显示出1条特异性DNA条带，则鉴定为虎龙杂交斑；如待测样品在靠近Marker 250bp的位置显示出2条大小不一的特异性DNA条带，分别为大约260bp和180bp，则鉴定为红龙杂交斑。

[0072] 根据内切酶BsrD I对回收产物进行酶切的结果(图5)，可以看出，如待测样品在靠近Marker 750bp位置的下方大约650bp处显示出1条特异性DNA条带，则鉴定为赤点石斑鱼；如待测样品在靠近Marker 500bp位置下方大约450bp处显示出1条特异性DNA条带，则鉴定为虎龙杂交斑。

[0073] 根据内切酶Hinf I对回收产物进行酶切的结果(图6)，可以看出，如待测样品在靠近Marker 750bp位置的下方大约650bp处显示出1条特异性DNA条带，则鉴定为虎龙杂交斑；如待测样品在靠近Marker 750bp位置的下方大约400bp处显出大小约为300bp和350bp的两条特异性的DNA条带，则鉴定为斜带石斑鱼。

[0074] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。