RFPL1S-201在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中的应用

摘要

本发明公开了RFPL1S‑201在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中的应用。RFPL1S‑201或促进RFPL1S‑201表达的物质在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中的应用。过表达RFPL1S‑201的表达质粒在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中的应用。本发明发现lncRNA RFPL1S‑201可以抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和转移等，同时lncRNA RFPL1S‑201可以在体抑制卵巢癌的肝转移。其作用机制主要是通过抑制IFN‑STAT1信号通路来发挥抑制肿瘤进展，促进肿瘤化疗敏感性的作用的。

权利要求

1.过表达RFPL1S‑201的表达质粒在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中的应用,所述的RFPL1S‑201在UCSC数据库中的编号为ENST00000419368.1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于过表达RFPL1S‑201的表达质粒在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或肝转移的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于过表达RFPL1S‑201的表达质粒为将LncRNA RFPL1S‑201全长连接pcDNA3.1(+)的NheI/NotI位点所得。

说明书

RFPL1S‑201在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中

的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及RFPL1S‑201在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中的应用。

背景技术

[0002] 卵巢癌是女性生殖系统常见的一种恶性肿瘤，可发生于任何年龄，因早期症状不典型、进展迅速、盆腔种植转移早，病死率一直高居妇科肿瘤之首，严重威胁女性生命[1]。
肿瘤细胞减灭术联合铂类为主的化疗是临床主要治疗方案，随着手术技能与化疗方案的改
进，卵巢癌患者的短期生存率明显增加，然而其远期复发率高，预后仍然较差。卵巢癌极高
的转移能力及极高的耐药能力是患者死亡最主要的原因之一[2]。因此，深入探索卵巢癌进
展与耐药机制仍然是目前卵巢癌研究的重中之重。

[0003] 随着ENCODE计划的不断深入，RNA组学的发展为各种疾病的防治提供了新的切入点。其中长链非编码RNA(lncRNAs)是由200多个核苷酸组成的RNA转录本[3]。虽然没有蛋白
编码潜力，但lncRNAs已经被证明在广泛的生物过程中发挥作用[4]。据报道某些lncRNAs，
如ROR、SHNG15、PRLB等可以调控肿瘤的进展与转移，可以作为卵巢癌的潜在治疗靶标[5‑
7]。

[0004] 我们课题组研究发现lncRNA RFPL1S‑201可以抑制卵巢癌的增殖、侵袭和转移，并促进药物诱导的卵巢癌细胞的凋亡，WB、ELISA及高通量测序发现RFPL1S‑201过表达的卵巢
癌细胞中IFN‑STAT1通路显著下降。阅读文献发现STAT 1可以促进抗肿瘤免疫，提高癌细胞
对化疗和放疗的敏感性[8,9]。脑瘤细胞中STAT1和NF‑κB的激活显著促进癌细胞的生长和
耐药[10]。I型干扰素(IFN)反应可以激活JAK‑STAT1信号通路，促进癌细胞的干细胞、耐药
和耐辐射[11]。STAT 1过表达可抑制胶质母细胞瘤的血管生成，STAT1的高表达提示胶质母
细胞瘤预后差[12]。STAT 1/ATF 4可促进肝细胞癌和口腔鳞状细胞癌的进展[13]。这些结
果提示lncRNA RFPL1S‑201可能通过抑制IFN‑STAT1通路抑制卵巢癌的增殖、侵袭和/或转
移。

[0005] 参考文献：

[0006] [1]Rebecca L,Siegel KDM,Ahmedin Jemal,DVM.Cancer Statistics.CA CANCER J CLIN2019；69:7‑34.

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[0012] [7]Qu C,Dai C,Guo Y,et al.Long noncoding RNA SNHG15 serves as an oncogene and predicts poor prognosis in epithelial ovarian cancer.OncoTargets 
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[0013] [8]Huang S,Bucana C D,Van Arsdall M,et al.Stat1 negatively regulates angiogenesis,tumorigenicity and metastasis of tumor cells[J].Oncogene,2002,21
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[0014] [9]Legrier M E,Bieche I,Gaston J,et al.Activation of IFN/STAT1 signalling predicts response to chemotherapy in oestrogen receptor‑negative 
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[0015] [10]Chen Q,Boire A,Jin X,et al.Carcinoma‑astrocyte gap junctions promote brain metastasis by cGAMP transfer[J].Nature,2016,533(7604):493‑498.

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[0017] [12]Duarte C W,Willey C D,Zhi D,et al.Expression signature of IFN/STAT1 signaling genes predicts poor survival outcome in glioblastoma 
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[0018] [13]Wu T S,Tan C T,Chang C  C,et al.B‑cell lymphoma/leukemia 10promotes oral cancer progression through STAT1/ATF4/S100P signaling pathway
[J].Oncogene,2015,34(10):1207‑1219.

发明内容

[0019] 本发明的目的是提供RFPL1S‑201在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中的应用。

[0020] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：

[0021] RFPL1S‑201(ENST00000419368.1,序列信息可登录以下网址获取http://genome.ucsc.edu/cgi‑bin/hgc？hgsid＝1039674013_7giPv9sGY2VkFaM2O5zAAPS6yleu&g
＝htcGeneMrna&i＝ENST00000419368.1&c＝chr22&l＝29867929&r＝29874059&o＝
wgEncodeGencodeBasicV36lift37&table＝wgEncodeGencodeBasicV36lift37)作为治疗靶
点在制备或筛选抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中的应用。

[0022] RFPL1S‑201或促进RFPL1S‑201表达的物质在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中的应用。

[0023] 作为本发明的一种优选，RFPL1S‑201或促进RFPL1S‑201表达的物质在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或肝转移的药物中的应用。

[0024] 过表达RFPL1S‑201的表达质粒在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中的应用。

[0025] 作为本发明的一种优选，过表达RFPL1S‑201的表达质粒在制备抑制卵巢癌增殖、侵袭和/或肝转移的药物中的应用。

[0026] 作为本发明的一种优选，过表达RFPL1S‑201的表达质粒为将LncRNA RFPL1S‑201全长连接pcDNA3.1(+)的NheI/NotI位点所得。

[0027] 有益效果：

[0028] 本发明发现lncRNA RFPL1S‑201在卵巢癌组织及卵巢癌细胞中低表达，在正常卵巢上皮及正常卵巢上皮细胞中表达较高(图1)。lncRNA RFPL1S‑201过表达，可以抑制卵巢
癌细胞的增殖、侵袭和转移等(图2‑3)；过表达RFPL1S‑201还可以显著促进PTX及凋亡诱导
剂等药物诱导的细胞凋亡，且具有剂量依赖性还可以并不影响卵巢癌细胞本身的凋亡(图
4)。同时lncRNA RFPL1S‑201可以在体抑制卵巢癌的肝转移，增加小鼠的生存期(图5)。其作
用机制主要是通过抑制IFN‑STAT1信号通路来发挥抑制肿瘤进展，促进肿瘤化疗敏感性的
作用的。因此，RFPL1S‑201、促进其表达的物质或过表达RFPL1S‑201的表达载体可在制备抑
制卵巢癌增殖、侵袭和/或转移的药物中应用。

附图说明

[0029] 图1RFPL1S‑201在卵巢癌组织及大部分卵巢癌细胞系中均显著下调(A)：qRT‑PCR检测RFPL1S‑201在卵巢癌组织及正常卵巢上皮组织中的表达情况；(B)：qRT‑PCR检测
RFPL1S‑201在卵巢癌细胞株及正常卵巢上皮细胞株中的表达情况。

[0030] 图2RFPL1S‑201过表达抑制促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭和转移(A)：RFPL1S‑201过表达组与对照组A2780细胞0h、24h、48h、72h时OD450生长值；(B)：RFPL1S‑201过表达组与
对照组SKOV3细胞0h、24h、48h、72h时OD450生长值；(实验结果为三次独立实验数据±SD)；
(C)：A2780细胞侵袭及迁移实验中，Transwell小室下层细胞结晶紫染色后倒置显微镜下
(×200)图像；(D)：A2780细胞Transwell小室下层细胞蛋白定量结果，左纵轴为侵袭结果，
右纵轴为迁移结果；(E)：SKOV3细胞侵袭及迁移实验中，Transwell小室下层细胞结晶紫染
色后倒置显微镜下(×200)图像；(F)：SKOV3细胞Transwell小室下层细胞蛋白定量结果，左
纵轴为侵袭结果，右纵轴为迁移结果(实验结果为三次独立实验数据±SD，*表示p<0.05，**
表示p<0.01，***表示p＜0.001)。

[0031] 图3敲降RFPL1S‑201可以抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和转移(A)：RFPL1S‑201过表达组与对照组A2780细胞0h、24h、48h、72h时OD450生长值；(B)：RFPL1S‑201过表达组与对
照组SKOV3细胞0h、24h、48h、72h时OD450生长值；(实验结果为三次独立实验数据±SD)；(C)：
SKOV3细胞侵袭及迁移实验中，Transwell小室下层细胞结晶紫染色后倒置显微镜下(×
200)图像；(D)：SKOV3细胞Transwell小室下层细胞蛋白定量结果，左纵轴为侵袭结果，右纵
轴为迁移结果。(实验结果为三次独立实验数据±SD，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示
p＜0.001)。

[0032] 图4RFPL1S‑201过表达可以促进药物诱导的卵巢癌细胞的凋亡(A)：qRT‑PCR检测A2780细胞RFPL1S‑201过表达效率；(B)：qRT‑PCR检测SKOV3细胞RFPL1S‑201过表达效率；
(C)：流式细胞术检测RFPL1S‑201过表达及对照组A2780细胞在0、64、256nmol PTX处理48h
后早凋+晚凋比率；(D)：流式细胞术检测RFPL1S‑201过表达及对照组SKOV3细胞在0、128、
512nmol PTX处理48h后早凋+晚凋比率；(E)：流式细胞术检测RFPL1S‑201过表达及对照组
A2780细胞在细胞凋亡诱导剂(浓度1:1000)作用12h后早凋+晚凋比率；(F)：流式细胞术检
测RFPL1S‑201过表达及对照组SKOV3细胞在细胞凋亡诱导剂(浓度1:1000)作用12h后早凋+
晚凋比率；(实验结果为三次独立实验数据±SD，*表示p<0.05，**表示p<0.01,***表示p<
0.001)。

[0033] 图5RFPL1S‑201可以在体抑制卵巢癌细胞的增殖和转移

[0034] (A)：对照组及RFPL1S‑201过表达组裸鼠肝脏大体图像；(B)：对照组及RFPL1S‑201过表达组裸鼠肝脏组织切片H&E染色显微镜镜下(100X)图像；对照组最后仅有3只小鼠存
活，所有肝脏均发生多处肝实质组织的转移；过表达组中共存活8只小鼠，其中2只小鼠仅发
现肝门静脉转移，未见肝实质转移，3只小鼠仅发现了1处肝实质转移，只有3只小鼠发生了
类似于对照组的多处肝实质转移。(C)：对照组及RFPL1S‑201过表达组裸鼠肺部组织切片H&
E染色显微镜镜下(100X)图像，两组均未见明显肺转移；(D)：注射慢病毒稳转RFPL1S‑201过
表达及对照SKOV3细胞后的裸鼠生存曲线，RFPL1S‑201过表达组小鼠生存时间延长，差异有
统计学意义(p＝0.0489)。

[0035] 图6IFNβ‑STAT1信号通路在RFPL1S‑201过表达的卵巢癌细胞株中显著下降

[0036] (A)：在转染RFPL1S‑201过表达质粒和对照质粒pcDNA3.1的SKOV3细胞中差异表达基因火山图；(B)：KEGG Pathway分析转染RFPL1S‑201过表达质粒和对照质粒pcDNA3.1的
SKOV3细胞中差异基因富集气泡图。(C)：在转染RFPL1S‑201过表达质粒和对照质粒
pcDNA3.1的SKOV3细胞中ISGs相关基因表达差异热图。(D)：qRT‑PCR验证RFPL1S‑201过表达
与对照细胞中差异表达的ISGs相关基因。(E):Western blot实验验证RFPL1S‑201过表达与
对照细胞中差异表达的ISGs相关基因表达。(F)：Western blot实验验证RFPL1S‑201过表达
与对照细胞中STAT家族蛋白表达。(G)：ELISA实验分析RFPL1S‑201过表达及对照的A2780细
胞及SKOV3细胞培养上清中IFNβ的表达。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p＜0.001

具体实施方式

[0037] 材料与方法实验材料：人卵巢上皮癌细胞系A2780购自南京凯基生物公司。人卵巢上皮癌细胞系SKOV3购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库， RT 
Master试剂盒购自Thermo Fisher公司、Trizol购自Thermo Fisher公司、CCK8试剂盒购自
江苏凯基生物技术股份有限公司、抽提质粒试剂盒为OMEGA质粒中提试剂盒、siRNA干扰试
剂盒订购自Thermo Fisher公司、紫杉醇由百时美施贵宝(上海)贸易有限公司提供的
Corden Pharma Latina S.P.A公司生产的紫杉醇、顺铂购自齐鲁制药有限公司、Lipo2000
购自Thermo Fisher公司、DMEM培养基购自凯基生物，胎牛血清购自Thermo Fisher公司。

[0038] 实施例1

[0039] 1、细胞株

[0040] 卵巢癌细胞株SKOV3购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；正常卵巢上皮细胞株IOSE386，卵巢癌细胞株A2780、HO‑8910、HO‑8910PM、OVCAR3、OVCAR8购于凯基生
物。细胞培养条件如下：

[0041] 培养液：SKOV3：McCoy’s 5A不完全培养液(1×)+10％胎牛血清(FBS)

[0042] A2780：DMEM不完全高糖培养液(1×)+10％胎牛血清(FBS)

[0043] 消化液：0.25％Trypsin‑EDTA(1×)

[0044] 冻存液：胎牛血清(FBS)：二甲亚砜(DMSO)：＝9：1

[0045] 2、临床标本

[0046] 本研究标本来自于2016年至2017年在南京市妇幼保健院手术患者，共采集13例正常卵巢组织标本(来自宫颈癌、子宫内膜癌预防性切除卵巢)和13例上皮性卵巢癌组织标
本。正常卵巢组织和卵巢癌组织年龄匹配(44±16比42±22)。所有切除组织均经组织病理
学检查证实，所有样品均被快速冷冻在液氮中，并在使用前保存在‑80℃。这项研究由南京
市妇幼保健院伦理委员会批准，并获得每位病人的知情同意。

[0047] 3、总RNA提取

[0048] 用Thermo试剂盒(K0731)RNA提取试剂盒提取总RNA,用Thermo(K1622)逆转录试剂盒反转录,cDNA置于‑70℃保存备用。

[0049] 5、荧光定量PCR

[0050] 引物由金斯瑞生物技术有限公司合成，序列如下：RFPL1S‑201‑F：CATTTGCCAAGCACAGAACCA(SEQ ID NO.1)，RFPL1S‑201‑R：TCCCCTCAGCTCATGGTCTA(SEQ ID 
NO.2)，β‑ACTIN‑F：AGCGAGCATCCCCCAAAGTT(SEQ  ID  NO.3)，β‑ACTIN‑R：
GGGCACGAAGGCTCATCATT(SEQ ID NO.4)。

[0051] 1)引物稀释浓度为10μM,按如下比例配制反应体系：

[0052]

[0053]

[0054] 1)反应条件：50℃2min；95℃预变性10min；95℃变性15s；60℃退火60s；95℃延伸‑△ct
15s。反应为40个循环。实时定量PCR结果采用2 理论进行分析。

[0055] 结果见图1；由图可见:较之正常卵巢上皮,RFPL1S‑201在卵巢癌组织及大部分卵巢癌细胞系中均显著下降。

[0056] 实施例2

[0057] 1.RFPL1S‑201干扰RNA与过表达质粒的构建：

[0058] RFPL1S‑201的干扰RNA序列及对照的干扰RNA序列均由美国Thermo Fisher公司设计与合成。

[0059] RFPL1S‑201过表达质粒pc‑RFPL1S‑201由上海捷瑞生物工程有限公司在pcDNA3.1(+)的基础上构建与合成，克隆位点为：NheI/NotI，将LncRNA  RFPL1S‑201
(ENST00000419368.1)全长连接到pcDNA3.1载体的巨细胞病毒(CMV)启动子后。用OMEGA试
剂盒(D6915‑03)质粒，测定提取质粒浓度，检测序列连接成功，直接用于后续实验或‑80℃
保存。

[0060] 2.细胞转染

[0061] 1)待6孔板中培养的SKOV3及A2780细胞融合度达到90％‑95％，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒推荐比例分别将RFPL1S‑201过表达质粒、对照pcDNA3.1质
粒、RFPL1S‑201‑siRNA,对照siRNA与细胞共培养；

[0062] 2)转染前2h将6孔板中培养液除去，加入2ml新鲜培养基；

[0063] 3)将RFPL1S‑201过表达与对照质粒和脂质体Lipofectamine 2000分别加入250μlOPTI‑MEM培养基稀释，轻轻吹打避免出现气泡(至少100次)混匀，室温静置5min；

[0064] 4)将质粒稀释液垂直悬空滴入脂质体Lipofectamine 2000稀释液，利用液滴重力使脂质体包裹质粒，后轻轻吹打(约100次)混匀，37℃静置5‑20min；

[0065] 5)将6孔板中培养基除去，加入1.5ml OPTI‑MEM培养基；

[0066] 6)将Lipofectamine 2000和质粒混匀的OPTI‑MEM培养基加入6孔板中，每孔0.5ml，四方晃动六孔板混匀液体，置于培养箱中；

[0067] 7)转染6h后，更换培养基为有血清无双抗的细胞对应培养基，转染18‑48小时后，收集细胞进行验证或后续实验。

[0068] 实施例3细胞增殖实验

[0069] 1)瞬时转染细胞24h后计数细胞，用含10％FBS培养基稀释至所需浓度后将细胞悬液加入96孔板中,每孔100μ悬液中约含1000个细胞，共分为0h、24h、48h、72h四组，每组5‑6
个副孔，置于37℃，5％CO2培养箱中3‑4h等待细胞贴壁；

[0070] 2)细胞贴壁后按照分组时间测量细胞活性：将培养基更换为加入10％CCK‑8试剂的混合溶液，37℃，5％CO2培养箱中反应1h后上酶标仪检测，检测波长：450nm。

[0071] 结果见图2A‑B和图3A‑B；由图可见:过表达RFPL1S‑201可以显著抑制卵巢癌细胞的增殖，而敲降RFPL1S‑201可以显著促进卵巢癌细胞的增殖。

[0072] 实施例4细胞迁移、侵袭实验

[0073] 1)侵袭实验特有步骤：

[0074] A、分装Matrigel基质胶：基质胶冰上融化后，冰上分装进1.5ml EP管中，每管60μl，避免反复冻融；

[0075] B、铺胶：与无血清培养基按1：5(v/v)配制，铺于Transwell小室上表面，60μl/孔，37℃培养箱中烘干；迁移实验无A、B步骤；

[0076] 2)在Transwell小室上表面中加入200ul细胞悬液，内含5×104个细胞，向小室所在24孔板中加入600‑800μl含20％FBS的完全培养基，置入37℃，5％CO2培养箱中；

[0077] 3)培养箱中放置24h后收取迁移实验小室，48h后收取侵袭实验小室；

[0078] 4)将Transwell小室置于4％多聚甲醛中固定细胞20min；

[0079] 5)将小室转移至0.1％结晶紫染液中染色15min；

[0080] 6)ddH2O中洗涤Transwell小室2次，用棉拭子将Transwell小室上表面残余Matrigel基质胶及染料轻轻擦拭掉；

[0081] 7)在倒置显微镜下(200×)每孔随机挑选3个区域拍照；

[0082] 8)加入200μl细胞裂解液将Transwell小室下表面膜上细胞裂解，后在562nm波长处检测光吸收值。

[0083] 结果见图2C‑F和图3C‑F；由图可见:过表达RFPL1S‑201可以显著抑制卵巢癌细胞的侵袭和迁移，而敲降RFPL1S‑201可以显著促进卵巢癌细胞的侵袭和迁移。

[0084] 实施例5细胞凋亡实验

[0085] 细胞凋亡实验采用BD公司的细胞凋亡试剂盒，并按照试剂盒说明书进行，具体实验方法如下：

[0086] 1)诱导细胞凋亡：

[0087] A、细胞凋亡阳性对照试剂诱导细胞凋亡：瞬时转染细胞24h后，按照试剂盒说明书加入试剂盒中提供的细胞凋亡阳性对照试剂A+B诱导细胞凋亡；

[0088] B、PTX诱导细胞凋亡：瞬时转染24h后，向细胞中加入3种浓度紫杉醇PTX(A2780：0nmol、64nmol、256nmol；SKOV3：0nmol、128nmol、512nmol)；

[0089] 2)加入PTX 48h或加入加入试剂盒中提供的细胞凋亡阳性对照试剂A+B诱导细胞凋亡24h后，收集培养皿中所有培养基及清洗两次的PBS溶液至50ml离心管中，用不含EDTA
溶液的胰蛋白酶消化液消化细胞3‑5min，加入三倍体积含血清培养基终止消化后将液体转
移至50ml离心管中，4℃3000rpm，5min，去上清；

[0090] 3)加入预冷处理的PBS 4ml，轻柔吹打细胞悬液后转移至15ml离心管中，4℃3000rpm，5min，去上清；

[0091] 4)重复2)中步骤一次；

[0092] 5)将10×Annexin V Binding Buffer用双蒸水配制成1×后，用100μl 1×Annexin V Binding Buffer加入1×106个细胞制成细胞悬液后转移至1.5ml EP管中；

[0093] 6)向细胞悬液中分别加入5μl Annexin V‑PE和5μl 7‑AAD；

[0094] 7)轻柔震荡细胞悬液，室温避光反应15分钟；

[0095] 8)每管细胞悬液中加入400μl 1×Binding Buffer后混匀，1h内上机检测。

[0096] 结果见图4，由结果可见过表达RFPL1S‑201可以显著促进PTX及凋亡诱导剂等药物诱导的细胞凋亡，且具有剂量依赖性。

[0097] 实施例6动物实验

[0098] 4‑6周龄的BABL/c雌性裸鼠购自南京大学模式动物研究所。

[0099] 1)首先将裸鼠用剪脚趾与外耳廓的方法标记顺序；

[0100] 2)裸鼠称重后，按体重均匀分为2组，每组7只；

[0101] 3)培养慢病毒稳定转染RFPL1S‑201过表达与对照的SKOV3细胞株，消化离心后制7 6
成1×10 /ml细胞悬液,并将细胞悬液按分组打入裸鼠尾静脉中，每只200μl，约2×10个细
胞；

[0102] 4)35天后，将裸鼠断颈处理后，取出肺部及肝脏组织留待做H&E染色及免疫组化；

[0103] 5)苏木精伊红染色试验步骤：

[0104] A、石蜡切片脱蜡至水：将切片放入二甲苯Ⅰ20min后，二甲苯Ⅱ中浸泡20min，后在无水乙醇Ⅰ中浸泡5min，接着无水乙醇Ⅱ5min，最后加入75％酒精浸泡5min，清水洗净；

[0105] B、苏木素染色：将切片放入苏木素染色3‑5min，后用盐酸水溶液分化，氨水水溶液返蓝后，清水洗净；

[0106] C、伊红染色：将切片依次放入85％、95％的梯度酒精脱水，后加入伊红染液中染色5min；

[0107] D、脱水封片：将切片放入无水乙醇I中5min后再加入无水乙醇II 5min，继而加入无水乙醇Ⅲ5min，后在二甲苯Ⅰ中浸泡5min，二甲苯Ⅱ5min使其透明，最后用中性树胶封片。

[0108] E、显微镜下镜检，采集图像分析结果。

[0109] 结果见图5，由图可见，过表达RFPL1S‑201可以显著抑制卵巢癌细胞的肝转移,延长小鼠的生存率。

[0110] 实施例7

[0111] 取瞬时转染对照组质粒PCDNA3.1与LncRNA RFPL1S‑201质粒后48h的SKOV3细胞上清液各10ml置于Millipore超滤离心管中，4000g*10min 4℃，取上层液体(约1mL)为标本。

[0112] 1)按照Human IFN‑βELISA Kit(FMS‑ELH201)说明书准备试剂和样品；

[0113] 2)分别将标本和不同浓度标准品100ul加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育90min；

[0114] 3)甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350ul，静置30min后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干

[0115] 4)加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60分钟

[0116] 5)洗板4次。

[0117] 6)加入酶结合物工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育30分钟

[0118] 7)洗板4次。

[0119] 8)加入显色剂100μl/孔，避光，37℃孵箱孵育10‑20分钟。

[0120] 9)加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(5分钟内)。

[0121] 结果见图6G，由图可见，过表达RFPL1S‑201可以显著抑制IFN‑β的分泌。