一种抗肿瘤的多肽组合物及其制备方法和用途转让专利
申请号 : CN202010522900.8
文献号 : CN111621440B
文献日 : 2021-11-05
发明人 : 郑兰红 , 徐一新 , 王震
申请人 : 上海健康医学院
摘要 :
权利要求 :
1.一种抗肿瘤多肽组合物的制备方法,所述多肽组合物系从保藏号为CGMCC NO.
18765的短杆菌(Brevibacterium sp.)MTL5‑77菌株的胞内代谢产物分离获得,所述多肽组合物所含多肽的分子量为616 1299 Da,所述制备方法包括如下步骤:~
(1)发酵培养
将短杆菌Brevibacterium sp. MTL5‑77的菌株接种于20 40 mL的培养基,于10 20℃、~ ~
150 220 r/min的恒温振荡培养箱里培养18 28 h,得种子发酵液;
~ ~
将种子发酵液按照4 10%的接种量接种到40 100 mL培养基中,于相同条件下继续培养~ ~
20 28h,得扩增发酵液;
~
将扩增发酵液按照4 10%的接种量接种到400 600 mL培养基中,于相同条件下继续培~ ~
养 36 72h,得发酵菌液;
~
所述培养基为:3 8 g 蛋白胨,0.5 1.5 g 酵母粉,0.005 0.015 g 磷酸铁,海水定容~ ~ ~
至 1 L,在1.05 kg/cm2,115 121 ℃,15 30 min的条件下灭菌;
~ ~
(2)离心收集菌体
收集上述菌株MTL5‑77的发酵菌液,在8000 10000 r/min,4 10 ℃,15 30 min条件下~ ~ ~
离心,收集菌体;
(3)乙醇浸提
按10 30 mM,pH 7.0 9.5 的Tris‑HCl缓冲液:菌体=1:1 1:3 v/v 的比例将Tris‑HCl~ ~ ~
缓冲液加入菌体中,搅拌均匀,使菌体重新溶解,后经终浓度65 80%的乙醇,浸提菌体3 8 ~ ~
h,以提取活性粗提物;过滤菌体,收集液体后,于35 50 ℃、80 120 rpm、44 mbar旋蒸至干~ ~
燥,室温放置,挥发乙醇,得到菌株MTL5‑77的乙醇浸提物;
(4)DEAE阴离子交换色谱分离纯化乙醇浸提物按乙醇浸提物: 10 30 mM,pH 7.0‑9.5的Tris‑HCl缓冲液=3:1 1:1 mg/mL 的比例将~ ~
乙醇浸提物加入Tris‑HCl缓冲液中,在8,000 12,000 rpm、3 8 ℃条件下,离心15 30 min,~ ~ ~
收集上清液,过0.22 μm滤膜,用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物,得活性组分A;
(5)RP‑HPLC高效液相色谱分离纯化活性组分A按活性组分A:水=3:1 1:1 mg/mL 的比例将活性组分A加入水中,在8,000 12,000 ~ ~
rpm、3 8 ℃条件下,离心15 30 min,收集上清液,过0.22 μm滤膜,利用高效液相色谱仪进~ ~
一步纯化,得活性组分B;
(6)XBP C18柱的二次纯化活性组分B按照步骤(5)的方法将活性组分B再次过XBP C18柱,进行分离纯化,收集峰型保留时间为5.090 min的流动相组分,得活性组分C;
(7)真空冷冻干燥
将活性组分C真空冷冻干燥,得抗肿瘤多肽组合物BMTP;
所述步骤(4)中用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物的色谱条件为:色谱柱为DEAE 阴离子交换色谱柱;流速:1.5 10 mL/min;进样体积:1.5 10 mL;紫外检测波长:254 nm;进样缓冲~ ~
液:10 30 mM,pH 7.0 9.5 的Tris‑HCl缓冲液;洗脱缓冲液:将NaCl加入进样缓冲液中,使~ ~
NaCl的终浓度为1M;
用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物的分离方法为:AKTA快速蛋白纯化仪用进样缓冲液冲洗,并平衡DEAE阴离子交换色谱柱;设置流速为1.5 10mL/min,平衡基线;取1.5 10mL过滤~ ~
0.22 μm滤膜的乙醇浸提物加入到AKTA快速蛋白纯化仪;用进样缓冲液冲洗未能挂柱的组分,再用20 40%的洗脱缓冲液,洗脱挂柱的组分,直接收集如附图3所示的DEAE阴离子交换~
层析图谱中洗脱峰b对应的组分,得活性组分A;
所述步骤(5)中RP‑HPLC色谱法的色谱条件为:色谱柱:XBP C18;温度:4 25 ℃;流速:~
0.4 0.8 mL/min;进样量:5 50 μL;紫外检测波长:254 nm;流动相Ⅰ:乙腈;流动相Ⅱ:纯净~ ~
水;
RP‑HPLC色谱法的分离纯化方法为:对高效液相色谱仪进行清洗、脱气,洗净XBP C18柱;首先用10%的流动相Ⅰ和90%的流动相Ⅱ冲洗,平衡基线;进样体积20 μL,流速为0.5 mL/min,紫外检测波长λ=254 nm,进行梯度洗脱,收集紫外吸收峰对应的流动相组分;再经过XBP C18柱分离纯化后,收集峰型保留时间为5.010 min的流动相组分,得活性组分B;
所述RP‑HPLC色谱流动相梯度洗脱的程序为:。
2.一种用如权利要求1所述的方法制备获得的抗肿瘤多肽组合物。
3.如权利要求2所述的抗肿瘤多肽组合物在制备预防或者治疗肿瘤的药物中的用途,所述肿瘤选自非小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌或宫颈癌。
4.一种抗肿瘤的药物,其特征在于,所述药物包含如权利要求2所述的抗肿瘤多肽组合物。
说明书 :
一种抗肿瘤的多肽组合物及其制备方法和用途
技术领域
背景技术
坏器官的结构和功能,进而发生转移,所以对机体的影响较为严重。目前,癌症在中国的发
病率占到世界的22%,发病人数全球第一;由于癌症在中国造成的死亡率占到世界的27%,
位居第29位。观察全球抗肿瘤药物研发现状,发现市场增速呈现放缓趋势,新兴国家市场中
上市15 年以上的老药仍是主力军,新上市的药物价格呈现越来越昂贵的趋势,因此抗肿瘤
药物的研发仍具有巨大的市场潜力,应不断投入各方面资源,治疗肿瘤疾病。
谢产物,寻找蕴藏其中的抗肿瘤药物,不断促进海洋活性物的开发和利用,就具有了重大的
研究价值与研究意义。
发明内容
内代谢产物分离获得,所述多肽组合物所含多肽的分子量为616~1299Da,所述制备方法包
括如下步骤:
3~8h,以提取活性粗提物;过滤菌体,收集液体后,于35~50℃、80~120rpm、44mbar旋蒸至
干燥,室温放置,挥发乙醇,得到菌株MTL5‑77的乙醇浸提物;
30min,收集上清液,过0.22μm滤膜,用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物,得活性组分A;
进一步纯化,得活性组分B;
254nm;进样缓冲液:10~30mM,pH 7.0~9.5Tris‑HCl缓冲液;洗脱缓冲液:将NaCl 加入进
样缓冲液中,使NaCl的终浓度为1M;
0.22μm滤膜的乙醇浸提物加入到AKTA快速蛋白纯化仪;用进样缓冲液冲洗未能挂柱的组
分,再用20~40%的洗脱缓冲液,洗脱挂柱的组分,直接收集DEAE阴离子交换层析图谱中的
洗脱峰b对应的组分,得活性组分A。
腈;流动相Ⅱ:纯净水;
0.5 mL/min,紫外检测波长λ=254nm,进行梯度洗脱,收集紫外吸收峰对应的流动相组分;
再经过XBP C18柱分离纯化后,收集峰型保留时间为5.010min的流动相组分,得活性组分B。
附图说明
具体实施方式
77)。该菌株已于2019年10月30日存活保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物
中心,北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏号为CGMCC NO.18765。
定结果显示菌体染色为蓝紫色,因此为革兰氏阳性菌(图1)。菌株MTL5‑77经生理生化鉴定
显示,其具有一定的耐盐性,仅可以利用葡萄糖,对其他糖醇则无法利用,具有尿素酶、鸟氨
酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶活性。
长度为1454bp,见SEQ ID No.1。
名为短杆菌Brevibacterium sp.MTL5‑77,为一种新型的菌株。
2
0.015g、海水定容至1L,将培养基在1.05kg/cm、115~121℃、15~30min的条件下灭菌。
3~8h,以提取活性粗提物;过滤菌体,收集液体后,于35~50℃、80~120rpm、44mbar旋蒸至
干燥,室温放置,挥发乙醇,得到菌株MTL5‑77的乙醇浸提物。
30min,收集上清液,过0.22μm滤膜,用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物;
缓冲液:将NaCl加入进样缓冲液中,使NaCl的终浓度为1M。
AKTA 快速蛋白纯化仪;用进样缓冲液冲洗未能挂柱的组分,再用20~40%的洗脱缓冲液,
洗脱挂柱的组分,直接收集DEAE阴离子交换层析图谱(图3)中的洗脱峰b对应的组分,得活
性组分A;
(HPLC) 进一步纯化。
流动相Ⅰ和90%的流动相Ⅱ冲洗,平衡基线。进样体积20μL,流速为0.5mL/min,紫外检测波
长λ=254nm,进行梯度洗脱,收集紫外吸收峰对应的流动相组分。
Product)。
质量扫描范围为500‑3600Da,获得一级图谱(图6)。
下:①取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549,弃培养液,再用3‑4mL的PBS 清洗。加入
800μL胰酶消化液消化40‑60s,吸出胰酶,放在含5%CO2的37℃恒温细胞培养箱中孵育60‑
80s,显微镜下观察,发现80%左右的细胞变圆皱缩就停止反应;②消化后的细胞加入适量
RPMI‑1640细胞培养液,用无菌吸管吹打成单细胞悬液。用细胞计数器测定悬液细胞数,取
3
适量细胞悬液到新鲜18mL RPMI‑1640细胞培养液中,使新的细胞悬液浓度为3‑4×10个/
mL;③将细胞悬液加到96孔板中,每孔加180μL,在恒温培养箱中培养16‑20 h;④每孔加入
样品20μL,样品在加入前用0.22μm的无菌滤膜过滤,每组设置3个平行孔;⑤然后继续在恒
温培养箱中培养48h,每个样品孔中加20μL MTT(5mg/mL,即0.5% MTT),置于恒温培养箱中
继续培养4h;⑥终止培养反应,去除孔内液体,用RPMI‑1640 培养基清洗2遍,每孔加入150μ
L DMSO,多功能酶标仪振荡10min,使结晶物甲瓒充分溶解;⑦酶标仪测定OD 570nm下的吸
光值,用下面公式计算细胞抑制率:细胞抑制率(%) =((OD对照组‑OD实验组)/OD对照组)
×100%。抑制率达到50%时的药物浓度为IC50值,实验重复3次结果以均值±SD表示。
同细胞的96孔板中,每个浓度做3组重复,MTT法测定BMTP对不同肿瘤细胞的活性抑制。利用
MTT法,测定BMTP处理不同肿瘤细胞48h后,对肿瘤细胞的半致死抑制率。
好的抑制肿瘤细胞增殖的效果,IC50分别为2.9798μg/mL,3.4656μg/mL,2.8642μg/mL,
4.1040μg/mL,4.3324μg/mL和5.6793μg/mL。BMTP在体外对实验肿瘤细胞具有较好的抑制活
性,IC50值的范围为2μg/mL
熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用
于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
作台,粉碎后重溶于样品海水,适度摇动,形成菌液。在常压条件下,取适量菌液涂布于
2216E 海水分离培养基,置于25℃、静置培养。待单菌落直径约1mm时,再挑取不同单菌落涂
布纯化培养。将纯化后的细菌接种于对应液体培养基,适当振荡培养,待对数生长期保存到
含 25%的无菌甘油管中,‑80℃储藏。
滴加鲁哥氏碘液没过菌斑面,媒染60s,一次水洗净碘液;③倾斜载玻片,95%乙醇脱色25 s
至无色,一次水洗净;④滴加番红复染菌斑5min,用一次水洗净番红染色液,涂片自然晾干
后,光学显微镜观察,用油镜进行观察、拍照。菌株MTL5‑77的革兰氏染色鉴定结果显示,菌
体染色为蓝紫色,因此为革兰氏阳性菌(图1)。
菌株MTL5‑77具有一定的耐盐性,仅可以利用葡萄糖,对其他糖醇则无法利用,具有尿素酶、
鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶活性。
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最终溶菌酶浓度为20mg/mL。通过离心收集2×10革兰氏阳性细胞,用180μL包含溶菌酶的
缓冲液重悬细胞,涡旋振荡,37℃培养30min。加入20μL蛋白酶,涡旋振荡。再加入200μL
TM
PureLink 基因组裂解/结合缓冲液,涡旋混合均匀,55℃培养30min。加入200μL 96‑100%
乙醇溶液于溶菌液中,涡旋混合均匀。将吸附柱放入收集管中,向其中加入640μL的溶菌液,
室温下10000×g离心1min。弃掉收集管,将吸附柱放入新的收集管中,加入500μL洗脱缓冲
液1,室温下10000×g离心1min。弃掉收集管,将吸附柱放入新的收集管中,加入500μL 洗脱
缓冲液2,室温下最大转速离心3min。将吸附柱放入1.5μL的离心管中,加入25‑200μL 基因
组洗脱缓冲液,室温下等待1min后,再以最大速度离心1min。收集管中纯化后的DNA, ‑20℃
下储存。
1.4.2);0.25μL Taq DNA聚合酶(5U·mL );5μL 10xPCR反应缓冲液;4μL dNTP MasterMix;
ddH20补足至50μL。
PCR产物送至上海生工,进行基因测序。测得MTL5‑77的16S rDNA的序列长度分别为
1454bp,测序结果如SEQ ID No.1所示。菌株MTL5‑77的16S rDNA序列已提交Genbank,登录
号为MH151243。
gttcttttctcgcatgagagaagatggaaagacggttta cgctgtcacttatagatgggcccgcggcgcattagc
tagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtg atcggccacactgggact
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atacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttg taacacccgaagtcggtgaggtaacc
ttcatggagccagccgcctaaggtgacaagagt(SEQ ID No.1)。
Brevibacterium sp.MTL5‑77。
基成分为:5g蛋白胨,1g酵母粉,0.01g磷酸铁,海水定容至1L,并将培养基在1.05kg/cm ,
120℃,20min的条件下灭菌。在16℃、180r/min条件下培养24h。按照5%的接种量将种子发
酵液接种到含50mL培养基的250mL培养瓶中,在16℃、180r/min条件下继续培养 24h后得到
扩增菌液。再按照5%的接种量将扩增菌液接种到含500mL培养基的2L培养瓶中,16℃、
160r/min条件下继续培养48h,得发酵菌液60L。
物。过滤菌体,收集液体后,40℃、100rpm、44mbar旋蒸至干燥,室温放置,至乙醇彻底挥发,
得到菌株MTL5‑77的乙醇浸提物。
用DEAE柱分离纯化乙醇浸提物。
NaCl加入进样缓冲液中,使NaCl的终浓度为1M。
化仪。用进样缓冲液冲洗未能挂柱的组分,再用30%的洗脱缓冲液,洗脱挂柱的组分,直接
收集DEAE阴离子交换层析图谱中洗脱峰b对应的组分,得活性组分A(图3)。
洗、脱气,洗净C18柱。首先用10%(v/v)的流动相Ⅰ和90%(v/v)的流动相Ⅱ冲洗,平衡基线。
进样体积20μL,流速为0.5mL/min,紫外检测波长λ=254nm,按照表2中的洗脱程序进行洗
脱,收集紫外吸收峰对应的流动相组分。
PMF 质量扫描范围为500‑3600Da,获得一级谱图(图6)。
myoglobin 酶解肽段进行外标校正。基质和样品的PMF质量扫描范围为700‑3600Da。进行完
MS后,直接选择目标肽段离子进行MS/MS分析。
取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549,弃培养液,再用3‑4mL的PBS清洗。加入 800μL胰
酶消化液消化40‑60s,吸出胰酶,放在含5%CO2的37℃恒温细胞培养箱中孵育 60‑80s,显
微镜下观察,发现80%左右的细胞变圆皱缩就停止反应;②消化后的细胞加入适量RPMI‑
1640细胞培养液,用无菌吸管吹打成单细胞悬液。用细胞计数器测定悬液细胞数,取适量细
胞悬液到新鲜18mL RPMI‑1640细胞培养液中,使新的细胞悬液浓度为3‑4×103个 /mL;③
将细胞悬液加到96孔板中,每孔加180μL,在恒温培养箱中培养16‑20h;④每孔加入样品20μ
L,样品在加入前用0.22μm的无菌滤膜过滤,每组设置3个平行孔;⑤然后继续在恒温培养箱
中培养48h,每个样品孔中加20μL MTT(5mg/mL,即0.5%MTT),置于恒温培养箱中继续培养
4h;⑥终止培养反应,去除孔内液体,用RPMI‑1640培养基清洗2遍,每孔加入150μL DMSO,多
功能酶标仪振荡10min,使结晶物甲瓒充分溶解;⑦酶标仪测定OD 570nm下的吸光值,用下
面公式计算细胞抑制率:细胞抑制率(%)=((OD 对照组‑OD实验组)/OD对照组)×100%。
抑制率达到50%时的药物浓度为IC50值,实验重复 3次结果以均值±SD表示。
同细胞的96孔板中,每个浓度做3组重复,MTT法测定BMTP对不同肿瘤细胞的活性抑制。利用
MTT法,测定BMTP处理不同肿瘤细胞48h后,对肿瘤细胞的半致死抑制率。
好的抑制肿瘤细胞增殖的效果,IC50分别为2.9798μg/mL,3.4656μg/mL,2.8642μg/mL,
4.1040μg/mL,4.3324μg/mL和5.6793μg/mL。BMTP在体外对实验肿瘤细胞具有较好的抑制活
性,IC50值的范围为2μg/mL
A549 2.9798 2.805 3.1037 3.0307 0.155719
BEL‑7402 3.4656 3.6034 3.4066 3.3868 0.119748
Hela 2.8642 2.8802 2.6425 3.0699 0.214149
Panc 28 4.3324 4.1599 4.2557 4.5861 0.223602
HepG2 4.104 4.3529 3.952 4.0071 0.217307
NCI‑H460 5.6793 5.8352 5.5966 5.6061 0.135097
以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范
围。