高效合成丙酮酸与D-丙氨酸的工程菌及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种高效合成丙酮酸与D‑丙氨酸的工程菌及其构建方法与应用。本发明在基因工程菌株BLK07(pET20b‑pm1)的基础上，通过定点饱和突变筛选到了pm1酶活提高的菌株，并通过在pm1基因序列N端插入N端编码序列(NCS)，提高了pm1的蛋白表达量，提高了丙酮酸的产量，显著缩短了催化时间，提高了催化效率。当底物D,L‑丙氨酸浓度为110g/L，细胞浓度为4g/L，催化体系在摇瓶中37℃、220rpm只催化8h时，丙酮酸的产量即可达到最大值46.5g/L，L‑丙氨酸的转化率为84.5％，D/L‑丙氨酸的拆分率达到84.5％。

权利要求

1.一种高效合成丙酮酸与D‑丙氨酸的工程菌，其特征在于，所述的工程菌是在大肠杆菌宿主中过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L‑氨基酸脱氨酶，并在编码L‑氨基酸脱氨酶的基因序列的N端插入N端编码序列；

所述的N端编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的大肠杆菌宿主为敲除btsT、cstA、aceEF、pflB、poxB、pps、ldhA基因的大肠杆菌BL21（DE3）。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的工程菌以质粒pET20b为表达载体。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，插入N端编码序列和L‑氨基酸脱氨酶的质粒pET20b‑N6‑pm1‑V437I的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种权利要求1 3任一项所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：~

（1）质粒pET20b‑N6‑pm1‑V437I构建：设计定点饱和突变引物，以pET20b‑pm1质粒为模板，全质粒PCR扩增，将PCR产物分别转入大肠杆菌BL21中，对饱和突变菌株进行高通量筛选，获得催化活力提高的BL21 pET20b‑pm1‑V437I菌株，提取质粒pET20b‑pm1‑V437I，设计N端融合引物，以该质粒为模板，PCR扩增后产物转入大肠杆菌JM109中，测序验证得到pET20b‑N6‑pm1‑V437I质粒；

（2）工程菌构建：将质粒pET20b‑N6‑pm1 ‑V437I导入大肠杆菌宿主中，得到所述的工程菌。

5.一种权利要求1 3任一项所述的工程菌在合成丙酮酸中的应用，其特征在于，所述的~应用是采用所述的工程菌全细胞催化D,L‑丙氨酸生成丙酮酸和D‑丙氨酸。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的工程菌是通过将工程菌接种至发酵培养基中，在25‑37℃下培养，以0.005 0.02 mM的IPTG进行诱导10 15h，离心收集得到。

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7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨10 15 ~g/L，酵母提取物22 25 g/L，甘油3 5 g/L，磷酸氢二钾2.2 2.4 g/L，三水磷酸氢二钾16 17 ~ ~ ~ ~g/L。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的全细胞催化的条件为：底物D,L‑丙氨酸浓度为110g/L，细胞浓度为4g/L，在30 40℃、100 300 rpm催化反应。

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说明书

高效合成丙酮酸与D‑丙氨酸的工程菌及其构建方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种高效合成丙酮酸与D‑丙氨酸的工程菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

[0002] 丙酮酸(Pyruvic acid)是药物合成领域的重要中间体，广泛应用于食品、农药、生化等工业中。目前工业上丙酮酸的生产方法主要有化学合成法，酶转化法和微生物发酵法。其中，化学合成法成本较高，而且其对于环境的污染较大；而微生物直接发酵法中，产物的成分复杂且分离难度大。生物催化法合成丙酮酸可以克服上述两种方法的不足和缺点，因此，在工业应用中具有广阔前景。

[0003] D‑丙氨酸是生产维生素B6和泛酸钙的原料，具有镇痛作用，也可用作多种生化试剂和有机合成中间体。目前D‑丙氨酸的价格比D,L‑丙氨酸、L‑丙氨酸都要高，然而D,L‑丙氨酸的拆分困难，且成本较高。因此，寻找一种操作简单、成本低且效率高的D,L‑丙氨酸的拆分方法很有意义。

[0004] L‑氨基酸脱氨酶(EC 1.4.3.2)广泛存在于自然界各种生物中。每类L‑氨基酸脱氨酶均对特定的一种或几种氨基酸或其氨基酸衍生物表现出较高的底物亲和性，而对其他氨基酸的亲和性较差。因此，不同来源的L‑氨基酸脱氨酶具有高度保守性。Proteus mirabilis来源的L‑氨基酸脱氨酶pm1，能催化L‑丙氨酸生成丙酮酸，却几乎不催化D‑丙氨酸，因此pm1可用于手性拆分D,L‑丙氨酸。

[0005] 大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)是一种可用于高效表达含T7启动子的表达载体的菌株，其遗传背景清晰，分子手段多样，是一种被广泛用作异源表达重要化学品合成途径的生产宿主。

[0006] 分子对接是通过受体的特征以及受体和配体分子之间的相互作用方式来进行药物设计或蛋白分析的方法。主要研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。近年来,分子对接方法已成为计算机辅助酶蛋白研究领域的一项重要技术。

[0007] 有研究表明，N端编码序列对基因的表达有调节作用。因此，基于这些研究，可以通过在基因N端添加文献所构建的NCS库中对基因表达促进作用较强的编码序列，以筛选得到基因表达水平高的正向突变菌株。

[0008] 此前，本人已在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了源于Proteus mirabilis的L‑氨基酸脱氨酶来催化合成丙酮酸同时通过手性拆分D,L‑丙氨酸获得D‑丙氨酸。研究中发现，在全细胞催化的过程中，细胞本身会大量吸收并利用产物丙酮酸，使得丙酮酸产量较低。针对这一问题，本人已于之前的研究中敲除了E.coli BL21中的丙酮酸转运蛋白(cstA,btsT)基因，减少其在全细胞催化过程中对生成的丙酮酸的摄入。并通过敲除E.coli BL21自身消耗丙酮酸的基因aceEF、pflB、poxB、pps、ldhA，提高丙酮酸积累量。获得的基因工程菌株BLK07(pET20b‑pm1)催化24h，生成丙酮酸的产量达到32g/L(专利申请号：201911385044X)。然而，该菌株催化时间长，产量距离工业化仍有一段距离。

[0009] 因此，如何利用表达L‑氨基酸脱氨酶pm1的大肠杆菌更高效的手性拆分D,L‑丙氨酸转化合成丙酮酸，仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

[0010] 为解决上述技术问题，本发明通过计算机模拟的分子对接，将L‑氨基酸脱氨酶pm1的同源模型的三维蛋白结构和配体L‑丙氨酸的三维结构进行分子对接并选取关键位点周围五个位点进行饱和突变。利用2,4‑二硝基苯肼显色法对饱和突变菌株进行高通量筛选，获得了催化活力明显提高的BL21(pET20b‑pm1‑V437I)菌株。

[0011] 本发明的第一个目的是提供一种高效合成丙酮酸与D‑丙氨酸的工程菌，所述的工程菌是在大肠杆菌宿主中过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L‑氨基酸脱氨酶，并在编码L‑氨基酸脱氨酶的基因序列的N端插入N端编码序列。

[0012] 进一步地，所述的N端编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0013] 进一步地，所述的大肠杆菌宿主为敲除btsT、cstA、aceEF、pflB、poxB、pps、ldhA基因的大肠杆菌BL21(DE3)。

[0014] 进一步地，所述的工程菌以质粒pET20b为表达载体。

[0015] 进一步地，插入N端编码序列和L‑氨基酸脱氨酶的质粒pET20b‑N6‑pm1‑V437I的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0016] 本发明的第二个目的是提供所述的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

[0017] (1)质粒pET20b‑N6‑pm1‑V437I构建：设计定点饱和突变引物，以pET20b‑pm1质粒为模板，全质粒PCR扩增，将PCR产物分别转入大肠杆菌BL21中，对饱和突变菌株进行高通量筛选，获得催化活力提高的BL21(pET20b‑pm1‑V437I)菌株，提取质粒pET20b‑pm1‑V437I，设计N端融合引物，以该质粒为模板，PCR扩增后产物转入大肠杆菌JM109中，测序验证得到pET20b‑N6‑pm1‑V437I质粒；

[0018] (2)工程菌构建：将质粒pET20b‑N6‑pm1‑V437I导入大肠杆菌宿主中，得到所述的工程菌。

[0019] 本发明的第三个目的是提供所述的工程菌在合成丙酮酸中的应用。

[0020] 进一步地，所述的应用是采用所述的工程菌全细胞催化D,L‑丙氨酸生成丙酮酸和D‑丙氨酸。

[0021] 进一步地，所述的工程菌是通过将工程菌接种至发酵培养基中，在25‑37℃下培养，以0.005～0.02mM的IPTG进行诱导10～15h，离心收集得到。

[0022] 进一步地，所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨10～15g/L，酵母提取物22～25g/L，甘油3～5g/L，磷酸氢二钾2.2～2.4g/L，三水磷酸氢二钾16～17g/L。

[0023] 进一步地，所述的全细胞催化的条件为：底物D,L‑丙氨酸浓度为110g/L，细胞浓度为4g/L，在30～40℃、100～300rpm催化反应。

[0024] 本发明的有益效果：

[0025] 本发明通过定点饱和突变筛选到了pm1酶活提高的菌株，通过在pm1基因序列N端插入N端编码序列(NCS)，提高了pm1的蛋白表达量，并缩短了催化时间。当底物D,L‑丙氨酸的浓度为110g/L，细胞浓度为4g/L，催化体系在摇瓶中37℃、220rpm催化8h时丙酮酸的产量达到最大值46.5g/L，L‑丙氨酸的转化率为84.5％，D/L‑丙氨酸的拆分率达到84.5％。

附图说明

[0026] 图1为pm1的定点饱和突变位点示意图；

[0027] 图2为pm1突变及N端编码序列融合菌株全细胞催化结果；

[0028] 图3为基因工程菌株BLK07(pET20b‑N6‑pm1‑V437I)全细胞催化结果；

[0029] 图4为基因工程菌株BLK07(pET20b‑N6‑pm1‑V437I)在不同细胞浓度下全细胞催化结果；

[0030] 图5为基因工程菌株BLK07(pET20b‑N6‑pm1‑V437I)在不同底物浓度下全细胞催化结果。

具体实施方式

[0031] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0032] 丙酮酸的测定方法：

[0033] 高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，UV检测器，伯乐有机酸色谱柱(300×7.8mm，9μl)，流动相：5mM的H2SO4，流速0.6mL/min，柱温40℃，进样体积为10μL。

[0034] 丙酮酸含量检测试剂盒法：

[0035] 1、标准品的准备：将标准品用蒸馏水稀释至40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0mg/mL。

[0036] 2、在96孔板中加入75μL标准液或样本和25μL试剂一，混匀，静置2min，加入125μL试剂二，混匀，于520nm波长处测定吸光值A。根据标准品浓度和测定值建立标准曲线，由此计算样品的丙酮酸含量。

[0037] 实施例1：分子对接及饱和突变位点的选择

[0038] 在SWISS MODEL数据库中搜索其同源酶晶体模型。模型5fjm.1A与pm1同源性较高，其同源性为93.51％。将其氨基酸系列与pm1进行比对，结果显示只有极少部分区域的氨基酸不同，这说明5fjm.1A的晶体结构基本与pm1的一致。因此，选择模型5fjm.1A与L‑丙氨酸进行分子对接。

[0039] 利用Autodock软件进行半柔性分子对接实验。根据Autodock软件的操作手册，使用拉马克遗传算法(LGA)将模型5fjm.1A的三维蛋白结构文件(包含辅酶FAD的结构)和配体L‑丙氨酸的三维结构文件，进行分子对接。

[0040] 在文献报道的pm1催化的关键位点Gln281、Phe318周围选择定点饱和突变的特点位点，如图1所示，选择其中五个位点进行定点饱和突变，分别对应pm1的V437、Q100、W439、R316、Y98位点。

[0041] 实施例2：定点饱和突变库的建立

[0042] 表1

[0043]

[0044] 根据pm1的基因序列，设计如上表中所示引物,分别使用上述引物以pET20b‑pm1质粒为模板，全质粒PCR扩增，将PCR产物分别转入大肠杆菌BL21中，后涂布于氨苄抗性的平板上。

[0045] 实施例3：高通量筛选与验证

[0046] 用牙签在每个饱和突变点库中挑选100个左右单克隆到96孔板进行种子培养。每孔含有600μl氨苄抗性的液体LB培养基，于37℃孔板摇床培养12h。之后将200μl种子液转接至每孔含有600μl氨苄抗性的液体TB培养基的96孔板中进行发酵诱导培养，同时加入IPTG(终浓度0.01mM)于37℃诱导6h后结束发酵。通过离心(3,500rpm，5min，4℃)发酵液收集细胞，弃上清液加入200μl 40g/L的L‑丙氨酸(溶解于0.2M pH 7.0磷酸缓冲液)，于37℃孔板摇床中开始反应，反应30min后通过离心停止反应，运用丙酮酸检测试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)测量上清中丙酮酸的含量。将产量高于对照组的菌株按上述方法复筛一遍。

[0047] 实施例4：全细胞催化合成丙酮酸与D‑丙氨酸

[0048] 按照实施例3所述，从437位点突变库中筛选出一株催化能力有提高的菌株。将其种子液以OD值0.1‑0.2的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基的配方为：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4g/L，磷酸氢二钾2.31g/L，三水磷酸氢二钾16.42g/L。当OD值达到2时，在25‑30℃下，以0.01mM的IPTG进行诱导12h，离心收集细胞，用缓冲液悬浮后加入底物D/L‑丙氨酸，37℃、220rpm催化24h。催化反应在250mL的三角瓶中进行，催化体系总体积25mL，细胞2g/L，D/L‑丙氨酸80g/L，缓冲液为pH7.0的0.1M的磷酸钠缓冲液。

[0049] 催化结束时，使用高效液相色谱测定上清中丙酮酸的含量，结果如图2所示，该突变菌株催化生产丙酮酸的产量达到14.86g/L，比原始菌株BL21(pET20b‑pm1)的产量提高23.8％。且该突变菌株到达最高产量的时间，由24h缩短至16h。经过测序验证，该菌株为V437I，即pm1第437位的缬氨酸GTT被突变为异亮氨酸ATT。

[0050] 实施例5：基因N端融合N端编码序列的重组质粒构建

[0051] 表2

[0052]

[0053] 根据N端编码序列和pm1的基因序列，设计如表2中所示引物，分别使用上述引物以pET20b‑pm1‑V437I质粒为模板，全质粒PCR扩增，将PCR产物分别转入大肠杆菌JM109中，测序验证N端编码序列融合成功。

[0054] 实施例6：N端融合重组质粒的转化与催化验证

[0055] 将构建成功的N端融合重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21中，得到重组菌株BL21(pET20b‑N6‑pm1‑V437I)，按照实施例4所述进行全细胞催化验证，结果如图2所示，V437I‑N6菌株的丙酮酸产量达到18.1g/L，比原始菌株BL21(pET20b‑pm1)的产量提高49.6％。且该突变菌株到达最高产量的时间缩短至12h。

[0056] 实施例7：基因工程菌株BLK07(pET20b‑N6‑pm1‑V437I)的构建

[0057] 将实施例5、6中所述的pET20b‑pm1‑V437I质粒转入大肠杆菌BLK07菌株中(BLK07菌株在本人之前的研究中已构建成功，是敲除大肠杆菌BL21中btsT、cstA、aceEF、pflB、poxB、pps、ldhA基因得到，参见专利201911385044X)，获得基因工程菌株BLK07(pET20b‑N6‑pm1‑V437I)。按照实施例4所述进行全细胞催化验证，结果如图3所示。12h到达最大产量35.33g/L，比对照菌株BLK07(pET20b‑pm1)提高10.4％，用时仅为对照组的一半。

[0058] 实施例8：基因工程菌株的催化条件优化

[0059] (1)细胞浓度优化

[0060] 将基因工程菌株BLK07(pET20b‑N6‑pm1‑V437I)按实施例4所述进行发酵催化，底物D,L‑丙氨酸浓度为110g/L，不同的是细胞浓度分别控制在1、2、3、4和5g/L，催化结果如图4所示，细胞浓度为4g/L时，工程菌丙酮酸产量最高，到达最高产量的时间缩短至8h。

[0061] (2)底物浓度优化

[0062] 将基因工程菌株BLK07(pET20b‑N6‑pm1‑V437I)按实施例4所述进行发酵催化，细胞浓度为4g/L，不同的是底物D,L‑丙氨酸浓度分别控制在80、90、100、110、120和130g/L，催化结果如图5所示，底物浓度为110g/L时，工程菌丙酮酸产量为46.5g/L，基本达到最高，继续增加底物浓度仅使产量小幅提升，而底物转化率下降明显。

[0063] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。