一种测定大黄醛中杂质丹蒽醌和大黄素的分析方法

摘要

本发明为采用LC‑MS/MS测定大黄醛中杂质丹蒽醌与大黄素的分析方法，具体涉及一种测定大黄醛中杂质丹蒽醌和大黄素的分析方法，包括如下步骤：步骤（1）确定离子源：步骤（2）确定母离子：步骤（4）确定质谱方法：步骤（5）确定液相方法。本发明的有益效果：本发明采用LC‑MS/MS测定大黄醛中大黄素与丹蒽醌，对照品浓度可达到75ng/ml，当检测限为15ppm时，样品浓度为5mg/ml，此时样品响应较好，峰型较好。同时，PICs子离子确认扫描可以排除假阳性的干扰。

权利要求

1.一种测定大黄醛中杂质丹蒽醌和大黄素的分析方法，其特征是包括如下步骤：步骤(1)确定离子源：采用QTRAP 6500plus LC‑MS/MS型设备，其离子源有ESI源及APCI源，根据大黄素与丹蒽醌的性质，最终确定ESI源进行采集；

步骤(2)确定母离子：取高浓度大黄素、丹蒽醌单标溶液，分别采用针泵直流进样的方式对标准品进行电离，设置Survey Scan为正模式，找到相对应的母离子，正模式无法找到母离子的情况下切换为负模式，重复上述操作；

步骤(3)确定子离子：根据采集到的大黄素、丹蒽醌母离子信息，分别设置扫描范围进行电离，通过增大CE值，找到具有代表性的三个子离子作为定性、定量离子；

步骤(4)确定质谱方法：根据大黄素、丹蒽醌母离子、子离子信息，分别进行质谱参数的优化，包括Daughter ion、CE、eV值；

步骤(5)确定液相方法：根据质谱方法，进行液相条件的优化，包括流动相、色谱柱、洗脱过程、流速、柱温及进样体积，最终保证空白溶剂、对照品和样品都没有干扰，且两个峰分离度大于1.5；

所述步骤(1)具体包括如下步骤：首先设置质谱参数为：离子源为正极ESI，检测方式为多反应监测方式，质谱条件具体为：喷雾电压5500V，离子源温度550℃，Curtain Gas 

25psi，Ion Source Gas1 50psi，Ion Source Gas2 60psi，驻留时间100msec；其它MRM如下；

成分1：丹蒽醌，Parent ion值241，Daughter ion值139的时候，对应的CE值47.9eV，Daughter ion值167的时候，对应的CE值46.5eV，Daughter ion值121的时候，对应的CE值

38eV，定量离子139；

成分2：大黄素 ，Parent ion值271，Daughter ion值197的时候，对应的CE值43eV，Daughter ion值225的时候，对应的CE值37.8eV，Daughter ion值169的时候，对应的CE值

45eV，定量离子197；

所述步骤(5)具体包括如下步骤：配制流动相，流动相：A为0.1％甲酸，B为乙腈，超声过滤之后，备用；色谱柱为Poroshell 120EC‑C18 4.6*150mm,4 μm，连接仪器之后，梯度洗脱为0～9.0min，50％～70％流动相B，9.0～14.0min，70％流动相B，14.0～14.1min，70％～

50％流动相B，14.1～20.0min，50％流动相B，流速设置为0.7ml/min；柱温35℃；进样体积：

25μl。

2.根据权利要求1所述的测定大黄醛中杂质丹蒽醌和大黄素的分析方法，其特征是所述步骤(5)之后还包括如下步骤：

取大黄素50.0mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加乙腈溶解超声3min，稀释至刻度，为样品溶液；

精密称取5.0mg丹蒽醌至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀，作为储备液

1‑1；精密称取5.0mg大黄素至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀，作为储备液

1‑2；

精密移取1.0ml储备液1‑1、储备液1‑2至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀；作为储备液2；

精密移取1.0ml储备液2至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀；作为储备液3；

精密移取300μl储备液3至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀；作为储备液4；

精密移取150μl储备液3到10ml容量瓶，用乙腈稀释并稀释至刻度，即为对照品溶液；

取大黄醛约50.0mg，精密称定，于10ml容量瓶中，精确量取150μl储备液3与此容量瓶中，用乙腈溶解超声3min，定容至刻度；过0.22μm的滤膜，作为样品加标溶液；

精密量取空白溶液、样品溶液、对照品溶液及对照品加标溶液各25μl，分别注入液相质谱联用仪，记录色谱图。

说明书

一种测定大黄醛中杂质丹蒽醌和大黄素的分析方法

技术领域

[0001] 本发明为采用LC‑MS/MS测定大黄醛中杂质丹蒽醌与大黄素的分析方法，具体涉及一种测定大黄醛中杂质丹蒽醌和大黄素的分析方法，本发明涉及LC‑MS/MS的运用、相关质
谱条件的优化及液相色谱条件的优化。

背景技术

[0002] LC‑MS/MS为三重四级杆串联质谱仪，第一级和第三级四极杆分析器分别为MS1和MS2，第二级四极杆分析器所起作用是将从MS1得到的各个峰进行轰击，实现母离子碎裂后
进入MS2再行分析。MS/MS最基本的功能主要是MS1中的母离子和MS2中的子离子间的联系。
根据MS1和MS2的扫描模式，如子离子扫描、母离子扫描和中性碎片丢失扫描，可以查明不同
质量数离子间的关系。MS/MS在混合物分析中有很多优势。在质谱与气相色谱或液相色谱联
用时，即使色谱未能将物质完全分离，也可以进行鉴定。MS/MS可从样品中选择母离子进行
分析，而不受其他物质干扰。MS/MS在药物领域有很多应用。子离子扫描可获得药物主要成
分、杂质和其他物质的母离子的定性信息，有助于未知物的鉴别，也可用于肽和蛋白质氨基
酸序列的鉴别。在药物代谢动力学研究中，对生物复杂基质中低浓度样品进行定量分析，可
用多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)消除干扰。如分析药物中某特定
离子，而来自基质中其他化合物的信号可能会掩盖检测信号，用MS1/MS2对特定离子的碎片
进行选择监测可以消除干扰。MRM也可同时定量分析多个化合物。在药物代谢研究中，为发
现与代谢前物质具有相同结构特征的分子，使用中性碎片丢失扫描能找到所有丢失同种功
能团的离子，如羧酸丢失中性二氧化碳。如果丢失的碎片是离子形式，则母离子扫描能找到
所有丢失这种碎片的离子。

[0003] 质谱仪一般由四部分组成：进样系统——按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部位；离子源——用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离子会聚成有一定能
量和几何形状的离子束；质量分析器——利用电磁场(包括磁场、磁场和电场的组合、高频
电场、和高频脉冲电场等)的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，
时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离；检测器——用来接受、检测和记录被分离
后的离子信号。一般情况下，进样系统将待测物在不破坏系统真空的情况下导入离子源，离
子化后由质量分析器分离再检测；计算机系统对仪器进行控制、采集和处理数据。

[0004] 本实验现有设备QTRAP 6500plus LC‑MS/MS及QTRAP 6500LC‑MS/MS，其具有两个离子源，大气压离子源(APCI)和电喷雾离子源(ESI)，ESI源分析离子型/极性化合物、难挥
发或热不稳定性化合物；APCI源分析一定挥发性的中等极性或低极性的小分子化合物。同
时QTRAP 6500还具有两个分析器，即四级杆分析器和离子阱分析器，四极杆分析器对选择
离子分析具有较高的灵敏度。离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度，而且单个离子
阱通过时间序列的设定就可以实现多级质谱(MSn)的功能。

[0005] 大黄素与丹蒽醌均属于蒽醌类化合物，对癌细胞均有抑制作用，目前规定了大黄素标准为液相色谱串联质谱测定法，丹蒽醌目前没有规定，而蒽醌类化合物大多采用液质
联用仪进行测定。

[0006] 采用液质联用仪测定蒽醌类化合物，物质响应偏低且残留严重，检测时需要提高样品浓度从而导致样品严重浪费，且残留严重造成效率低，存在需要清洗仪器、重复检测的
问题。同时，液质联用仪检测样品时，碎片较少，定性信息少，容易产生假阳性的问题。

发明内容

[0007] 本发明为采用LC‑MS/MS测定大黄醛中杂质丹蒽醌与大黄素的分析方法，具体涉及一种测定大黄醛中杂质丹蒽醌和大黄素的分析方法；LC‑MS/MS为三重四级杆串联质谱仪，
第一级和第三级四极杆分析器分别为MS1和MS2，第二级四极杆分析器所起作用是将从MS1
得到的各个峰进行轰击，对母离子碎片起碰撞诱导作用，实现母离子碎裂后进入MS2再行分
析，排除假阳性的干扰。同时，多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)采集
模式可以基于已知或假定的反应离子信息，有针对性的选择数据进行质谱信号采集，对符
合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，提高灵敏度，使响应值变
高。

[0008] 本发明的技术方案如下：

[0009] 一种测定大黄醛中杂质丹蒽醌和大黄素的分析方法，包括如下步骤：

[0010] 步骤(1)确定离子源：采用QTRAP 6500plus LC‑MS/MS型设备，其离子源有ESI源及APCI源，ESI利用离子蒸发，液相离子化，适用于极性较大化合物和生物大分子，APCI利用电
晕放电离子化，适用于中等极性、小分子化合物，根据大黄素与丹蒽醌的性质，最终确定ESI
源进行采集；

[0011] 步骤(2)确定母离子：取高浓度大黄素、丹蒽醌单标溶液，分别采用针泵直流进样的方式对标准品进行电离，设置Survey Scan为正模式，找到相对应的母离子,多为加氢、加
钠、加钾，正模式无法找到母离子的情况下可以切换为负模式，重复上述操作；

[0012] 步骤(3)确定子离子：根据采集到的大黄素、丹蒽醌母离子信息，分别设置扫描范围进行电离，通过增大CE值，找到具有代表性的三个子离子作为定性、定量离子；

[0013] 步骤(4)确定质谱方法：根据大黄素、丹蒽醌母离子、子离子信息，分别进行质谱参数的优化，包括Daughter ion、CE值；Daughter ion代表子离子值、CE代表碰撞能量、eV值代
表去簇电压值；

[0014] 步骤(5)确定液相方法：根据质谱方法，进行液相条件的优化，包括流动相、色谱柱、洗脱过程、流速、柱温及进样体积，最终保证空白溶剂、对照品和样品都没有干扰，且两
个峰分离度大于1.5。

[0015] 所述步骤(1)具体包括如下步骤：首先设置质谱参数为：离子源为征集ESI，检测方式为多反应监测(MRM)方式，质谱条件具体为：喷雾电压5500V，离子源温度550℃，Curtain 
Gas 25psi，Ion Source Gas1 50psi，Ion Source Gas2 60psi，驻留时间100msec；其它MRM
参数见下表1。

[0016] 表1.大黄醛中2种杂质MRM部分参数表

[0017]

[0018] 所述步骤(5)具体包括如下步骤：配制流动相，流动相：A为0.1％甲酸，B为乙腈，超声过滤之后，备用。色谱柱为Poroshell 120EC‑C18 4.6*150mm,4μm，连接仪器之后，用流动
相平衡至基线波动较小。梯度洗脱为0～9.0min，50％～70％流动相B，9.0～14.0min，70％
流动相B，14.0～14.1min，70％～50％流动相B，14.1～20.0min，50％流动相B，流速设置为
0.7ml/min；柱温35℃；进样体积：25μl。

[0019] 所述步骤(5)之后还包括如下步骤：

[0020] 取大黄素50.0mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加乙腈溶解超声3min，稀释至刻度，为样品溶液；

[0021] 精密称取5.0mg丹蒽醌至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀，作为储备液1‑1(0.5mg/ml)；精密称取5.0mg大黄素至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，
摇匀，作为储备液1‑2(0.5mg/ml)；

[0022] 精密移取1.0ml储备液1‑1、储备液1‑2至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀；作为储备液2(50μg/ml)；

[0023] 精密移取1.0ml储备液2至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀；作为储备液3(5μg/ml)；

[0024] 精密移取300μl储备液3至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀；作为储备液4(0.15μg/ml)；

[0025] 精密移取150μl储备液3到10ml容量瓶，用乙腈稀释并稀释至刻度，即为对照品溶液；

[0026] 取大黄醛约50.0mg，精密称定，于10ml容量瓶中，精确量取150μl储备液3与此容量瓶中，用乙腈溶解超声3min，定容至刻度。过0.22μm的滤膜，作为样品加标溶液；

[0027] 精密量取空白溶液、样品溶液、对照品溶液及对照品加标溶液各25μl，分别注入液相质谱联用仪，记录色谱图。

[0028] 本发明的有益效果：本发明采用LC‑MS/MS测定大黄醛中大黄素与丹蒽醌，对照品浓度可达到75ng/ml，当检测限为15ppm时，样品浓度为5mg/ml，此时样品响应较好，峰型较
好。同时，PICs子离子确认扫描可以排除假阳性的干扰。

[0029] 目前，蒽醌类化合物检测大多采用液质联用仪，方法较为单一，且丹蒽醌检测相对匮乏，采用LC‑MS/MS检测，在改善液质联用仪存在的响应低、假阳性及残留严重问题的同
时，能够为蒽醌类化合物检测提供一个新的方向，可以尽可能减少检测过程中存在的问题。

附图说明

[0030] 图1为空白溶液乙腈在此方法下采集所得色谱图；

[0031] 图2为大黄素、丹蒽醌混合对照品溶液在此方法下采集所得色谱图；

[0032] 图3为样品大黄醛在此方法下采集所得色谱图；

[0033] 图4为样品加标溶液在此方法下采集所得色谱图；

[0034] 图5为大黄素进行线性测试试验时的标准曲线示意图；

[0035] 图6为丹蒽醌进行线性测试试验时的标准曲线示意图。

具体实施方式

[0036] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：

[0037] 如图1至图6.

[0038] 实施例1：

[0039] 实验仪器：Thermo FisherU3000/AB Sciex Qtrap 6500三重四级杆质谱仪，Mettler XP6型分析天平。

[0040] 样品：大黄醛，大黄素，丹蒽醌。

[0041] 测试方法：

[0042] (1)首先设置质谱参数为：离子源为ESI+，检测方式为多反应监测(MRM)方式，质谱条件具体为：喷雾电压5500V，离子源温度550℃，Curtain Gas 25psi，Ion Source Gas1 
50psi，Ion Source Gas2 60psi，驻留时间100msec；其它MRM参数见下表1。QTRAP 6500plus 
LC‑MS/MS型设备。

[0043] 表1.大黄醛中2种杂质MRM部分参数表

[0044]

[0045] (2)配制流动相，流动相：A为0.1％甲酸，B为乙腈，超声过滤之后，备用。色谱柱为Poroshell 120 EC‑C18 4.6*150mm,4μm，连接仪器之后，用流动相平衡至基线波动较小。梯
度洗脱为0～9.0min，50％～70％流动相B，9.0～14.0min，70％流动相B，14.0～14.1min，
70％～50％流动相B，14.1～20.0min，50％流动相B，流速设置为0.7ml/min；柱温35℃；进样
体积：25μl。

[0046] (3)取大黄素50.0mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加乙腈溶解超声3min，稀释至刻度，为样品溶液。

[0047] 精密称取5.0mg丹蒽醌至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀，作为储备液1‑1：0.5mg/ml；精密称取5.0mg大黄素至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇
匀，作为储备液1‑2：0.5mg/ml。

[0048] 精密移取1.0ml储备液1‑1、储备液1‑2至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀。作为储备液2：50μg/ml。

[0049] 精密移取1.0ml储备液2至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀。作为储备液3：5μg/ml。

[0050] 精密移取300μl储备液3至10ml容量瓶中，加乙腈溶解后，稀释至刻度，摇匀。作为储备液4：0.15μg/ml。

[0051] 精密移取150μl储备液3到10ml容量瓶，用乙腈稀释并稀释至刻度，即为对照品溶液。

[0052] 取大黄醛约50.0mg，精密称定，于10ml容量瓶中，精确量取150μl储备液3与此容量瓶中，用乙腈溶解超声3min，定容至刻度。过0.22μm的滤膜，作为样品加标溶液。

[0053] 精密量取空白溶液、样品溶液、对照品溶液及对照品加标溶液各25μl，分别注入液相质谱联用仪，记录色谱图。

[0054] (4)如图1所示，空白溶液基线平稳，对物质无干扰，因此可以选定乙腈为空白溶剂。

[0055] 如图2所示，峰1为大黄素，保留时间为8.38min，峰2为丹蒽醌，保留时间为9.58min，两峰峰型较好，分离度较高，可以实现分离效果，且提取离子发现质谱方法中设置
的定量离子均有出现且丰度比一致，证明此方法可用于检测大黄素与丹蒽醌。

[0056] 大黄醛在此方法下出峰情况如图3，对比图2，发现样品在8.38min、9.58min均未出峰，对检测没有干扰，样品加标溶液检测检测如图4，进一步证明此方法检测大黄醛中大黄
素、丹蒽醌可行，对照分离效果较好且样品对检测无干扰。

[0057] 方法可行性验证试验：

[0058] I、线性测试试验：

[0059] 对照品‑200％：精密移取300μl储备液3到10ml容量瓶，用乙腈稀释并稀释至刻度，摇匀。

[0060] 对照品‑150％：精密移取225μl储备液3到10ml容量瓶，用乙腈稀释并稀释至刻度，摇匀。

[0061] 对照品‑120％：精密移取180μl储备液3到10ml容量瓶，用乙腈稀释并稀释至刻度，摇匀。

[0062] 对照品‑100％：精密移取150μl储备液3到10ml容量瓶，用乙腈稀释并稀释至刻度，摇匀。

[0063] 对照品‑50％：精密移取75μl储备液3到10ml容量瓶，用乙腈稀释并稀释至刻度，摇匀。

[0064] 对照品‑30％：精密移取45μl储备液3到10ml容量瓶，加乙腈稀释至刻度，摇匀。

[0065] 精密量取对照品‑30％，对照品‑50％，对照品‑80％，对照品‑100％，对照品‑120％，对照品‑150％，对照品‑200％溶液各25μl，注入串联四级杆液质联用仪，记录色谱
图。以浓度C对峰面积A进行线性回归，分别得到以下结果：丹蒽醌在0.0224～0.1496μg/ml
的浓度范围内，浓度与峰面积呈线性关系，且线性关系良好，线性回归方程为：y＝
166175066.2010x+42789.2021(r＝1.000，n＝6)；大黄素在0.0222～0.1479μg/ml的浓度范
围内，浓度与峰面积呈线性关系，且线性关系良好，线性回归方程为：y＝186456689.7360x+
238890.1997(r＝0.999，n＝6)。实验结果见下表2～表3。

[0066] 表2.大黄素线性测试结果

[0067]

[0068] 表3.丹蒽醌线性测试结果

[0069]

[0070] Ⅱ.仪器精密度验证试验：

[0071] Ⅰ)进样精密度

[0072] 精密移取上述对照品溶液25μl，注入串联四级杆液质联用仪，连续进样6针，计算保留时间与峰面积的RSD值，结果表明，2种杂质保留时间的RSD值均小于2％，峰面积的RSD
值均小于20％。实验结果见下表4。

[0073] 表4.进样精密度试验结果表

[0074]

[0075] Ⅱ)重复性

[0076] 平行配制上述样品加标溶液6份，作为重复性溶液。精密移取重复性溶液各25μl，注入串联四级杆液质联用仪，记录色谱图，结果表明2中杂质回收率的RSD均小于20％(n＝
6)，符合要求，具体见下表5～表6。

[0077] 表5.大黄素重复性试验结果

[0078]

[0079] 表6丹蒽醌重复性试验结果

[0080]

[0081] III、溶液稳定性验证试验

[0082] 取上述对照品溶液、样品加标溶液各一份，精密移取各25μl，注入串联四级杆液质联用仪，记录色谱图，考察24小时溶液稳定性。取7个时间点，每个时间点各进样一次。计算
各个时间点目标物质峰面积的相对偏差，结果显示对照品和样品加标溶液24小时内，7个时
间点进样,峰面积RSD均小于20％，溶液24小时内稳定。具体见下表7～表8。

[0083] 表7.对照品溶液稳定性结果表

[0084]

[0085] 表8.样品加标溶液稳定性结果表

[0086]

[0087] 从以上验证试验结果可以看出，本发明一种测试方法在仪器精密度、溶液稳定性以及线性测试的验证下均具有可行性。

[0088] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明
的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种
变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所
附的权利要求书及其等效物界定。