用于制备光固化液滴阵列芯片的光固化油相及光固化液滴阵列芯片的制备方法、产品和应用转让专利
申请号 : CN202010369475.3
文献号 : CN111635487B
文献日 : 2021-05-04
发明人 : 张涛 , 何宇
申请人 : 浙江大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种光固化液滴阵列芯片的制备方法,其特征在于,采用光固化油相为原料,包括:将光固化油相、水相分别通入微流控芯片中,生成油包水液滴后进入所述微流控芯片的液滴收集腔室内,经光辐照后,所述油包水液滴的油相凝固于所述液滴收集腔室内,形成光固化液滴阵列芯片;
所述液滴收集腔室表面修饰有丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯官能团;
所述光固化油相,按重量百分比计,原料组成包括:光固化试剂 10.0 98.5%;
~
表面活性剂 1 10 %;
~
光聚合引发剂 0.5 5.0 %;
~
稀释剂 0 80 %;
~
所述光固化试剂选自含有光固化基团的聚合物和/或含有光固化基团的单体;
所述含有光固化基团的聚合物包括含有丙烯酸酯官能团的聚合物和/或含有甲基丙烯酸酯官能团的聚合物;
所述含有光固化基团的单体包括含有丙烯酸酯官能团的单体和/或含有甲基丙烯酸酯官能团的单体;
所述表面活性剂选自亲水亲油平衡值为2 8的非离子型表面活性剂。
~
2.根据权利要求1所述的光固化液滴阵列芯片的制备方法,其特征在于,所述微流控芯片包括基底和含通道结构的芯片主体;
所述芯片主体上的通道结构包括联通的进样与出样区、液滴生成区、液滴分散区与液滴收集区;
所述进样与出样区设有油相进样口、水相进样口与出样口;
所述液滴生成区包括液滴生成结构,选自T型通道结构、流动聚焦型通道结构或者台阶微结构;
所述液滴分散区包括液滴分裂结构和液滴分散结构;
所述液滴收集区设有液滴收集腔室;
所述基底固接于所述芯片主体底部;
所述基底与所述芯片主体的材质独立地选自玻璃、有机聚合物、硅片或石英片。
3.根据权利要求2所述的光固化液滴阵列芯片的制备方法,其特征在于:当所述芯片主体的材质选自聚二甲基硅氧烷时,所述微流控芯片还包括支撑模块、防蒸发层和盖片;
所述支撑模块封接于所述进样与出样区上方,所述支撑模块中设有贯通所述支撑模块的油相进样通道、水相进样通道与出样通道,所述油相进样通道与所述油相进样口联通,所述水相进样通道与所述水相进样口联通,所述出样通道与所述出样口联通;
所述防蒸发层为单面或双面粘性的不透气薄膜,封接于所述含通道结构的芯片主体之上,并覆盖所述液滴生成区、所述液滴分散区与所述液滴收集区;
所述盖片固接于所述防蒸发层的顶部。
4.根据权利要求3所述的光固化液滴阵列芯片的制备方法,其特征在于:具体为:(1)加工微流控芯片:先制备含通道结构的芯片主体,再连接基底、支撑模块、防蒸发层与盖片;
所述芯片主体与所述基底、所述防蒸发层的连接均采用等离子处理;
(2)微流控芯片的预处理:先向微流控芯片内连续通入含有硅烷偶联剂的有机溶液A,再通入有机溶剂B冲洗通道,最后通入氮气吹干后待用;
(3)分别配制光固化油相与水相:(4)液滴生成与固化:将所述光固化油相从所述油相进样通道通入所述微流控芯片中,将所述水相从所述水相进样通道通入所述微流控芯片中,两相在液滴生成区汇合并形成油包水液滴,再流经液滴分散区进入液滴收集区的液滴收集腔室内,经紫外光辐照后,所述油包水液滴的油相凝固于所述液滴收集腔室内,形成光固化液滴阵列芯片。
5.根据权利要求4所述的光固化液滴阵列芯片的制备方法,其特征在于:步骤(2)中:
所述硅烷偶联剂上含有丙烯酸酯官能团或甲基丙烯酸酯官能团;
所述有机溶剂A与有机溶剂B独立地选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、乙醚、氯仿、丙酮中的至少一种;
所述含有硅烷偶联剂的有机溶剂的体积百分比浓度为2 20%;
~
步骤(4)中:
所述光固化油相与所述水相的流速比为2 10:1;
2 ~
所述紫外光辐照,功率为50 500mW/cm,时间为1 10s。
~ ~
6.根据权利要求1所述的光固化液滴阵列芯片的制备方法,其特征在于:所述含有丙烯酸酯官能团的聚合物选自聚氨酯丙烯酸酯类、聚硅氧烷丙烯酸酯类、全氟聚醚丙烯酸酯类、环氧丙烯酸酯类、聚酯丙烯酸酯类、聚醚丙烯酸酯类中的至少一种;
所述含有甲基丙烯酸酯官能团的聚合物选自聚氨酯甲基丙烯酸酯类、聚硅氧烷甲基丙烯酸酯类、全氟聚醚甲基丙烯酸酯类、环氧甲基丙烯酸酯类、聚酯甲基丙烯酸酯类、聚醚甲基丙烯酸酯类中的至少一种;
所述含有光固化基团的单体选自丙烯酸异冰片酯、新戊基二醇丙氧杂酸二丙烯酸、甲基丙烯酸硬脂酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、1,6‑己二醇二丙烯酸酯、1,10‑癸二醇二丙烯酸酯、1H,1H,2H,
2H‑全氟癸基丙烯酸酯、2‑(全氟辛基)乙基甲基丙烯酸酯、双酚 A 丙三醇双甲基丙烯酸酯、双酚 A 甘油二丙烯酸、双酚 A 二甲基丙烯酸酯、双酚 A 乙氧基化物二丙烯酸酯中的至少一种;
所述表面活性剂选自聚甘油‑4异硬脂酸酯、二异硬脂酰基聚甘油‑3 二聚亚油酸酯、聚甘油‑3 油酸酯、聚甘油‑4二异硬脂酸酯/聚羟基硬脂酸酯/癸二酸酯、辛酸/癸酸甘油三酯或其混合物;鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇‑10/1二甲基硅氧烷、双‑聚乙二醇/聚丙二醇‑14/
14聚二甲基硅氧烷、聚乙二醇/聚丙二醇‑18/18聚二甲基硅氧烷环戊硅氧烷分散液;失水山梨醇单棕榈酸酯、失水山梨醇单硬脂酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、失水山梨醇单油酸酯;
全氟聚醚‑聚乙二醇共聚物。
7.根据权利要求6所述的光固化液滴阵列芯片的制备方法,其特征在于:所述光固化试剂选自含有光固化基团的聚合物和含有光固化基团的单体;
当所述含有光固化基团的聚合物选自聚氨酯丙烯酸酯类和/或聚氨酯甲基丙烯酸酯类时,所述含有光固化基团的单体选自丙烯酸异冰片酯和/或新戊基二醇丙氧杂酸二丙烯酸;
所述表面活性剂选自聚甘油‑4异硬脂酸酯、二异硬脂酰基聚甘油‑3 二聚亚油酸酯、聚甘油‑3 油酸酯、聚甘油‑4二异硬脂酸酯/聚羟基硬脂酸酯/癸二酸酯、辛酸/癸酸甘油三酯中的至少一种;
当所述含有光固化基团的聚合物选自聚硅氧烷丙烯酸酯类和/或聚硅氧烷甲基丙烯酸酯类,所述含有光固化基团的单体选自甲基丙烯酸硬脂酸酯和/或1,6‑己二醇二丙烯酸酯;
所述表面活性剂选自鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇‑10/1二甲基硅氧烷、双‑聚乙二醇/聚丙二醇‑14/14聚二甲基硅氧烷、聚乙二醇/聚丙二醇‑18/18聚二甲基硅氧烷环戊硅氧烷分散液中的至少一种;
当所述含有光固化基团的聚合物选自全氟聚醚丙烯酸酯类和/或全氟聚醚甲基丙烯酸酯类,所述含有光固化基团的单体选自1H,1H,2H,2H‑全氟癸基丙烯酸酯和/或2‑(全氟辛基)乙基甲基丙烯酸酯;
所述表面活性剂选自全氟聚醚‑聚乙二醇共聚物。
8.一种根据权利要求1 7任一权利要求所述的方法制备的光固化液滴阵列芯片,其特~
征在于,包括微流控芯片和固定于所述微流控芯片的收集腔室内的光固化液滴阵列。
9.一种根据权利要求8所述的光固化液滴阵列芯片在数字PCR、细胞研究领域中的应用。
说明书 :
用于制备光固化液滴阵列芯片的光固化油相及光固化液滴阵
列芯片的制备方法、产品和应用
技术领域
背景技术
散到数量众多的、相互独立的反应小室中,使每个反应小室中包含1或0拷贝目标分子,经过
PCR扩增后,通过数发荧光的反应小室的数量就可以获得核酸的浓度。与传统的定量PCR相
比,dPCR具有许多独特的优点,包括对核酸的绝对定量、超高的灵敏度和准确性、更适用于
复杂样本分析等,目前已成为最重要的核酸检测技术之一,在临床诊断、微生物检测和食品
安全检测等方面拥有广阔的应用前景。
别的液滴作为dPCR的反应小室。截至目前,已有很多种液滴生成技术,通过采用T型通道、流
动聚焦通道、共聚焦通道等微结构设计,可以灵活、快速地生成数万甚至数百万个液滴,极
大地促进了ddPCR技术的快速发展。由于具有高通量、高精度以及样品试剂用量小等特点,
ddPCR技术正在受到越来越多的关注,并被广泛应用于核酸检测、药物筛选、单细胞分析等
研究领域。
失败。另一方面,荧光液滴的计数仍主要依赖于“流动检测”,这意味着液滴的生成、热循环
和检测都需要在不同的仪器设备上进行。相比较而言,荧光成像检测更加简单,有利于系统
的集成,进一步发展实时荧光成像技术还可以有效识别假阳性荧光液滴,提高检测的准确
性。但由于液滴在油相中的自由运动,对其进行实时荧光成像几乎是不可能的。最近,研究
人员发展了一种基于热固化油的微流控液滴,即在加热条件下油相可以凝固成固体,从而
在液滴之间形成稳定的物理边界,有效地减少了液滴的融合和破碎现象,在实时ddPCR方面
也有一定潜力。但这种油的固化需要较长时间,这使其作为ddPCR平台仍有很大的不确定
性,尤其是在热循环的初期。另外,这种热固性油在室温下也可以缓慢固化,因而必须在使
用前现配现用,一定程度上增加了ddPCR的复杂度。
发明内容
的油包水液滴快速原位固定,形成稳定的液滴阵列。该光固化油相的固化时间短、易于储
存,更适用于ddPCR技术,且由于形成稳定的液滴阵列,也为实时荧光成像检测创造了条件。
合物;
的光固化油相,可与水相形成稳定存在的油包水液滴。
水相形成油包水液滴,要么形成的油包水液滴无法稳定存在,容易融合。
种;
醚丙烯酸酯类中的至少一种;
材料公司的聚氨酯丙烯酸酯聚合物6115J‑80、611B85、6112‑100、6123、6130B80、6145‑100、
6147、6148J75、6157B80、6175‑2、6176、6195、6196、6197型号;聚硅氧烷(甲基)丙烯酸酯为
两端或支链含有(甲基)丙烯酸酯官能团的硅氧烷聚合物,选自Gelest公司的DMS‑R、RMS、
UMS系列;全氟聚醚(甲基)丙烯酸酯选自沙多玛公司的CN 4000、FLUOROLINK公司的MD700;
环氧(甲基)丙烯酸酯选自科宁公司的 3000系列;聚酯(甲基)丙烯酸酯选自长
兴材料公司的6311、6312、6313、6314、6315系列型号中的一种或多种。
羟甲基丙烷三丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、1,6‑己二醇二丙烯酸酯、1,
10‑癸二醇二丙烯酸酯、1H,1H,2H,2H‑全氟癸基丙烯酸酯、2‑(全氟辛基)乙基甲基丙烯酸
酯、双酚A丙三醇双甲基丙烯酸酯、双酚A甘油二丙烯酸、双酚A二甲基丙烯酸酯、双酚A乙氧
基化物二丙烯酸酯中的至少一种。
PDI)、聚甘油‑3油酸酯(如EVONIC ISOLAN GO33)、聚甘油‑4二异硬脂酸酯/聚羟基硬脂酸
酯/癸二酸酯(如EVONIC ISOLAN GPS)、辛酸/癸酸甘油三酯或其混合物(如EVONIC ISOLAN
17);鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇‑10/1二甲基硅氧烷(如ABIL EM90)、双‑聚乙二醇/聚丙二
醇‑14/14聚二甲基硅氧烷(如ABIL EM97S)、聚乙二醇/聚丙二醇‑18/18聚二甲基硅氧烷环
戊硅氧烷分散液(如道康宁DC5225C);失水山梨醇单棕榈酸酯(如SPAN40)、失水山梨醇单硬
脂酸酯(如SPAN60)、失水山梨醇三硬脂酸酯(如SPAN65)、失水山梨醇单油酸酯(如SPAN80);
全氟聚醚‑聚乙二醇共聚物(如SulfochemEA‑60)。
烯酸;
三酯中的至少一种;
酸酯;
烷分散液中的至少一种;
辛基)乙基甲基丙烯酸酯;
述表面活性剂选自ISOLAN PDI;
形成光固化液滴阵列芯片。
μm的杂质堵住通道。
微结构。
液滴分散结构。
~250μm。
联通。
液滴内试剂蒸发。
相进样口联通,所述水相进样通道与所述水相进样口联通,所述出样通道与所述出样口联
通;优选的,所述支撑模块的材质选自聚二甲基硅氧烷。
蒸发。所述防蒸发层选自单面或双面粘性的不透气薄膜,优选为PCR封口膜,此处的PCR是指
聚合酶链式反应,所述PCR封口膜一般是在96孔板上做PCR反应的时候用来封住孔板上面的
膜层。具体可选自赛默飞公司的PCR密封胶。
的场合。
形成油包水液滴,再流经液滴分散区进入液滴收集区的液滴收集腔室内,经紫外光辐照后,
所述油包水液滴的油相凝固于所述液滴收集腔室内,形成光固化液滴阵列芯片。
基三甲氧基硅烷、3‑(丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅
烷等常用品种。
芯片主体内通道共价连接,保证液滴内试剂不会泄露。
含有硅烷偶联剂的有机溶剂的体积百分比浓度为10%。
5%;吐温‑205%和样品模板溶液5%。
响到水相溶液。优选的,所述紫外光辐照,功率为50~500mW/cm ,时间为1~10s。进一步优
2
选,功率为200~400mW/cm,时间为3~8s。
环反应过程中,由于油相的固化,使得液滴不会融合破碎,且形状位置不发生改变。可作为
微反应室阵列在数字PCR、细胞研究等领域应用。
提供了更多可能;通过筛选特定的表面活性剂与光固化试剂配合,组成的新型光固化油,可
与常规油相试剂一样生成均匀稳定的油包水液滴,且液滴粒径可调。
溶液中的生物活性组分几乎没有影响,因而非常适合于涉及各种生化反应的分析检测、细
胞研究等应用领域;该光固化过程可以原位进行,大大降低了芯片转移过程带来的液滴移
动、破坏等不确定性;且经过光固化,在液滴之间形成稳定的物理隔层,有效地解决了液滴
的融合、破碎问题。同时,由于液滴位置的固定,使其在单个液滴的识别与实时监测方面有
很大潜力。
石英片)作为芯片主体的材质时,该微流控芯片可简化为仅包括基底与芯片主体,既可用于
本发明中液滴阵列的制备,并可防止试剂蒸发;当采用目前最常用的PDMS作为芯片主体的
材质时,又创造性的提出了一种多层结构,包括基底、含通道结构的芯片主体、支撑模块、防
蒸发层与盖片;利用PCR封口膜密封PDMS薄膜,成功克服了热循环反应过程中的试剂蒸发问
题,且可以应用于所有需要防蒸发的微流控芯片的场合。
附图说明
L、90拷贝/μL及0拷贝/μL下,PCR反应后的显微镜照片;
片,以及循环20次、25次、30次、35次、40次后的荧光显微镜照片,g图为从d图中选取八颗液
滴,其荧光强度随循环次数变化的曲线图;
具体实施方式
1中生成油包水液滴后进入微流控芯片1的液滴收集腔室191内,UV控制器3控制UV探头2发
出紫外光,经紫外光辐照后,油包水液滴的油相凝固于液滴收集腔室191内,形成光固化液
滴阵列芯片。
集腔室191内,从而形成光固化液滴阵列芯片;芯片主体12选自PDMS薄膜。
相进样口161联通,水相进样通道与水相进样口162联通,出样通道与出样口163联通;设置
支撑模块13是为了便于与原料流体管路连接,将油相与水相引入微流控芯片中,其材质选
自PDMS。
164,以阻止大于50μm的杂质堵住通道;水相经水相进样口162通入,经中间一条通道进入液
滴生成区17,并通过设置在液滴生成区17内的液滴生成结构171与油相汇合生成油包水液
滴。
道进入液滴收集区,以提高液滴分布的均匀性。液滴分裂结构181具体采用一分二Y型结构。
液滴分散结构182具体采用三角形一进二出结构。
集腔室,防止其塌陷。
丙烯酸官能团;
2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基‑1‑丙酮(西格玛,405655)混合配制得到。
飞,4331182),1μL吐温‑20(西格玛,93773)。
为200μL/h,获得直径为42μm的液滴。
5%甲基丙烯酸硬脂酸酯(西格玛,411442)、3%表面活性剂(道康宁公司,DC5225C)、0.5%
光引发剂2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基‑1‑丙酮(西格玛,405655)混合配制得到。
15%1,6‑己二醇二丙烯酸酯(西格玛,246816)、46.5%硅油(西格玛,10836)、3%表面活性
剂(ABIL,EM90)、0.5%光引发剂2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基‑1‑丙酮(西格玛,405655)混合配制
得到。
80)、50%新戊基二醇丙氧杂酸二丙烯酸(西格玛,412147)、4%表面活性剂(EVONIC,ISOLAN
PDI)、0.5%光引发剂2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基‑1‑丙酮(西格玛,405655)混合配制得到。
4000)、58.5%2‑(全氟辛基)乙基甲基丙烯酸酯(西格玛,474223)、4%表面活性剂
(Sulfochem,EA‑60)、0.5%光引发剂2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基‑1‑丙酮(西格玛,405655)混合
配制得到。
35%1,6‑己二醇二丙烯酸酯(西格玛,246816)、20%丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(西
格玛,407577)、4.5%表面活性剂(ABIL,EM90)、0.5%光引发剂2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基‑1‑
丙酮(西格玛,405655)混合配制得到。
6115J‑80)、66.61%丙烯酸异冰片酯(西格玛,392103)、2.97%表面活性剂(西格玛,
Span85,亲水亲油平衡值为8.6)、0.6%光引发剂2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基‑1‑丙酮(西格玛,
405655)混合配制得到。
80)、67%丙烯酸异冰片酯(西格玛,392103)、3%表面活性剂(西格玛,Span80)、0.5%光引
发剂2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基‑1‑丙酮(西格玛,405655)混合配制得到。
3%表面活性剂(西格玛,ISOLAN PDI)、0.5%光引发剂2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基‑1‑丙酮(西
格玛,405655)混合配制得到。
酸酯官能团。
至10℃。待反应结束后,在倒置荧光显微镜上对微流控芯片液滴收集腔室区域的液滴阵列
进行荧光成像检测。
成均匀稳定的油包水液滴,且通过调节油水流速比,可生成不同粒径的液滴。
由于油相固化形成了液滴之间的物理隔层,使得液滴固定,且在PCR反应前后可以保持液滴
形状及空间位置不变。
L、90拷贝/μL及0拷贝/μL下,PCR反应后的荧光显微镜照片;观察图6可以发现,ACTB模板浓
度越高,荧光液滴的个数越多,与理论上PCR反应结果的趋势相符。
片,以及循环20次、25次、30次、35次、40次后的荧光显微镜照片,g图为从d图中选取七颗液
滴(1~7)以及一颗阴性液滴8,其荧光强度随循环次数变化的曲线图。观察图7可以发现,光
固化液滴阵列具有实时检测的潜力。其中阳性液滴1~7的荧光强度值随循环数的增加而增
强,且在循环数为30时,荧光强度值陡增,而阴性液滴8的荧光强度值保持平缓。
可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。