用于免疫治疗的含锰微沉淀脂质体及其制备方法转让专利
申请号 : CN202010573158.3
文献号 : CN111643454B
文献日 : 2021-06-15
发明人 : 林志强 , 游富平 , 吕丹 , 梁子超 , 雒钰杰 , 王晓
申请人 : 北京大学
摘要 :
本发明公开了一种用于免疫治疗的含锰微沉淀脂质体及其制备方法。该脂质体由含锰离子的微沉淀内核和磷脂双分子层外壳所组成，可通过乳剂混合法和薄膜分散法联合制备得到。该脂质体为20‑200nm的球形结构，表面带有一定量正电荷，在一定的酸性环境中可降解。该脂质体可刺激固有免疫系统和/或适应性免疫或者作为免疫佐剂，用于抗病毒、抗细菌、抗肿瘤和自身免疫性疾病等相关疾病的治疗。
权利要求 :
1.一种含锰微沉淀脂质体，为生物可降解的包覆锰离子沉淀的脂质体，由含锰离子的微沉淀内核和磷脂双分子层外壳组成，该含锰微沉淀脂质体作为二价锰离子的纳米储库，在组织或细胞内偏酸性的环境中降解并释放出游离的锰离子；所述含锰微沉淀脂质体通过下述方法制备得到：
1)将含二价锰离子的化合物配制成一定浓度的水溶液，在超声情况下逐滴滴入油溶液中，继续超声使水滴被裂解并均匀分散在油相中，水相与油相的体积比为1:10～1:1000之间；
2)将含所述微沉淀中阴离子的化合物配制成水溶液，在超声情况下逐滴滴入油溶液中，继续超声使水滴被裂解并均匀分散在油相中，水相与油相的体积比为1:10‑1:1000之间；
3)将上述两种溶液混合后静置10‑60分钟，使锰离子与相应阴离子反应形成微沉淀，然后加入与油相溶液体积相当的第一有机溶剂破坏油相，离心得到锰离子微沉淀，溶于第二有机溶剂中，其中所述第一有机溶剂能够溶解油相但不溶解锰离子微沉淀，而第二有机溶剂为非极性有机溶剂；
4)在含锰离子微沉淀的氯仿溶液中加入磷脂材料和胆固醇，转移至茄形瓶中，通过旋转蒸发仪挥掉有机溶液，形成一层脂膜；
5)加入缓冲液或去离子水，40‑60℃下超声10‑60分钟即得含锰微沉淀脂质体。
2.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体粒径为20‑200nm，其磷脂双分子层外壳带有正电荷，进入细胞后在偏酸性的环境中，脂质体缓慢降解并释放锰离子。
3.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述锰离子为二价锰离子，含锰离子的微沉淀内核选自下列化合物中的一种或多种：磷酸锰、磷酸氢锰、碳酸锰、草酸锰。
4.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述磷脂双分子层外壳由磷脂材料和胆固醇组成，其中磷脂材料选自以下材料中的一种或多种：DOPA、DOTAP、DSPE‑PEG。
5.如权利要求4所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体的磷脂双分子层中按摩尔百分含量计，含有20％‑80％的DOPA，8‑40％的DOTAP，8‑40％的胆固醇，2‑20％的DSPE‑PEG。
6.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体的表面偶联有靶向分子。
7.权利要求1～6任一所述的含锰微沉淀脂质体在制备治疗免疫相关疾病的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，在所述药物中，所述含锰微沉淀脂质体作为刺激固有免疫和/或适应性免疫的成分，或者作为免疫佐剂。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物为抗病毒药物、抗细菌药物、抗寄生虫药物，或者是治疗自身免疫性疾病的药物，或者是治疗癌症的药物。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述病毒为DNA病毒或RNA病毒，选自疱疹病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、冠状病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、乳头瘤病毒科、痘病毒科和逆转录病毒科；所述细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，选自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、沙门氏菌、脑膜炎双球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、绿脓假单胞菌和波美不动杆菌；所述寄生虫选自疟原虫、弓形虫、锥虫、血吸虫、丝虫和利什曼原虫；所述自身免疫性疾病包括但不限于I型糖尿病、银屑病、类风湿关节炎、系统红斑狼疮和多发性硬化；所述癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、肾癌、结直肠癌、胎盘绒毛膜癌、宫颈癌、睾丸癌、子宫癌和白血病。
11.权利要求1～6任一所述的含锰微沉淀脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1)将含二价锰离子的化合物配制成一定浓度的水溶液，在超声情况下逐滴滴入油溶液中，继续超声使水滴被裂解并均匀分散在油相中，水相与油相的体积比为1:10～1:1000之间；
2)将含所述微沉淀中阴离子的化合物配制成水溶液，在超声情况下逐滴滴入油溶液中，继续超声使水滴被裂解并均匀分散在油相中，水相与油相的体积比为1:10‑1:1000之间；
3)将上述两种溶液混合后静置10‑60分钟，使锰离子与相应阴离子反应形成微沉淀，然后加入与油相溶液体积相当的第一有机溶剂破坏油相，离心得到锰离子微沉淀，溶于第二有机溶剂中，其中所述第一有机溶剂能够溶解油相但不溶解锰离子微沉淀，而第二有机溶剂为非极性有机溶剂；
4)在含锰离子微沉淀的氯仿溶液中加入磷脂材料和胆固醇，转移至茄形瓶中，通过旋转蒸发仪挥掉有机溶液，形成一层脂膜；
5)加入缓冲液或去离子水，40‑60℃下超声10‑60分钟即得含锰微沉淀脂质体。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中含二价锰离子的化合物选自下列化合物中的一种或多种：氯化锰、硝酸锰、硫酸锰；步骤2)中含所述微沉淀中阴离子的化合物选自下列化合物中的一种或多种：磷酸氢钠、磷酸钠、碳酸钠、草酸钠。
13.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤1)和2)中所述油溶液选自下列油性溶剂中的一种或多种：环己烷、环戊烷、石油醚、苯；在所述油溶液中添加有非离子型表面活性剂。
14.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述第一有机溶剂为醇类或醚类有机溶剂，所述第二有机溶剂为易挥发的非极性有机溶剂。
15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述第一有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇和乙醚；所述第二有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、溴乙烷、苯、环己烷、己烷、乙醚、异丙醚和乙酸乙酯。
说明书 :
用于免疫治疗的含锰微沉淀脂质体及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于免疫治疗或癌症治疗的含锰微沉淀脂质体(NanoMn)及其制备方法，属于纳米制剂领域。
背景技术
[0002] 金属锰作为人体必需的微量元素之一，在体内发挥多种极为重要的生理功能。近年来，有文献报道二价锰离子在体内发挥重要的免疫功能，是细胞内天然的免疫激活剂和
警报器。天然免疫是机体宿主细胞抵抗病原微生物侵入的第一道防线。已有多项研究表明
cGAS‑STING信号通路是机体免疫激活的一条重要通路，其在抗病毒免疫中可以感受病毒的
入侵，并激活转录因子IRF3/7和NF‑κB，产生I型干扰素(IFN)等各种抗病毒的细胞因子；其
在抗肿瘤免疫和自身免疫性疾病方面亦发挥重要作用。目前已有研究表明二价锰离子可以
作为一种新型的cGAS‑STING激活剂，改善固有免疫和/或适性免疫。
警报器。天然免疫是机体宿主细胞抵抗病原微生物侵入的第一道防线。已有多项研究表明
cGAS‑STING信号通路是机体免疫激活的一条重要通路，其在抗病毒免疫中可以感受病毒的
入侵，并激活转录因子IRF3/7和NF‑κB，产生I型干扰素(IFN)等各种抗病毒的细胞因子；其
在抗肿瘤免疫和自身免疫性疾病方面亦发挥重要作用。目前已有研究表明二价锰离子可以
作为一种新型的cGAS‑STING激活剂，改善固有免疫和/或适性免疫。
[0003] 然而，二价锰离子用于免疫治疗仍存在以下问题：其在体内给药后无法实现特异性的分布，并且极易分布到神经系统，损害中枢神经，对于免疫系统也会产生一定的毒副作
用。此外，外源锰离子进入细胞主要通过浓度梯度扩散的方式，无法特异性地进入靶细胞而
不进入非靶细胞。
用。此外，外源锰离子进入细胞主要通过浓度梯度扩散的方式，无法特异性地进入靶细胞而
不进入非靶细胞。
发明内容
[0004] 针对二价锰离子用于免疫治疗存在的非特异性分布和神经毒性等问题，本发明拟构建一种含二价锰离子微沉淀的脂质体，该脂质体经静脉给药后，可以定向分布至肿瘤组
织或其它靶部位，在组织内或细胞内偏酸性环境中缓慢降解，释放出锰离子，从而发挥免疫
激活作用；并且该脂质体不透过血脑屏障，从而减少中枢神经毒性。
织或其它靶部位，在组织内或细胞内偏酸性环境中缓慢降解，释放出锰离子，从而发挥免疫
激活作用；并且该脂质体不透过血脑屏障，从而减少中枢神经毒性。
[0005] 本发明提供的含锰微沉淀脂质体是一种生物可降解的包覆锰离子沉淀的脂质体，由含锰离子的微沉淀内核和磷脂双分子层外壳组成，其中，磷脂双分子层外壳带有正电荷，
体内生物相容性较好，可以更容易被细胞内吞；在偏酸性的环境中，脂质体缓慢降解并释放
锰离子。
体内生物相容性较好，可以更容易被细胞内吞；在偏酸性的环境中，脂质体缓慢降解并释放
锰离子。
[0006] 所述锰离子为二价锰离子，含锰离子的微沉淀内核选自下列化合物中的一种或多种：磷酸锰、磷酸氢锰、碳酸锰、草酸锰等。
[0007] 所述磷脂双分子层外壳由磷脂材料和胆固醇组成，磷脂材料可选自以下材料中的一种或几种：DOPA(二油酰磷脂酸)、DOTAP((2,3‑二油氧基丙基)三甲基氯化铵)、DSPE‑PEG
(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇)等。在本发明的一些实施例中，磷脂双分子层中DOPA
的摩尔百分含量范围为20％‑80％，DOTAP的摩尔百分含量为8‑40％，胆固醇的摩尔百分含
量为8‑40％，DSPE‑PEG的摩尔百分含量为2‑20％。
(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇)等。在本发明的一些实施例中，磷脂双分子层中DOPA
的摩尔百分含量范围为20％‑80％，DOTAP的摩尔百分含量为8‑40％，胆固醇的摩尔百分含
量为8‑40％，DSPE‑PEG的摩尔百分含量为2‑20％。
[0008] 优选的，本发明所述含锰微沉淀脂质体是粒径为20‑200nm的纳米颗粒，与病毒颗粒的大小相差不大。该脂质体包含的微沉淀内核为生物可降解内核，可在pH值低于相应阴
离子所对应的pKa的环境中被溶解。该脂质体易经内吞方式进入细胞，进入细胞后在一定的
酸性环境中被降解，其锰离子微沉淀内核转变为二价锰离子而发挥胞内作用。
离子所对应的pKa的环境中被溶解。该脂质体易经内吞方式进入细胞，进入细胞后在一定的
酸性环境中被降解，其锰离子微沉淀内核转变为二价锰离子而发挥胞内作用。
[0009] 一方面，在不偶联靶向分子的情况下，该脂质体主要分布至肝脾骨等网状内皮组织，与病毒的体内分布情况大致相同，可用于抗病毒免疫或其他免疫相关疾病的治疗。该脂
质体可通过释放二价锰离子激活cGAS‑STING通路，提高cGAS对DNA的敏感性而实现刺激固
有免疫和/或适应性免疫的作用。该脂质体还可以作为免疫佐剂，包括激活T细胞活化和/或
抗体生产。
质体可通过释放二价锰离子激活cGAS‑STING通路，提高cGAS对DNA的敏感性而实现刺激固
有免疫和/或适应性免疫的作用。该脂质体还可以作为免疫佐剂，包括激活T细胞活化和/或
抗体生产。
[0010] 所述免疫相关疾病的治疗包括抗病毒、抗细菌和抗寄生虫等治疗。其中，所述病毒可以是DNA病毒和RNA病毒，例如：疱疹病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘
病毒科、冠状病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、乳头瘤病毒科、痘病毒科和逆转录病毒科，
特别是：单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、牛痘病毒、HIV和HBV。所述细菌可以是革兰氏阴性
菌和革兰氏阳性菌，例如：肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、沙门氏菌、脑膜炎双球菌、表皮葡萄
球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠
檬酸杆菌、绿脓假单胞菌和波美不动杆菌。所述寄生虫例如疟原虫、弓形虫、锥虫、血吸虫、
丝虫和利什曼原虫。
病毒科、冠状病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、乳头瘤病毒科、痘病毒科和逆转录病毒科，
特别是：单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、牛痘病毒、HIV和HBV。所述细菌可以是革兰氏阴性
菌和革兰氏阳性菌，例如：肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、沙门氏菌、脑膜炎双球菌、表皮葡萄
球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠
檬酸杆菌、绿脓假单胞菌和波美不动杆菌。所述寄生虫例如疟原虫、弓形虫、锥虫、血吸虫、
丝虫和利什曼原虫。
[0011] 所述免疫相关疾病的治疗还包括自身免疫性疾病的治疗，所述自身免疫性疾病包括但不限于I型糖尿病、银屑病、类风湿关节炎、系统红斑狼疮和多发性硬化。
[0012] 另一方面，可以在本发明所述脂质体的表面偶联靶向分子(参见图1)，使之在体内特异性地分布至肿瘤组织和肿瘤细胞，用于癌症治疗。所述靶向分子包括但不限于RGD肽序
列、叶酸、转铁蛋白等。
列、叶酸、转铁蛋白等。
[0013] 所述癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、肾癌、结直肠癌、胎盘绒毛膜癌、宫颈癌、睾丸癌、子宫癌和白
血病。
血病。
[0014] 本发明所述含锰微沉淀脂质体不易穿透血脑屏障，可以最大程度地减少锰离子的中枢神经毒性。
[0015] 本发明所述含锰微沉淀脂质体主要通过以下乳剂混合法(前三步)和薄膜分散法(后两步)联合制备得到：
[0016] 1)将含二价锰离子的化合物配制成一定浓度的水溶液，在超声情况下逐滴滴入一种油溶液中，并继续超声，使水滴被裂解并均匀分散在油相中，水相与油相的体积比为1:10
～1:1000之间；
～1:1000之间；
[0017] 2)将含阴离子(磷酸根、磷酸氢根、碳酸根和草酸根离子等)的化合物配制成水溶液，在超声情况下逐滴滴加进入一种油溶液中，并继续超声，使水滴被裂解并均匀分散在油
相中，水相与油相的体积比为1:10‑1:1000之间；
相中，水相与油相的体积比为1:10‑1:1000之间；
[0018] 3)将上述两种溶液混合后静置10‑60分钟，使锰离子与相应阴离子反应形成微沉淀，然后加入与油相溶液体积相当的第一有机溶剂破坏油相，离心得到锰离子微沉淀，溶于
第二有机溶剂中，其中所述第一有机溶剂能够溶解油相但不溶解锰离子微沉淀，而第二有
机溶剂为非极性有机溶剂；
第二有机溶剂中，其中所述第一有机溶剂能够溶解油相但不溶解锰离子微沉淀，而第二有
机溶剂为非极性有机溶剂；
[0019] 4)在含锰离子微沉淀的氯仿溶液中加入磷脂材料和胆固醇，转移至茄形瓶中，通过旋转蒸发仪挥掉有机溶液，形成一层脂膜；
[0020] 5)加入缓冲液或去离子水，40‑60℃下超声10‑60分钟即得含锰微沉淀脂质体。
[0021] 上述步骤1)中，所述含二价锰离子的化合物可溶于水，可选自下列化合物中的一种或多种：氯化锰、硝酸锰、硫酸锰等。优选的，将含二价锰离子的化合物配制成浓度为10～
5000mmol/L的水溶液。
5000mmol/L的水溶液。
[0022] 上述步骤1)中，所述油溶液是指与水不相容的溶液，可以选自下列油性溶剂中的一种或多种：环己烷、环戊烷、石油醚、苯等。在油溶液中添加一定量的非离子型表面活性剂
以促进乳化作用，帮助水相均匀分散于油相中，所述非离子型表面活性剂例如壬苯醇醚、烷
基酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、月桂醇聚氧乙烯醚等。优选的，所述油溶液与非离子
型表面活性剂的体积比为1.5～7.5。
以促进乳化作用，帮助水相均匀分散于油相中，所述非离子型表面活性剂例如壬苯醇醚、烷
基酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、月桂醇聚氧乙烯醚等。优选的，所述油溶液与非离子
型表面活性剂的体积比为1.5～7.5。
[0023] 上述步骤2)中，所述阴离子能与二价锰离子形成沉淀，如磷酸根离子、磷酸氢根离子、碳酸根离子和草酸根离子等。所述含阴离子的化合物能溶于水，通常是碱金属盐，包括
但不限于：磷酸氢钠、磷酸钠、碳酸钠、草酸钠。优选的，将所述含阴离子的化合物配制成浓
度为1～500mmol/L的水溶液，滴入与步骤1)相同的油溶液中。
但不限于：磷酸氢钠、磷酸钠、碳酸钠、草酸钠。优选的，将所述含阴离子的化合物配制成浓
度为1～500mmol/L的水溶液，滴入与步骤1)相同的油溶液中。
[0024] 上述步骤3)中，所述第一有机溶剂优选为醇类或醚类有机溶剂，例如甲醇、乙醇、丙醇和乙醚等，优先选择乙醇。所述第二有机溶剂优选为易挥发的非极性有机溶剂，例如氯
仿、二氯甲烷、四氯化碳、溴乙烷、苯、环己烷、己烷、乙醚、异丙醚和乙酸乙酯等，优先选择氯
仿。更优选的，将锰离子微沉淀溶于氯仿中的浓度为1～100mmol/L。
仿、二氯甲烷、四氯化碳、溴乙烷、苯、环己烷、己烷、乙醚、异丙醚和乙酸乙酯等，优先选择氯
仿。更优选的，将锰离子微沉淀溶于氯仿中的浓度为1～100mmol/L。
[0025] 上述步骤4)中，采用偶联了靶向分子的磷脂材料，可以制备外表面带有靶向分子的能特异性分布的含锰微沉淀脂质体。
[0026] 本发明所提供的含有锰离子微沉淀的脂质体具有以下优点：
[0027] 1、该脂质体可以作为一个二价锰离子的纳米储库，在组织或细胞内偏酸性的环境中降解并释放出游离的锰离子；
[0028] 2、该脂质体在体内经静脉注射后主要分布于肝脾骨等网状内皮组织，与病毒的分布基本一致，可用于抗病毒免疫；
[0029] 3、该脂质体可经表面靶向修饰后特异性地分布至靶组织或靶细胞，用于抗肿瘤治疗；
[0030] 4、该脂质体不易跨过血脑屏障，可以最大程度降低锰离子的中枢神经毒性。
[0031] 综上，本发明的含锰微沉淀脂质体可刺激固有免疫系统和/或适应性免疫或者作为免疫佐剂，用于抗病毒、抗细菌、抗肿瘤和自身免疫性疾病等相关疾病的治疗。
附图说明
[0032] 图1.本发明含锰微沉淀脂质体(NanoMn)的结构示意图。
[0033] 图2.实施例1制备的含磷酸氢锰脂质体的透射电镜图，标尺：50nm。
[0034] 图3.实施例1制备的含磷酸氢锰脂质体的粒径分布图(a)和表面电位的测定结果(b)。
[0035] 图4.实施例7中含磷酸氢锰脂质体Mn2+的体外渗漏与释放曲线。
[0036] 图5.实施例8获得的含磷酸氢锰脂质体在体内的组织分布情况。
[0037] 图6.实施例9用含磷酸氢锰脂质体激活宿主细胞抗病毒感染能力实验结果。NanoMn处理激活宿主细胞抗病毒感染能力在12小时达到峰值。
[0038] 图7.实施例10含磷酸氢锰脂质体与MnCl2激活宿主细胞抗病毒感染能力对比实验结果。NanoMn处理激活宿主细胞抗病毒感染能力强于MnCl2，cGas敲除后效应明显降低。
[0039] 图8.实施例11中含磷酸氢锰脂质体与MnCl2处理树突状细胞后基因差异表达分析结果。NanoMn处理显著上调树突状细胞细胞成熟相关分子。。
[0040] 图9.实施例11中含磷酸氢锰脂质体与MnCl2处理树突状细胞后T细胞激活共刺激分子和效应因子的表达情况。NanoMn处理显著上调树突状细胞的T细胞激活共刺激分子和
效应因子。
效应因子。
[0041] 图10.实施例11中含磷酸氢锰脂质体与MnCl2处理树突状细胞的GO功能分析结果，NanoMn处理显著上调树突状细胞的抗病毒、抗肿瘤生物学过程。
[0042] 图11.实施例11中含磷酸氢锰脂质体与MnCl2处理树突状细胞后Reactome信号通路分析结果，NanoMn处理显著上调树突状细胞的抗病毒、抗肿瘤信号通路。
[0043] 图12.实施例12含磷酸氢锰脂质体与MnCl2对肿瘤生长的抑制实验结果：B16F10移植瘤小鼠NanoMn处理后，肿瘤生长受到抑制。
[0044] 图13.实施例13含磷酸氢锰脂质体与MnCl2对肿瘤转移的抑制实验结果：B16F10转移瘤小鼠经NanoMn处理后，肺转移结节受到抑制。
[0045] 图14.实施例15中不同Mn2+处理对抗VSV‑GFP病毒感染Hela细胞的显微镜分析和流式细胞仪分析图。
[0046] 图15.实施例15中不同Mn2+处理对抗VSV‑GFP病毒感染Hela细胞的病毒抑制率。
[0047] 图16.实施例15中不同Mn2+处理HeLa细胞诱导干扰素IFNβ和OASL1基因的表达水平：a.IFNβmRNA的表达水平；b.OASL1 mRNA的表达水平。
[0048] 图17.实施例15中不同Mn2+处理对抗不同病毒感染Hela细胞，病毒在宿主细胞中的mRNA的表达水平。
[0049] 图18.实施例16中不同Mn2+处理小鼠36h后，血液中ALT、AST等急性组织损伤的临床指标水平。
[0050] 图19.实施例17中GO基因组的GSEA分析不同Mn2+处理的小鼠肝脏基因表达的差异。
[0051] 图20.实施例17中GSEA结合GO基因富集分析不同Mn2+处理的小鼠肝脏基因表达的RNA‑seq图以及qPCR方法检测IFNβ和IRF7基因在肝脏中的表达水平：a.RNA‑seq；b.IFNβ
mRNA在肝脏中的表达水平；c.IRF7 mRNA在肝脏中的表达水平。
mRNA在肝脏中的表达水平；c.IRF7 mRNA在肝脏中的表达水平。
[0052] 图21.实施例17中通过GO数据库对经NanoMn处理的肝脏与经Vehicle处理的肝脏中上调的差异表达基因进行富集分析。
[0053] 图22.实施例18中C57BL/6小鼠经不同Mn2+处理后感染致死剂量的MHV‑A59病毒的生存曲线图：a.处理方式示意图；b.小鼠生存曲线图。
[0054] 图23.实施例18中C57BL/6小鼠经不同Mn2+处理后感染致死剂量的MHV‑A59病毒的体重变化图。
[0055] 图24.实施例18中C57BL/6小鼠经不同Mn2+处理后感染致死剂量的MHV‑A59病毒，qRT‑PCR方法检测肝脾MHV‑N基因的表达水平：a.肝脏MHV‑N mRNA的表达水平；b.脾脏MHV‑N
mRNA的表达水平。
mRNA的表达水平。
[0056] 图25.实施例19中C57BL/6小鼠感染致死剂量的MHV‑A59病毒后经不同Mn2+处理的生存曲线图：a.处理方式示意图；b.小鼠生存曲线图。
[0057] 图26.实施例19中C57BL/6小鼠感染致死剂量的MHV‑A59病毒后经不同Mn2+处理，qRT‑PCR方法检测肝脾MHV‑N基因的表达水平：a.肝脏MHV‑N mRNA的表达水平；b.脾脏MHV‑N
mRNA的表达水平。
mRNA的表达水平。
[0058] 图27.实施例19中利用GO数据库对NanoMn与Vehicle组小鼠表达上调的差异表达2+
基因进行富集分析图以及未感染或不同Mn 处理的感染小鼠代谢相关基因表达水平的热
图：a.GO数据库富集分析图；b.不同处理下小鼠代谢相关基因表达水平的热图。
基因进行富集分析图以及未感染或不同Mn 处理的感染小鼠代谢相关基因表达水平的热
图：a.GO数据库富集分析图；b.不同处理下小鼠代谢相关基因表达水平的热图。
[0059] 图28.实施例19中C57BL/6小鼠感染致死剂量的MHV‑A59病毒后经不同Mn2+处理，脾脏重量、脾脏淋巴细胞数以及脾脏实物图：a.脾脏重量图；b.脾脏淋巴细胞数；c.脾脏实物
图。
图。
[0060] 图29.实施例19中C57BL/6小鼠感染致死剂量的MHV‑A59病毒后，淋巴细胞(LY)和单核细胞(MO)的百分比和细胞计数：a.淋巴细胞(LY)的百分比和细胞计数；b.单核细胞
(MO)的百分比和细胞计数。
(MO)的百分比和细胞计数。
[0061] 图30.实施例20中C57BL/6小鼠感染非致死剂量的MHV‑A59病毒后，经不同Mn2+处理，感染后第14天再次感染致死剂量的MHV‑A59病毒的小鼠生存曲线图：a.处理方式示意
图；b.小鼠生存曲线图。
图；b.小鼠生存曲线图。
[0062] 图31.实施例20中C57BL/6小鼠感染非致死剂量的MHV‑A59病毒后，经不同Mn2+处理，感染后第14天再次感染致死剂量的MHV‑A59病毒，小鼠肝脏MHV‑N mRNA的表达水平。
[0063] 图32.实施例20中C57BL/6小鼠感染非致死剂量的MHV‑A59病毒后，经不同Mn2+处+ hi +
理，流式细胞仪检测小鼠肝脾CD8记忆T细胞(CD8CD44 CD62L)的百分率：a.流式细胞图；
+ hi +
b.小鼠肝脾CD8记忆T细胞(CD8CD44 CD62L)的百分率。
理，流式细胞仪检测小鼠肝脾CD8记忆T细胞(CD8CD44 CD62L)的百分率：a.流式细胞图；
+ hi +
b.小鼠肝脾CD8记忆T细胞(CD8CD44 CD62L)的百分率。
[0064] 图33.实施例20中C57BL/6小鼠感染非致死剂量的MHV‑A59病毒后，经不同Mn2+处+ + + +
理，再次感染致死剂量的MHV‑A59病毒，流式细胞仪检测小鼠肝脏CD8CD25 和CD4 CD25 细
+ + + +
胞百分率：a.流式细胞图；b.小鼠肝脏CD8CD25和CD4CD25细胞百分率。
理，再次感染致死剂量的MHV‑A59病毒，流式细胞仪检测小鼠肝脏CD8CD25 和CD4 CD25 细
+ + + +
胞百分率：a.流式细胞图；b.小鼠肝脏CD8CD25和CD4CD25细胞百分率。
[0065] 图34.实施例20中C57BL/6小鼠感染非致死剂量的MHV‑A59病毒后，经不同Mn2+处+ + + +
理，再次感染致死剂量的MHV‑A59病毒，小鼠肝脾CD8 、CD4、B220 细胞百分率以及脾脏CD8
hi + hi + + + +
CD44 和CD4CD44 细胞中CD25 细胞的百分比：a.小鼠肝脾CD8、CD4、B220流式细胞图及
+ hi + hi +
百分率统计图；b.小鼠脾脏CD8CD44 和CD4 CD44 细胞中CD25 细胞流式细胞图及百分率
统计图。
理，再次感染致死剂量的MHV‑A59病毒，小鼠肝脾CD8 、CD4、B220 细胞百分率以及脾脏CD8
hi + hi + + + +
CD44 和CD4CD44 细胞中CD25 细胞的百分比：a.小鼠肝脾CD8、CD4、B220流式细胞图及
+ hi + hi +
百分率统计图；b.小鼠脾脏CD8CD44 和CD4 CD44 细胞中CD25 细胞流式细胞图及百分率
统计图。
[0066] 图35.实施例20中C57BL/6小鼠感染非致死剂量的MHV‑A59病毒后，经不同Mn2+处理，再次感染致死剂量的MHV‑A59病毒，用100ng/mL PMA和500ng/mL离子霉素处理小鼠肝脾
+ +
淋巴细胞5h，流式细胞仪检测CD8和CD4细胞产生肿瘤坏死因子TNFα和干扰素IFNγ的百分
+ +
比：a.小鼠肝脏CD8和CD4细胞产生肿瘤坏死因子TNFα和干扰素IFNγ的流式细胞图及百分
+ +
率统计图；b.小鼠脾脏CD8和CD4细胞产生肿瘤坏死因子TNFα和干扰素IFNγ的流式细胞图
及百分率统计图。
+ +
淋巴细胞5h，流式细胞仪检测CD8和CD4细胞产生肿瘤坏死因子TNFα和干扰素IFNγ的百分
+ +
比：a.小鼠肝脏CD8和CD4细胞产生肿瘤坏死因子TNFα和干扰素IFNγ的流式细胞图及百分
+ +
率统计图；b.小鼠脾脏CD8和CD4细胞产生肿瘤坏死因子TNFα和干扰素IFNγ的流式细胞图
及百分率统计图。
[0067] 图36.实施例20中C57BL/6小鼠皮下接种感染非致死剂量的MHV‑A59病毒后，经不2+
同Mn 处理，感染后第14天再次腹腔注射感染致死剂量的MHV‑A59病毒的小鼠体重变化以及
血清IgG浓度：a.处理方式示意图；b.小鼠体重变化图；c.小鼠血清IgG浓度。
同Mn 处理，感染后第14天再次腹腔注射感染致死剂量的MHV‑A59病毒的小鼠体重变化以及
血清IgG浓度：a.处理方式示意图；b.小鼠体重变化图；c.小鼠血清IgG浓度。
具体实施方式
[0068] 以下通过实施例进一步说明和解释本发明，但不作为本发明进行的限制。
[0069] 实施例1、含有磷酸氢锰脂质体的制备
[0070] 将氯化锰配制成500mM的水溶液，在超声情况下将300μL的该溶液逐滴加入15mL的环己烷/壬苯醇醚混合油溶液(70/30，v/v)中，并继续超声，使水滴被裂解并均匀分散在油
相中；
相中；
[0071] 将磷酸氢钠配制成25mM的水溶液，在超声情况下将300μL的该溶液逐滴加入15mL的环己烷/壬苯醇醚混合油溶液(70/30，v/v)中，并继续超声，使水滴被裂解并均匀分散在
油相中，然后加入200μl 20mg/mL的DOPA氯仿溶液；
油相中，然后加入200μl 20mg/mL的DOPA氯仿溶液；
[0072] 将上述两种溶液混合静置30分钟，使锰离子与磷酸氢根离子反应形成微沉淀，然后加入与油相溶液体积相当的乙醇破坏油相，离心得到磷酸氢锰微沉淀，用乙醇洗2‑3次
后，溶于1mL氯仿中；
后，溶于1mL氯仿中；
[0073] 在上述得到的含磷酸氢锰微沉淀(7.5mM)的氯仿溶液中加100μL DOTAP(10mM)、胆固醇(10mM)和DSPE‑PEG(3mM)，转移至茄形瓶中，通过旋转蒸发仪挥掉有机溶液，形成一层
脂膜；最后加入800μL去离子水，50℃下超声30分钟即得。
脂膜；最后加入800μL去离子水，50℃下超声30分钟即得。
[0074] 所制备的含磷酸氢锰脂质体(NanoMn)透射电镜如图2所示，激光粒径仪测得的粒径和表面电位如图3所示。
[0075] 实施例2、含有磷酸锰脂质体的制备
[0076] 将氯化锰配制成1M的水溶液，在超声情况下将600μL的该溶液逐滴加入30mL的环己烷/壬苯醇醚混合油溶液(70/30，v/v)中，并继续超声，使水滴被裂解并均匀分散在油相
中；
中；
[0077] 将磷酸钠配制成50mM的水溶液，在超声情况下将600μL的该溶液逐滴加入30mL的环己烷/壬苯醇醚混合油溶液(70/30，v/v)中，并继续超声，使水滴被裂解并均匀分散在油
相中，然后加入200μL 20mg/mL的DOPA氯仿溶液；
相中，然后加入200μL 20mg/mL的DOPA氯仿溶液；
[0078] 将上述两种溶液混合静置30分钟，使锰离子与磷酸根离子反应形成微沉淀，然后加入与油相溶液体积相当的乙醇破坏油相，离心得到磷酸锰微沉淀，用乙醇洗2‑3次后，溶
于2mL氯仿中；
于2mL氯仿中；
[0079] 在上述得到的含磷酸锰微沉淀(15mM)的氯仿溶液中加200μL DOTAP(10mM)、胆固醇(10mM)和DSPE‑PEG(3mM)，转移至茄形瓶中，通过旋转蒸发仪挥掉有机溶液，形成一层脂
膜；最后加入1mL去离子水，45℃下超声40分钟即得。
膜；最后加入1mL去离子水，45℃下超声40分钟即得。
[0080] 实施例3、含有碳酸锰脂质体的制备
[0081] 将氯化锰配制成500mM的水溶液，在超声情况下将300μL的该溶液逐滴加入15mL的环己烷/壬苯醇醚混合油溶液(70/30，v/v)中，并继续超声，使水滴被裂解并均匀分散在油
相中；
相中；
[0082] 将碳酸钠配制成25mM的水溶液，在超声情况下将300μL的该溶液逐滴加入15mL的环己烷/壬苯醇醚混合油溶液(70/30，v/v)中，并继续超声，使水滴被裂解并均匀分散在油
相中，然后加入200μL 20mg/mL的DOPA氯仿溶液；
相中，然后加入200μL 20mg/mL的DOPA氯仿溶液；
[0083] 将上述两种溶液混合静置30分钟，使锰离子与碳酸根离子反应形成微沉淀，然后加入与油相溶液体积相当的乙醇破坏油相，离心得到碳酸锰微沉淀，用乙醇洗2‑3次后，溶
于1mL氯仿中；
于1mL氯仿中；
[0084] 在上述得到的含碳酸锰微沉淀(7.5mM)的氯仿溶液中加100μL DOTAP(10mM)、胆固醇(10mM)和DSPE‑PEG(3mM)，转移至茄形瓶中，通过旋转蒸发仪挥掉有机溶液，形成一层脂
膜；最后加入1mL去离子水，60℃下超声20分钟即得。
膜；最后加入1mL去离子水，60℃下超声20分钟即得。
[0085] 实施例4、含有草酸锰脂质体的制备
[0086] 将氯化锰配制成300mM的水溶液，在超声情况下将200μL的该溶液逐滴加入10mL的环己烷/壬苯醇醚混合油溶液(70/30，v/v)中，并继续超声，使水滴被裂解并均匀分散在油
相中；
相中；
[0087] 将草酸钠配制成20mM的水溶液，在超声情况下将200μL的该溶液逐滴加入10mL的环己烷/壬苯醇醚混合油溶液(70/30，v/v)中，并继续超声，使水滴被裂解并均匀分散在油
相中，然后加入200μL 20mg/mL的DOPA氯仿溶液；
相中，然后加入200μL 20mg/mL的DOPA氯仿溶液；
[0088] 将上述两种溶液混合静置30分钟，使锰离子与草酸根离子反应形成微沉淀，然后加入与油相溶液体积相当的乙醇破坏油相，离心得到草酸锰微沉淀，用乙醇洗2‑3次后，溶
于1mL氯仿中；
于1mL氯仿中；
[0089] 在上述得到的含草酸锰微沉淀(7.5mM)的氯仿溶液中加100μL DOTAP(10mM)、胆固醇(10mM)和DSPE‑PEG(3mM)，转移至茄形瓶中，通过旋转蒸发仪挥掉有机溶液，形成一层脂
膜；最后加入800μL去离子水，50℃下超声50分钟即得。
膜；最后加入800μL去离子水，50℃下超声50分钟即得。
[0090] 实施例5、含磷酸氢锰脂质体的透射电镜图
[0091] 取实施例1中制备的含磷酸氢锰脂质体，用去离子水稀释10倍，通过透射电镜(JEM‑200X,JEOL,Japan)观察其结构。将稀释好的样品在室温下恒温30min后，滴加在渡碳
膜的铜网上，待水分挥干后直接装入JEM‑200X透射电镜，加速电压为80kv，观察粒径和形
态，如图2所示，所述含磷酸氢锰脂质体为球形，粒径约为10～40nm。
膜的铜网上，待水分挥干后直接装入JEM‑200X透射电镜，加速电压为80kv，观察粒径和形
态，如图2所示，所述含磷酸氢锰脂质体为球形，粒径约为10～40nm。
[0092] 实施例6、含磷酸氢锰脂质体的粒径和表面电位的测定
[0093] 取实施例1中制备的含有磷酸氢锰脂质体，用激光粒度仪(Zetasizer，美国PSS)分别用粒径杯和电位杯测定25℃时的粒径和电位。每次装入样品池后测量前平衡1分钟。测定
结果如图3所示，粒径分布大部分位于30‑50nm，电位约‑2.3mV。
结果如图3所示，粒径分布大部分位于30‑50nm，电位约‑2.3mV。
[0094] 实施例7、含有磷酸氢锰微沉淀的脂质体Mn2+的体外释放
[0095] 为了研究NanoMn对pH敏感的释放，我们在不同的pH条件下进行了典型的实验。将2mL NanoMn悬浮液(8mM)加入透析袋(截留分子量：8000～14000)。将含NanoMn的不同透析
袋分别浸入10mL不同pH(4.5、6.5、7.4)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃以40rpm的速度摇动。
在预定的时间点(5min、15min、1h、2h、4h和24h)，每次提取200μL的样品，并用相同体积的新
2+ 2+
鲜培养基替换。每个样品进一步测定Mn 浓度，绘制Mn 累积释放曲线。
袋分别浸入10mL不同pH(4.5、6.5、7.4)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃以40rpm的速度摇动。
在预定的时间点(5min、15min、1h、2h、4h和24h)，每次提取200μL的样品，并用相同体积的新
2+ 2+
鲜培养基替换。每个样品进一步测定Mn 浓度，绘制Mn 累积释放曲线。
[0096] Mn2+的体外渗漏与释放曲线如图4所示，表明NanoMn以pH依赖的方式持续释放Mn2+ 2+ 2+
。在pH值为4.5和6.5时，NanoMn的Mn 累积释放率远高于pH值为7.4时的Mn 累积释放率(pH
值为4.5时高于90％，pH值为7.4时低于10％)。
。在pH值为4.5和6.5时，NanoMn的Mn 累积释放率远高于pH值为7.4时的Mn 累积释放率(pH
值为4.5时高于90％，pH值为7.4时低于10％)。
[0097] 实施例8、含有磷酸氢锰微沉淀的脂质体在体内的组织分布
[0098] 为了研究含有磷酸氢锰微沉淀的脂质体给药后在体内的分布，制备DiR近红外荧光染料标记的脂质体，其制备方法参照实施例1，在最后加入脂质材料时一并加入DiR染料
(每毫升微沉淀氯仿溶液中加50μL浓度为0.1mg/mL的DiR染料)，其余步骤与实施例1完全一
致。
(每毫升微沉淀氯仿溶液中加50μL浓度为0.1mg/mL的DiR染料)，其余步骤与实施例1完全一
致。
[0099] 取6‑8周Balb/c小白鼠，分别向小鼠尾静脉内注射200μL/40μL/8μL的近红外染料DiR荧光标记的磷酸氢锰脂质体溶液，在给药后24小时，利用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖收
集心、肝、脾、肺、肾、脑和胸腺主要组织器官，置于小动物活体成像仪下进行成像观察，激发
光波长设置为720nm，发射光波长设置为780nm。制备的含磷酸氢锰微沉淀脂质体在小鼠体
内的组织分布如图5所示，主要分布于肝和脾，少量分布于肺(彩色图转为黑白图有些改变，
此结论依据原始图得出)。
集心、肝、脾、肺、肾、脑和胸腺主要组织器官，置于小动物活体成像仪下进行成像观察，激发
光波长设置为720nm，发射光波长设置为780nm。制备的含磷酸氢锰微沉淀脂质体在小鼠体
内的组织分布如图5所示，主要分布于肝和脾，少量分布于肺(彩色图转为黑白图有些改变，
此结论依据原始图得出)。
[0100] 实施例9、含有磷酸氢锰微沉淀的脂质体激活宿主细胞IFNβ产生时间梯度实验
[0101] 为了研究NanoMn刺激宿主细胞产生IFNβ随着时间的变化情况，收集不同时间段NanoMn处理的宿主细胞，检测IFNβ表达。
[0102] 24孔板铺iBMDM细胞，长至70‑80％汇合度加入200μM NanoMn分别处理iBMDM细胞0h,6h,12h,24h,36h以及48h，然后收集细胞，TRIzol法提取RNA，逆转录，随后进行qRT‑PCR，
检测IFNβmRNA表达水平。如图6所示，结果表明，在12小时，宿主细胞产生IFNβ达到峰值。
检测IFNβmRNA表达水平。如图6所示，结果表明，在12小时，宿主细胞产生IFNβ达到峰值。
[0103] 实施例10、比较含有磷酸氢锰微沉淀的脂质体和MnCl2激活宿主细胞IFNβ产生实验
[0104] 为了比较NanoMn和MnCl2激活宿主细胞IFNβ产生水平的差异，取小鼠原代树突状细胞，NanoMn和MnCl2分别200μM处理12小时。收集细胞，提取RNA，进行qRT‑PCR，检测IFNβ表
达量。
达量。
[0105] 取6‑8周C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，于1640培养基培养，加入集落刺激因子GM‑CSF以及白介素IL‑4诱导骨髓细胞向骨髓树突状细胞(BMDC)分化。第4天更换培养基
并且补充诱导因子。第7天加入脂多糖过夜，刺激树突状细胞成熟。12h后将成熟树突状细胞
从培养皿吹下(树突状细胞为半贴壁状态)。随后NanoMn和MnCl2处理方法同实施例9，处理
时间12h。qRT‑PCR检测IFNβmRNA表达水平。如图7所示，结果表明，相对于对照组即Vehicle
和NanoCa，NanoMn和MnCl2能明显刺激树突状细胞表达IFNβ，而且NanoMn强于MnCl2，接近2
倍。
并且补充诱导因子。第7天加入脂多糖过夜，刺激树突状细胞成熟。12h后将成熟树突状细胞
从培养皿吹下(树突状细胞为半贴壁状态)。随后NanoMn和MnCl2处理方法同实施例9，处理
时间12h。qRT‑PCR检测IFNβmRNA表达水平。如图7所示，结果表明，相对于对照组即Vehicle
和NanoCa，NanoMn和MnCl2能明显刺激树突状细胞表达IFNβ，而且NanoMn强于MnCl2，接近2
倍。
[0106] 为了验证NanoMn和MnCl2是否都是通过cGAS‑STING通路产生IFNβ，发挥生物学作用。同样在cGAS敲除小鼠诱导树突状细胞，NanoMn和MnCl2处理后检测IFNβmRNA表达水平。
如图7所示，结果表明，无论NanoMn还是MnCl2，刺激树突状细胞产生IFNβ能力均显著下调。
表明两者均依赖cGAS‑STING通路产生IFNβ。
如图7所示，结果表明，无论NanoMn还是MnCl2，刺激树突状细胞产生IFNβ能力均显著下调。
表明两者均依赖cGAS‑STING通路产生IFNβ。
[0107] 实施例11、RNA‑Seq比较含有磷酸氢锰微沉淀的脂质体和MnCl2刺激宿主细胞差异基因表达实验
[0108] 为了分析NanoMn和MnCl2激活宿主细胞IFNβ能力差异的原因。取小鼠原代树突状细胞，NanoMn和MnCl2分别200μM处理12小时。收集细胞，进行RNA‑Seq。
[0109] C57BL/6小鼠原代树突状细胞诱导及处理同实施例10。收集细胞后，于TRIzol吹打至完全溶解，冻‑80℃，进行转录组测序。结果如图8所示，基因差异表达分析发现，相比于对
照组树突状细胞细胞成熟相关分子在NanoMn和MnCl2处理后显著上调。表明NanoMn和MnCl2
可能促进树突状细胞成熟，进而增强树突状细胞抗原呈递，最终诱导效应T细胞，发挥抗感
染、抗肿瘤作用。另外，相比于MnCl2，NanoMn在多数基因作用更加明显，表明NanoMn具有更
强的优势。而且，T细胞激活共刺激分子、效应因子在NanoMn处理后显著升高，并且高于
MnCl2组(图9)。表明NanoMn具有更强激活效应T细胞发挥抗感染、抗肿瘤作用的能力。
照组树突状细胞细胞成熟相关分子在NanoMn和MnCl2处理后显著上调。表明NanoMn和MnCl2
可能促进树突状细胞成熟，进而增强树突状细胞抗原呈递，最终诱导效应T细胞，发挥抗感
染、抗肿瘤作用。另外，相比于MnCl2，NanoMn在多数基因作用更加明显，表明NanoMn具有更
强的优势。而且，T细胞激活共刺激分子、效应因子在NanoMn处理后显著升高，并且高于
MnCl2组(图9)。表明NanoMn具有更强激活效应T细胞发挥抗感染、抗肿瘤作用的能力。
[0110] GO功能分析发现，相比于MnCl2，NanoMn抗病毒、抗肿瘤生物学过程更加富集；Reactome信号通路分析发现，相比于MnCl2，NanoMn抗病毒、抗肿瘤信号通路更加富集(图
10，图11)。这些结果表明相比于MnCl2，NanoMn在抗病毒、抗肿瘤过程具有更强作用。
10，图11)。这些结果表明相比于MnCl2，NanoMn在抗病毒、抗肿瘤过程具有更强作用。
[0111] 实施例12、B16F10黑色素瘤小鼠移植瘤实验
[0112] 为了验证相比于MnCl2，NanoMn在抗肿瘤过程具有更强作用。于C57BL/6小鼠制作小鼠移植瘤模型，分别进行NanoMn和MnCl2处理，观察肿瘤生长情况。
[0113] 取6‑8周C57BL/6小鼠，背部皮下接种5×105B16F10黑色素瘤细胞。分别在第3、7、11天腹腔注射3μg/g NanoMn或者MnCl2。观察肿瘤生长，发现NanoMn组肿瘤生长相对于MnCl2
组缓慢，表明NanoMn可能具有更强抑制肿瘤作用。结果如图12所示。
组缓慢，表明NanoMn可能具有更强抑制肿瘤作用。结果如图12所示。
[0114] 实施例13、B16F10黑色素瘤小鼠转移瘤实验
[0115] 为了验证相比于MnCl2，NanoMn在抗肿瘤过程具有更强作用。于C57BL/6小鼠制作小鼠转移瘤模型，分别进行NanoMn和MnCl2处理，观察小鼠肺部转移结节生长情况。
[0116] 取6‑8周C57BL/6小鼠，尾静脉注射1×106B16F10黑色素瘤细胞。分别在第5、10天腹腔注射20μg/g NanoMn或者MnCl2。21天后解剖小鼠，观察肺部肿瘤转移结节。发现相比于
MnCl2组，NanoMn组几乎没有转移结节。结果如图13所示，表明NanoMn可能具有更强抑制肿
瘤转移作用。
MnCl2组，NanoMn组几乎没有转移结节。结果如图13所示，表明NanoMn可能具有更强抑制肿
瘤转移作用。
[0117] 实施例15、NanoMn对病毒感染的抑制作用
[0118] 为了研究NanoMn对病毒感染的抑制作用，用不同浓度的NanoMn处理HeLa细胞，以MnCl2和Vehicle为对照，再用0.01MOI表达绿色荧光蛋白(GFP)的水泡性口炎病毒(VSV‑
GFP)感染Hela细胞16h，对细胞进行显微镜分析和流式细胞仪分析(图14)，并用GFP阳性细
2+
胞相对未处理对照的百分比计算EC50(图15)，观察NanoMn对病毒感染的疗效。与游离Mn
(EC50＝71.67μM)相比，NanoMn处理对病毒复制的抑制作用更强(EC50＝3.897μM)。
GFP)感染Hela细胞16h，对细胞进行显微镜分析和流式细胞仪分析(图14)，并用GFP阳性细
2+
胞相对未处理对照的百分比计算EC50(图15)，观察NanoMn对病毒感染的疗效。与游离Mn
(EC50＝71.67μM)相比，NanoMn处理对病毒复制的抑制作用更强(EC50＝3.897μM)。
[0119] 用10μM MnCl2或NanoMn处理HeLa细胞指定小时。采用定量逆转录聚合酶链反应检测干扰素IFNβ和OASL1基因的表达水平。与抗病毒作用类似，NanoMn处理比MnCl2处理诱导
更强的I型干扰素反应(图16)。
更强的I型干扰素反应(图16)。
[0120] 用10μM MnCl2、NanoMn或PBS处理HeLa细胞。同时用0.01MOI图示病毒感染细胞24h。用qRT‑PCR方法检测病毒RNA的表达水平。如图17所示，NanoMn显示出广谱的抗病毒作
用，并抑制冠状病毒MHV‑A59和其他病毒在宿主细胞中的复制。数据表明，NanoMn触发宿主
干扰素反应，限制病毒传播。
用，并抑制冠状病毒MHV‑A59和其他病毒在宿主细胞中的复制。数据表明，NanoMn触发宿主
干扰素反应，限制病毒传播。
[0121] 实施例16、NanoMn对器官的急性毒性
[0122] 为探讨NanoMn对器官的急性毒性作用，我们分析了NanoMn、MnCl2和Vehicle处理36h后小鼠血液中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)等急性组织损伤的临床指标。
C57BL/6小鼠静脉注射1.8mM/kg MnCl2、NanoMn或PBS。36小时后处死小鼠，采集血液进行血
液生化检测。如图18所示，与MnCl2引起的轻度肝毒性和心脏毒性相比，NanoMn处理对肝、肾
和心脏的功能参数水平几乎没有影响，表明该NanoMn对宿主主要器官没有明显的急性损
害。
C57BL/6小鼠静脉注射1.8mM/kg MnCl2、NanoMn或PBS。36小时后处死小鼠，采集血液进行血
液生化检测。如图18所示，与MnCl2引起的轻度肝毒性和心脏毒性相比，NanoMn处理对肝、肾
和心脏的功能参数水平几乎没有影响，表明该NanoMn对宿主主要器官没有明显的急性损
害。
[0123] 实施例17、NanoMn在网状内皮系统中触发干扰素反应
[0124] 为了测试NanoMn是否能在体内引起Ⅰ型干扰素反应，我们分析了NanoMn、氯化锰和Vehicle处理的小鼠肝脏的转录组。C57BL/6小鼠腹腔注射1.8mM/kg MnCl2、NanoMn或PbS。
18小时后，取小鼠肝脏进行RNA‑seq检测。如图19所示，用GO基因组的GSEA分析MnCl2和
NanoMn处理的小鼠肝脏基因表达的差异。ES是富集分数的缩写，NES表示归一化富集分数。
NanoMn处理的小鼠比MnCl2处理的小鼠检测到更高的干扰素信号相关基因的mRNA水平。此
外，与NanoMn不同的是，MnCl2处理触发了与离子跨膜转运蛋白相关的基因的上调。这可能
起到负反馈的作用，限制细胞对锰的吸收。随后的qPCR方法检测IFNβ和IRF7基因在肝脏中
的表达水平，进一步证实了这些结果(图20)。
18小时后，取小鼠肝脏进行RNA‑seq检测。如图19所示，用GO基因组的GSEA分析MnCl2和
NanoMn处理的小鼠肝脏基因表达的差异。ES是富集分数的缩写，NES表示归一化富集分数。
NanoMn处理的小鼠比MnCl2处理的小鼠检测到更高的干扰素信号相关基因的mRNA水平。此
外，与NanoMn不同的是，MnCl2处理触发了与离子跨膜转运蛋白相关的基因的上调。这可能
起到负反馈的作用，限制细胞对锰的吸收。随后的qPCR方法检测IFNβ和IRF7基因在肝脏中
的表达水平，进一步证实了这些结果(图20)。
[0125] 除了激活干扰素信号通路外，我们注意到NanoMn处理还增强了与抗原处理和提呈相关的信号传递(图21)。综上所述，我们的研究结果表明，实施例1中制备的NanoMn是无毒
的，可以在体内触发网状内皮系统的干扰素反应。
的，可以在体内触发网状内皮系统的干扰素反应。
[0126] 实施例18、NanoMn治疗可改善冠状病毒感染的治疗
[0127] 为了确定增强的干扰素应答是否能改善冠状病毒感染的治疗，分别给C57BL/6小鼠腹腔注射1.8mM/kg的NanoMn、MnCl2或Vehicle。24小时后，上述小鼠注射致死剂量的3×
5
10PFU的MHV‑A59。如图22所示，尽管MnCl2处理在一定程度上延长了病毒感染小鼠的存活时
间，但Vehicle或MnCl2处理的小鼠均在病毒感染后8天内死亡。值得注意的是，超过一半的
NanoMn预处理小鼠在这个过程中存活下来。
5
10PFU的MHV‑A59。如图22所示，尽管MnCl2处理在一定程度上延长了病毒感染小鼠的存活时
间，但Vehicle或MnCl2处理的小鼠均在病毒感染后8天内死亡。值得注意的是，超过一半的
NanoMn预处理小鼠在这个过程中存活下来。
[0128] 此外，在使用Vehicle或MnCl2而不是NanoMn预处理的小鼠中，检测到严重的体重减轻(图23)。另外，感染后第4天处死小鼠，取脾脏和肝脏。用qRT‑PCR方法检测MHV‑N基因的
表达水平。qRT‑PCR分析显示，NanoMn处理显著降低了肝和脾中的病毒滴度(图24)。因此，我
们的数据表明NanoMn治疗可以改善冠状病毒感染的治疗。
表达水平。qRT‑PCR分析显示，NanoMn处理显著降低了肝和脾中的病毒滴度(图24)。因此，我
们的数据表明NanoMn治疗可以改善冠状病毒感染的治疗。
[0129] 实施例19、NanoMn改善冠状病毒导致的组织损伤
[0130] 为了验证NanoMn对冠状病毒感染的治疗作用，我们用3×105PFU的MHV‑A59给C57BL/6小鼠腹腔注射。24小时后，分别腹腔注射1.8mM/kg的MnCl2、NanoMn或PBS。如图25所
示，与NanoMn预处理相似，感染后注射NanoMn也显著延长了感染冠状病毒的小鼠的生存时
间，而用Vehicle或MnCl2处理的其他小鼠在病毒感染后7天内死亡。
示，与NanoMn预处理相似，感染后注射NanoMn也显著延长了感染冠状病毒的小鼠的生存时
间，而用Vehicle或MnCl2处理的其他小鼠在病毒感染后7天内死亡。
[0131] 感染后第4天，取感染小鼠的脏器，用qRT‑PCR法检测各脏器中MHV‑N基因的表达水平。如图26所示，与Vehicle或MnCl2处理的小鼠相比，NanoMn处理限制了病毒在肝脏和脾脏
的繁殖。
的繁殖。
[0132] 为了全面分析NanoMn对冠状病毒感染的保护作用，我们采用RNA‑seq方法分析了病毒感染过程中肝组织的差异表达基因。C57BL/6小鼠腹腔注射感染MHV‑A59，感染后第4天
取小鼠肝脏，用于RNA‑seq分析。利用GO数据库(图27中a)对NanoMn与Vehicle组小鼠表达上
调的差异表达基因进行富集分析。热图(图27中b)显示未治疗或感染小鼠代谢相关基因的
表达水平。与Vehicle或MnCl2治疗的小鼠相比，NanoMn从受冠状病毒感染影响的代谢过程
相关途径中拯救了基因的表达。
取小鼠肝脏，用于RNA‑seq分析。利用GO数据库(图27中a)对NanoMn与Vehicle组小鼠表达上
调的差异表达基因进行富集分析。热图(图27中b)显示未治疗或感染小鼠代谢相关基因的
表达水平。与Vehicle或MnCl2治疗的小鼠相比，NanoMn从受冠状病毒感染影响的代谢过程
相关途径中拯救了基因的表达。
[0133] 此外，C57BL/6小鼠腹腔注射3×105PFU MHV‑A59，感染24h后腹腔注射1.8mM/kg的MnCl2、NanoMn或PBS。感染后第4天，取小鼠脾脏拍照并称重，并且分离脾脏淋巴细胞并计
数，用于统计分析。除肝脏外，我们还注意到NanoMn处理导致脾脏轻度肿大和脾细胞数量增
加(图28)。
数，用于统计分析。除肝脏外，我们还注意到NanoMn处理导致脾脏轻度肿大和脾细胞数量增
加(图28)。
[0134] 第0天，C57BL/6小鼠腹腔注射感染3×105PFU的MHV‑A59。24小时后，小鼠腹腔注射1.8mm/kg的MnCl2、NanoMn或PBS。于指定天数采集小鼠内眼角血，进行血常规检测。用淋巴
细胞(LY)和单核细胞(MO)的百分比和细胞计数进行统计分析。通过对血液中免疫细胞百分
率的分析，我们发现在冠状病毒感染过程中，NanoMn增加了血液中淋巴细胞和单核细胞的
数量(图29)。因此，数据表明，除了先天免疫反应外，宿主获得性免疫可能也参与了NanoMn
对冠状病毒感染的保护作用。
细胞(LY)和单核细胞(MO)的百分比和细胞计数进行统计分析。通过对血液中免疫细胞百分
率的分析，我们发现在冠状病毒感染过程中，NanoMn增加了血液中淋巴细胞和单核细胞的
数量(图29)。因此，数据表明，除了先天免疫反应外，宿主获得性免疫可能也参与了NanoMn
对冠状病毒感染的保护作用。
[0135] 实施例20、NanoMn作为疫苗佐剂增强宿主适应性免疫
[0136] 为了确定宿主获得性免疫是否也参与了冠状病毒感染，我们给C57BL/6小鼠腹腔4
注射感染非致死剂量的MHV‑A59(3×10PFU)，感染24小时后腹腔注射1.8mM/kg的NanoMn或
5
PBS。感染后第14天，再次腹腔感染致死剂量的MHV‑A59(3×10PFU)。如图30所示，初次病毒
感染2周后，我们用致死剂量的MHV‑A59再次攻击小鼠，所有病毒再次攻击的小鼠都存活了
下来。
注射感染非致死剂量的MHV‑A59(3×10PFU)，感染24小时后腹腔注射1.8mM/kg的NanoMn或
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PBS。感染后第14天，再次腹腔感染致死剂量的MHV‑A59(3×10PFU)。如图30所示，初次病毒
感染2周后，我们用致死剂量的MHV‑A59再次攻击小鼠，所有病毒再次攻击的小鼠都存活了
下来。
[0137] 此外，再次攻击后3天处死小鼠，采集肝、脾淋巴细胞进行流式细胞仪分析，qRT‑PCR分析显示，与初次感染病毒的小鼠相比，病毒再攻击小鼠的病毒滴度显著降低(图31)。
因此，我们的数据表明冠状病毒感染可以激发宿主的适应性免疫反应和免疫记忆的发生。
因此，我们的数据表明冠状病毒感染可以激发宿主的适应性免疫反应和免疫记忆的发生。
[0138] 为了研究NanoMn在适应性免疫调节中的作用，我们评估了非致死量病毒感染后第7天T细胞的发育。非致死剂量的MHV‑A59感染后第7天处死小鼠，收集脏器。分离脏器淋巴细
+ hi +
胞，流式细胞仪检测CD8记忆T细胞(CD8CD44 CD62L)的百分率。如图32所示，NanoMn处理
+ hi +
促进了肝和脾中CD8记忆T细胞(CD44 CD62L)的极化。
+ hi +
胞，流式细胞仪检测CD8记忆T细胞(CD8CD44 CD62L)的百分率。如图32所示，NanoMn处理
+ hi +
促进了肝和脾中CD8记忆T细胞(CD44 CD62L)的极化。
[0139] 为了进一步证实NanoMn对记忆T细胞功能的刺激作用，我们用致死剂量的MHV‑A59在有或没有NanoMn处理的情况下再次攻击病毒感染的小鼠。在再次感染MHV‑A59后的第3
+ + + +
天，处死小鼠，取感染小鼠的肝脏，分离淋巴细胞。流式细胞仪检测CD8CD25 和CD4CD25 细
+ +
胞百分率，进行统计学分析。如图33所示，NanoMn处理组小鼠肝脏中CD8CD25 (活化)T细胞
+ +
增多，CD4CD25(调节性)T细胞减少。
+ + + +
天，处死小鼠，取感染小鼠的肝脏，分离淋巴细胞。流式细胞仪检测CD8CD25 和CD4CD25 细
+ +
胞百分率，进行统计学分析。如图33所示，NanoMn处理组小鼠肝脏中CD8CD25 (活化)T细胞
+ +
增多，CD4CD25(调节性)T细胞减少。
[0140] 用CD8+、CD4+、B220+细胞百分率进行统计分析，另外统计分析脾脏CD8+CD44hi和CD4+ hi +
CD44 细胞中CD25细胞的百分比，我们发现与引起全身免疫反应的初次病毒感染不同，在
继发病毒感染期间，NanoMn的免疫刺激作用主要集中在肝脏而不是脾脏(图34)。
CD44 细胞中CD25细胞的百分比，我们发现与引起全身免疫反应的初次病毒感染不同，在
继发病毒感染期间，NanoMn的免疫刺激作用主要集中在肝脏而不是脾脏(图34)。
[0141] 再次攻击后第3天，从感染小鼠的肝脏分离淋巴细胞，用100ng/mL PMA和500ng/mL+ +
离子霉素处理小鼠肝脾淋巴细胞5h，流式细胞仪检测CD8和CD4细胞产生肿瘤坏死因子TNF
α和干扰素IFNγ。如图35所示，根据T细胞极化结果，NanoMn处理导致T细胞在肝脏而不是脾
+ +
脏产生更多的效应细胞因子(TNFαIFNγ)。因此，我们的数据表明NanoMn增强了对冠状病
毒的细胞免疫应答。
离子霉素处理小鼠肝脾淋巴细胞5h，流式细胞仪检测CD8和CD4细胞产生肿瘤坏死因子TNF
α和干扰素IFNγ。如图35所示，根据T细胞极化结果，NanoMn处理导致T细胞在肝脏而不是脾
+ +
脏产生更多的效应细胞因子(TNFαIFNγ)。因此，我们的数据表明NanoMn增强了对冠状病
毒的细胞免疫应答。
[0142] 为了确定NanoMn是否影响体液免疫，我们给C57BL/6小鼠皮下接种3×104PFU MHV‑A59和1.8mM/kg的NanoMn或PBS。初次病毒感染后第14天，小鼠腹腔注射感染致死剂量
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的3×10PFU的MHV‑A59。如图36所示，与腹腔注射相似，所有免疫小鼠均存活。通过体重分
析，NanoMn处理组与对照组相比显著降低了病毒毒性。更重要的是，相对于对照小鼠，
NanoMn处理提高了血清IgG浓度(图36)。综上所述，我们的数据表明NanoMn可以作为疫苗佐
剂来增强获得性免疫和保护宿主免受冠状病毒感染。
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的3×10PFU的MHV‑A59。如图36所示，与腹腔注射相似，所有免疫小鼠均存活。通过体重分
析，NanoMn处理组与对照组相比显著降低了病毒毒性。更重要的是，相对于对照小鼠，
NanoMn处理提高了血清IgG浓度(图36)。综上所述，我们的数据表明NanoMn可以作为疫苗佐
剂来增强获得性免疫和保护宿主免受冠状病毒感染。