USB1蛋白在调控植物抗旱性中的应用转让专利
申请号 : CN202010673335.5
文献号 : CN111647578B
文献日 : 2021-07-23
发明人 : 张大鹏 , 马宇 , 毕超
申请人 : 清华大学
摘要 :
本发明公开了USB1蛋白在调控植物抗旱性中的应用。USB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。实验证明，在野生型拟南芥中降低USB1基因的表达量可以提高拟南芥的抗旱性；抗旱性提高表现为：干旱处理后存活率提高和对ABA胁迫的敏感性提高。USB1蛋白可以调控植物抗旱性。本发明具有重要的应用价值。
权利要求 :
1.USB1蛋白在提高植物抗旱性中的应用；
所述USB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述植物为拟南芥。
2.USB1蛋白在培育抗旱性提高的转基因植物中的应用；
所述USB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述植物为拟南芥。
3.编码USB1蛋白的核酸分子在提高植物抗旱性中的应用；
所述USB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述植物为拟南芥。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下b1）或b2）或b3）所示的DNA分子：
b1）编码区是SEQ ID NO：2自5’末端起第70至927位所示的DNA分子；
b2）核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
b3）核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子。
5.编码USB1蛋白的核酸分子在培育抗旱性提高的转基因植物中的应用；
所述USB1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述植物为拟南芥。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为如下b1）或b2）或b3）所示的DNA分子：
b1）编码区是SEQ ID NO：2自5’末端起第70至927位所示的DNA分子；
b2）核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
b3）核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子。
说明书 :
USB1蛋白在调控植物抗旱性中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及USB1蛋白在调控植物抗旱性中的应用。
背景技术
[0002] 干旱是世界范围内造成农作物减产的最主要非生物因素之一，其中干旱对植物的伤害主要表现为：造成植物的生长发育减缓、活性氧积累、细胞结构改变、代谢平衡紊乱等，
致使植物产量减少，品质降低，对农业生产和环境建设造成了不利的影响。植物在长期进化
的过程中，产生了多种应对干旱胁迫的防御措施，例如及时关闭气孔、积累渗透调节物质、
诱导抗性基因表达和蛋白质合成等手段。
致使植物产量减少，品质降低，对农业生产和环境建设造成了不利的影响。植物在长期进化
的过程中，产生了多种应对干旱胁迫的防御措施，例如及时关闭气孔、积累渗透调节物质、
诱导抗性基因表达和蛋白质合成等手段。
[0003] 开发利用干旱土地最有效的方式是培育抗旱作物品种，转基因作物育种增强抗旱性虽然是可以预期的,但是转基因作物因其安全性问题一直备受争议，目前公众对转基因
食品的安全性依然信心不足，因此，当下利用非转基因的手段遗传育种增强作物的抗旱性
是非常实用且有效的手段。近年来出现的新一代基因工程技术—CRISPR/Cas9基因编辑技
术得以迅速发展,其原理是通过单向导RNA(sgRNA)引导核酸酶Cas9对目标DNA片段进行定
点切割，在修复过程中使靶点处发生核苷酸插入、缺失、替换等，实现靶基因的定点突变。基
因编辑育种相对于转基因育种优势在于：(1)能够在DNA水平上实现靶基因的定点敲除；(2)
可同时针对多个控制优良性状的基因进行编辑，得以同时提髙植物的抗性、产量或品质等；
(3)转基因技术不可避免地引入包括报告基因、筛选基因在内的外源基因，而基因编辑技术
通过后代自然分离筛选，可以将引发DNA编辑的核酸酶Cas9以及报告基因、筛选基因等完全
分离掉，同时目的基因的突变仍可稳定遗传。因此，通过CRISPR/Cas9等基因编辑技术选育
抗旱的植物新品种，为植物抗旱育种开辟了广阔的应用前景，对于促进农业生产、花卉育种
以及生态环境改善具有十分重要的价值。
食品的安全性依然信心不足，因此，当下利用非转基因的手段遗传育种增强作物的抗旱性
是非常实用且有效的手段。近年来出现的新一代基因工程技术—CRISPR/Cas9基因编辑技
术得以迅速发展,其原理是通过单向导RNA(sgRNA)引导核酸酶Cas9对目标DNA片段进行定
点切割，在修复过程中使靶点处发生核苷酸插入、缺失、替换等，实现靶基因的定点突变。基
因编辑育种相对于转基因育种优势在于：(1)能够在DNA水平上实现靶基因的定点敲除；(2)
可同时针对多个控制优良性状的基因进行编辑，得以同时提髙植物的抗性、产量或品质等；
(3)转基因技术不可避免地引入包括报告基因、筛选基因在内的外源基因，而基因编辑技术
通过后代自然分离筛选，可以将引发DNA编辑的核酸酶Cas9以及报告基因、筛选基因等完全
分离掉，同时目的基因的突变仍可稳定遗传。因此，通过CRISPR/Cas9等基因编辑技术选育
抗旱的植物新品种，为植物抗旱育种开辟了广阔的应用前景，对于促进农业生产、花卉育种
以及生态环境改善具有十分重要的价值。
[0004] USB1基因(tair网站https://www.arabidopsis.org上基因号为At5G51170)编码USB1蛋白(RNA外切酶)，该蛋白参与U2型剪接体重要组成因子U6 snRNA的形成，在植物、动
物、酵母中具有高度的同源性。目前，酵母和人类中对于USB1基因的研究较多，在人类中，
USB1基因突变引起一种严重的疾病‑伴中性细胞粒减少的皮肤异色病。在酵母细胞中，USB1
基因突变导致酵母生长缓慢，并在分子水平引起U6 snRNA3’末端异常以及多个基因前体
mRNA剪接紊乱等。人们对于植物中USB1基因功能了解还十分有限。
物、酵母中具有高度的同源性。目前，酵母和人类中对于USB1基因的研究较多，在人类中，
USB1基因突变引起一种严重的疾病‑伴中性细胞粒减少的皮肤异色病。在酵母细胞中，USB1
基因突变导致酵母生长缓慢，并在分子水平引起U6 snRNA3’末端异常以及多个基因前体
mRNA剪接紊乱等。人们对于植物中USB1基因功能了解还十分有限。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提高植物的抗旱性。
[0006] 本发明首先保护USB1蛋白的应用，可为S1)或S2)：
[0007] S1)调控植物抗旱性；
[0008] S2)培育抗旱性改变的转基因植物。
[0009] 上述应用中，所述USB1蛋白可为a1)或a2)或a3)：
[0010] a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：3所示的蛋白质；
[0011] a2)在SEQ ID NO：3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0012] a3)将SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗旱性相关的蛋白质。
[0013] 其中，SEQ ID NO：3由285个氨基酸残基组成。
[0014] 为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO：3所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0015] 表1.标签的序列
[0016]标签 残基 序列
Poly‑Arg 5‑6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep‑tag II 8 WSHPQFEK
c‑myc 10 EQKLISEEDL
Poly‑Arg 5‑6(通常为5个) RRRRR
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep‑tag II 8 WSHPQFEK
c‑myc 10 EQKLISEEDL
[0017] 上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0018] 上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0019] 上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO：2自5’末端起第70至927位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义
突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0020] 本发明还保护编码所述USB1蛋白的核酸分子的应用，可为S1)或S2)：
[0021] S1)调控植物抗旱性；
[0022] S2)培育抗旱性改变的转基因植物。
[0023] 上述应用中，所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：
[0024] b1)编码区是SEQ ID NO：2自5’末端起第70至927位所示的DNA分子；
[0025] b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
[0026] b3)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
[0027] b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述USB1蛋白的DNA分子；
[0028] b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述USB1蛋白的DNA分子。
[0029] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0030] 其中，SEQ ID NO：1由1606个核苷酸组成，SEQ ID NO：2由1039个核苷酸组成，SEQ ID NO：2自5’末端起第70至927位所示的的核苷酸编码SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
[0031] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述USB1蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本
发明分离得到的所述USB1蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述
USB1蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
发明分离得到的所述USB1蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述
USB1蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0032] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的USB1蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，
或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性
可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以
用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性
可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以
用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0033] 上述任一所述的应用中，所述调控植物抗旱性可为提高植物抗旱性或降低植物抗旱性。
[0034] 上述任一所述的应用中，所述培育抗旱性改变的转基因植物可为培育抗旱性提高的转基因植物或培育抗旱性降低的转基因植物。
[0035] 上述任一所述的应用中，所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)十字花科植物；c4)拟南芥；c5)野生型拟南芥Columbia‑0亚型。
[0036] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：降低出发植物中所述USB1蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗旱性提
高。
高。
[0037] 上述方法中，所述“降低出发植物中所述USB1蛋白的表达量和/或活性”可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到降低出发植物中所述USB1蛋白的
表达量和/或活性的目的。
表达量和/或活性的目的。
[0038] 上述方法中，所述降低出发植物中USB1蛋白的表达量和/或活性可通过向出发植物中导入植物基因组编辑的载体实现；
[0039] 所述植物基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因；
[0040] 所述sgRNA在植物中识别的靶标DNA为编码所述USB1蛋白的DNA片段。
[0041] 上述方法中，所述sgRNA识别的靶点可为SEQ ID NO：2自5’末端起第325‑346位所示的DNA分子。
[0042] 上述方法中，所述植物基因组编辑的载体具体可为重组质粒pCRISPR‑USB1。重组质粒pCRISPR‑USB1可为将SEQ ID NO：2自5’末端起第325‑346位所示的DNA分子插入
CRISPR/Cas9载体的限制性内切酶BsaI的识别位点，得到的重组质粒。
CRISPR/Cas9载体的限制性内切酶BsaI的识别位点，得到的重组质粒。
[0043] 本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：降低植物中所述USB1蛋白的表达量和/或活性，从而提高抗旱性。
[0044] 上述任一所述的方法中，所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)十字花科植物；c4)拟南芥；c5)野生型拟南芥Columbia‑0亚型。
[0045] 上述任一所述提高抗旱性可表现为干旱处理后存活率增加和/或对ABA敏感性提高。
[0046] 所述ABA敏感性提高可为对ABA诱导气孔关闭敏感性提高和/或对ABA抑制气孔开放敏感性提高。
[0047] 实验证明，采用含有重组质粒pCRISPR‑USB1的重组农杆菌转化野生型拟南芥Columbia‑0亚型，能够对USB1基因进行编辑，USB1基因通过CRESPR/Cas9核酸内切酶编辑之
后，可造成USB1基因突变，当两条同源染色体的USB1基因均发生突变时，可以导致USB1蛋白
活性丧失，得到USB1蛋白活性丧失的转基因拟南芥。与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的
抗旱性提高；抗旱性提高表现为干旱处理后存活率提高和对ABA胁迫的敏感性提高。由此可
见，USB1蛋白可以调控植物抗旱性。本发明具有重要的应用价值。
后，可造成USB1基因突变，当两条同源染色体的USB1基因均发生突变时，可以导致USB1蛋白
活性丧失，得到USB1蛋白活性丧失的转基因拟南芥。与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的
抗旱性提高；抗旱性提高表现为干旱处理后存活率提高和对ABA胁迫的敏感性提高。由此可
见，USB1蛋白可以调控植物抗旱性。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
[0048] 图1为利用CRISPR/Cas9系统获得的usb1‑2突变体的鉴定结果。
[0049] 图2为Cas9失活的非转基因株系鉴定结果。
[0050] 图3为实施例2中的实验结果。其中，(a)为usb1‑1突变体的鉴定结果；(b)为实时荧光定量PCR检测USB1基因的相对表达水平。
[0051] 图4为实施例3中步骤一的实验结果。其中，(a)为ABA促进气孔关闭实验气孔孔径大小统计结果；(b)为ABA抑制气孔开放实验气孔孔径大小统计结果。
[0052] 图5为实施例3中步骤二的实验结果。其中，(a)为表型图片；(b)为存活率统计结果。
具体实施方式
[0053] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
[0054] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0055] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0056] 下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。
[0057] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
[0058] 拟南芥野生型Col‑0生态型(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia‑0)种子购自拟南芥生物研究中心(ABRC，https://www.arabidopsis.org/)。在下文中，拟南芥野生
型Col‑0生态型种子简称野生型拟南芥种子，拟南芥野生型Col‑0生态型简称野生型拟南
芥。
型Col‑0生态型种子简称野生型拟南芥种子，拟南芥野生型Col‑0生态型简称野生型拟南
芥。
[0059] 根癌农杆菌GV3101记载于如下文献中：R.Berres，L.otten，B.Tinland et al.Transformation of vitis tissue by different strains of Agrobacterium
tumefaciens containing the T_6b gene.Plant Cell Reports,1992(11):192‑195.
tumefaciens containing the T_6b gene.Plant Cell Reports,1992(11):192‑195.
[0060] 大肠杆菌DH5α(DE3)感受态为北京全式金生物有限公司的产品
[0061] 下述实施例中涉及的USB1基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其在拟南芥基因组中的序列如SEQ ID NO：1所示，cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。SEQ ID NO：1由1606
个核苷酸组成；其中SEQ ID NO：1自5’末端起第227‑322、416‑598、846‑923、1021‑1117和
1184‑1296位均为内含子序列。SEQ ID NO：2由1039个核苷酸组成，其中SEQ ID NO：2自5’末
端起第70‑927位为编码序列(ORF)。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2均编码SEQ ID NO：3所示的
USB1蛋白。SEQ ID NO：3由285个氨基酸残基组成。
个核苷酸组成；其中SEQ ID NO：1自5’末端起第227‑322、416‑598、846‑923、1021‑1117和
1184‑1296位均为内含子序列。SEQ ID NO：2由1039个核苷酸组成，其中SEQ ID NO：2自5’末
端起第70‑927位为编码序列(ORF)。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2均编码SEQ ID NO：3所示的
USB1蛋白。SEQ ID NO：3由285个氨基酸残基组成。
[0062] 实施例1、Cas9失活的非转基因株系的获得及鉴定
[0063] 一、重组质粒pCRISPR‑USB1的构建
[0064] 本发明的发明人通过大量实验，从USB1基因的第3个外显子中选择靶点。靶点序列为5’‑ATACCTCCACTGCCAAAGAAGG‑3’(即SEQ ID NO：2自5’末端起第325‑346位)。
[0065] 1、根据靶点设计并合成引物1：5’‑attgATACCTCCACTGCCAAAGA‑3’和引物2：5’‑aaacTCTTTGGCAGTGGAGGTAT‑3’。
[0066] 2、向离心管中加入10μL浓度为100μM的引物1水溶液和10μL浓度为100μM的引物2水溶液，混匀，80℃孵育20min，之后自然降至20℃，得到引物二聚体。
[0067] 3、取CRISPR/Cas9载体(记载于如下文献中：Wang ZP，Xing HL，Dong L，Zhang HY，Han CY，Wang XC，Chen QJ.2015.Egg cell‑specific promoter‑controlled CRISPR/Cas9
efficiently generates homozygous mutants for multiple target genes in
Arabidopsis in a single generation.Genome Biology 16，144.)，用限制性内切酶BsaI
酶切，回收载体骨架。
efficiently generates homozygous mutants for multiple target genes in
Arabidopsis in a single generation.Genome Biology 16，144.)，用限制性内切酶BsaI
酶切，回收载体骨架。
[0068] 酶切体系为100μL，包括10μL 10×Cutsmart、2μL限制性内切酶BsaI、10μL CRISPR/Cas9载体和78μL ddH2O。
[0069] 反应程序为：37℃3h。
[0070] 限制性内切酶BsaI为NEB公司的产品，产品目录号为R0535S；10×Cutsmart为限制性内切酶BsaI中的组件。
[0071] 4、向离心管中加入1μL 10×T4 Ligase buffer、1μL T4 DNA Ligase、2μL载体骨架、2μL引物二聚体和4μL ddH2O，混匀，16℃反应1.5h。
[0072] T4 DNA Ligase为NEB公司的产品，产品目录号为M0203L；10×T4 Ligase buffer为T4 DNA Ligase中的组件。
[0073] 5、将完成步骤4的体系转化大肠杆菌DH5α(DE3)感受态，然后涂在含有Kan的LB固体培养基上，挑取阳性单克隆，提取质粒进行验证，将测序正确且含有sgRNA的重组载体命
名为重组质粒pCRISPR‑USB1。
名为重组质粒pCRISPR‑USB1。
[0074] 测序结果表明，重组质粒pCRISPR‑USB1为将SEQ ID NO：2自5’末端起第325‑346位所示的DNA分子插入CRISPR/Cas9载体的限制性内切酶BsaI的识别位点，得到的重组质粒。
[0075] 二、Cas9失活的非转基因株系的获得及鉴定
[0076] 1、USB1基因编辑拟南芥的获得
[0077] (1)将重组质粒pCRISPR‑USB1通过冻融法导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为重组农杆菌USB1‑sgRNA‑Cas9。
[0078] (2)采用农杆菌花序侵染的方法(SJ Clough，AF Bent.Floral dip：a simplified method for Agrobacterium‑mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The
Plant Journal，1998，16(6):735‑743.)将重组农杆菌USB1‑sgRNA‑Cas9转至野生型拟南芥
中，获得T1代USB1基因编辑拟南芥种子。
Plant Journal，1998，16(6):735‑743.)将重组农杆菌USB1‑sgRNA‑Cas9转至野生型拟南芥
中，获得T1代USB1基因编辑拟南芥种子。
[0079] (3)将步骤(2)获得的T1代USB1基因编辑拟南芥种子播种于含有40mg/L潮霉素的MS固体培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代USB1基因编辑阳性苗。
[0080] 2、USB1基因编辑株系靶点分析
[0081] 分别提取T1代USB1基因编辑阳性苗叶片的基因组DNA并作为模板，采用USB1‑F：5’‑AAACTTTCCTCATGTCGATGGAA‑3’和USB1‑R：5’‑CTCTTCTGCAACTGAAGCTTTTG‑3’组成的引物
对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。USB1‑F和USB1‑R为靶点两侧引物。
对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。USB1‑F和USB1‑R为靶点两侧引物。
[0082] 反应体系为20μL，包括10μL 2×Taq PCR mix(TIANGEN公司的产品，产品目录号为KT201‑02)、0.5μL USB1‑F水溶液(浓度为20μM)、0.5μL USB1‑R水溶液(浓度为20μM)、5μL模
板和4μL ddH2O。
板和4μL ddH2O。
[0083] 反应程序为：①95℃3min；②95℃30s，③60℃30s，④72℃30s，②‑④循环34次；⑤72℃10min。
[0084] (2)将各个PCR扩增产物进行测序。根据测序结果，分析T1代USB1基因编辑阳性苗靶点的突变类型。
[0085] 由于拟南芥是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突
变，所以将一个植株中两个等位基因看成是两个基因编辑事件。纯合突变株指的是该植株
的两条同源染色体的USB1基因发生了相同的突变。双等位基因突变株指的是该植株的两条
同源染色体的USB1基因均发生了突变但突变形式不同。杂合突变株数指的是该植株的两条
同源染色体中的一条同源染色体的USB1基因发生了突变、另一条同源染色体的USB1基因未
发生突变。野生型指的是该植株的两条同源染色体中的USB1基因均未发生突变。在本实施
例中，将纯合突变记为突变体。
变，所以将一个植株中两个等位基因看成是两个基因编辑事件。纯合突变株指的是该植株
的两条同源染色体的USB1基因发生了相同的突变。双等位基因突变株指的是该植株的两条
同源染色体的USB1基因均发生了突变但突变形式不同。杂合突变株数指的是该植株的两条
同源染色体中的一条同源染色体的USB1基因发生了突变、另一条同源染色体的USB1基因未
发生突变。野生型指的是该植株的两条同源染色体中的USB1基因均未发生突变。在本实施
例中，将纯合突变记为突变体。
[0086] 从T1代USB1基因编辑阳性苗中发现一个纯合突变株，命名为usb1‑2突变体。
[0087] usb1‑2突变体的测序结果见图1。usb1‑2突变体在USB1基因的第3外显子中增加了1个A(即SEQ ID No：2自5’末端起第340至341位之间增加了1个A)从而引起了移码并提前终
止，造成USB1蛋白功能缺失。
止，造成USB1蛋白功能缺失。
[0088] 3、筛选Cas9失活的非转基因株系
[0089] (1)将usb1‑2突变体自交，得到T2代种子，进而得到58个自交后代(即58个usb1‑2 T2代单株)，依次命名为1#—58#。
[0090] (2)分别提取58个自交后代叶片的基因组DNA并作为模板，采用Cas9‑F：5’‑CTGTTCGTCGAGCAGCACAAGCATT‑3’和Cas9‑R：5’‑CATTAGAGGCCACGATTTGACACAT‑3’组成的引
物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。
物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。
[0091] 反应体系为20μL，包括10μL 2×Taq PCR mix、0.5μL Cas9‑F水溶液(浓度为20μM)、0.5μL Cas9‑R水溶液(浓度为20μM)、5μL模板和4μL ddH2O。
[0092] 反应程序为：①95℃3min；②95℃30s，③60℃30s，④72℃30s，②‑④循环34次；⑤72℃10min。
[0093] (3)将各个PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，之后于紫外灯下拍照；进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有大小为746bp的DNA片段，则相应的自交后代含有Cas9基
因；如果PCR扩增产物中不含有大小为746bp的DNA片段，则相应的自交后代不含有Cas9基
因。不含有Cas9基因的自交后代即Cas9失活的非转基因株系。
因；如果PCR扩增产物中不含有大小为746bp的DNA片段，则相应的自交后代不含有Cas9基
因。不含有Cas9基因的自交后代即Cas9失活的非转基因株系。
[0094] 检测结果见图2(1‑58依次为1#—58#)。结果表明，5#、19#、25#、26#和27#为Cas9失活的非转基因株系。
[0095] 4、5#、19#、25#、26#和27#靶点的突变类型检测
[0096] (1)分别提取5#、19#、25#、26#和27#叶片的基因组DNA并作为模板，采用USB1‑F和USB1‑R组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。USB1‑F和USB1‑R为靶点两侧
引物。
引物。
[0097] (2)将各个PCR扩增产物进行测序。根据测序结果，分析Cas9失活的非转基因株系靶点的突变类型。
[0098] 结果表明，Cas9失活的非转基因株系靶点的突变类型与usb1‑2突变体靶点的突变类型完全一致。
[0099] 上述结果表明，Cas9失活的非转基因株系不含Cas9基因且突变仍可稳定遗传。
[0100] 实施例2、实时荧光定量检测usb1‑1突变体中USB1基因的相对表达水平
[0101] 一、usb1‑1突变体的鉴定
[0102] usb1‑1突变体为拟南芥生物研究中心的产品，编号为SAIL_717_G03。usb1‑1突变体为USB1基因表达降低的T‑DNA插入突变体，遗传背景为野生型拟南芥。
[0103] 1、以usb1‑1突变体叶片的基因组DNA为模板，采用LBb1：5’‑ATTTTGCCGATTTCGGAAC‑3’、usb1‑1_LP：5’‑ATCTCCAAAATCCCCATCATC‑3’和usb1‑1_RP：5’‑
GATACACTTCATCAGGCCTGC‑3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
GATACACTTCATCAGGCCTGC‑3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0104] 2、将PCR扩增产物进行测序。
[0105] 测序比对结果见图3中(a)。结果表明，usb1‑1突变体为纯合突变体；具体的，usb1‑1突变体为两条同源染色体中USB1基因起始密码子ATG下游第19bp处均插入了转座子，从而
引起了提前终止，造成USB1蛋白功能缺失。
引起了提前终止，造成USB1蛋白功能缺失。
[0106] 二、实时荧光定量检测usb1‑1突变体中USB1基因的相对表达水平
[0107] 实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
[0108] 1、取待测拟南芥(usb1‑1突变体或野生型拟南芥)种子，28℃光暗交替培养12天，得到待测拟南芥幼苗；将待测拟南芥幼苗放入液氮保存，得到待测样本。
[0109] 2、采用Trizo1法提取待测样本的总RNA，然后反转录出第一链cDNA，将该cDNA用无菌水稀释50倍作为模板，实时荧光定量PCR检测USB1基因的相对表达水平(以Actin2/8基因
‑ΔCt
为内参基因)。以2 衡量USB1基因转录水平的相对差值，对各待测样本中USB1基因的表达
水平进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为检测USB1
基因的引物Ct值与检测Actin2/8基因的引物Ct值之差。
‑ΔCt
为内参基因)。以2 衡量USB1基因转录水平的相对差值，对各待测样本中USB1基因的表达
水平进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，ΔCt值为检测USB1
基因的引物Ct值与检测Actin2/8基因的引物Ct值之差。
[0110] 检测USB1基因的引物为USB1‑qPCR‑F：5’‑AAGCATTGAGAGCGTCCTACG‑3’和USB1‑qPCR‑R：5’‑GTTTCTTACACGAACTCCAGGC‑3’。检测Actin2/8基因的引物为Actin2/8‑qPCR‑F：
5’‑GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG‑3’和Actin2/8‑qPCR‑R：5’‑AACGACCTTAATCTTCATGCTGC‑3’。
5’‑GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG‑3’和Actin2/8‑qPCR‑R：5’‑AACGACCTTAATCTTCATGCTGC‑3’。
[0111] 将野生型拟南芥中USB1基因的相对表达水平设为1，usb1‑1突变体中USB1基因的相对表达水平见图3中(b)(Col‑0为野生型拟南芥，usb1‑1为usb1‑1突变体)。结果表明，与
野生型拟南芥相比，usb1‑1突变体中USB1基因的相对表达水平显著降低。
野生型拟南芥相比，usb1‑1突变体中USB1基因的相对表达水平显著降低。
[0112] 实施例3、干旱胁迫耐受性分析
[0113] 待测拟南芥种子为usb1‑2突变体的种子、usb1‑1突变体的种子、野生型拟南芥的种子。
[0114] 一、ABA促进气孔关闭和抑制气孔开放
[0115] 1、ABA促进气孔关闭
[0116] 实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
[0117] (1)将80‑100粒待测拟南芥种子播种在MS固体培养基上，4℃层积3天；之后移入土壤生长3周，得到待测拟南芥幼苗。
[0118] (2)摘取待测拟南芥幼苗的成熟莲座叶，之后置于表皮条缓冲液(含50mM KCl和10mM MES‑KOH的水溶液，pH值为6.15)，冷光源光照3h，使叶片气孔开到最大，撕取叶片表
皮，在显微镜下观察并记录气孔孔径。
皮，在显微镜下观察并记录气孔孔径。
[0119] (3)完成步骤(2)后，将叶片置于表皮条缓冲液或含25μM ABA的表皮条缓冲液，冷光源光照2.5h，撕取叶片表皮，在显微镜下观察并记录气孔孔径。
[0120] 每个样本记录60个气孔孔径。
[0121] 采用邓肯氏新复极差法分析差异显著性，不同字母代表不同基因型之间统计值差异显著(P<0.05)。
[0122] 检测结果见图4中(a)(Col‑0为野生型拟南芥，usb1‑1为usb1‑1突变体，usb1‑2为usb1‑2突变体)。ABA处理前，usb1‑2突变体、usb1‑1突变体和野生型拟南芥的气孔孔径无显
著差异；ABA处理后，与野生型拟南芥相比，usb1‑2突变体和usb1‑1突变体的气孔孔径显著
缩小；即usb1‑2突变体和usb1‑1突变体对ABA诱导气孔关闭更加敏感，表现出对ABA超敏的
表型。
著差异；ABA处理后，与野生型拟南芥相比，usb1‑2突变体和usb1‑1突变体的气孔孔径显著
缩小；即usb1‑2突变体和usb1‑1突变体对ABA诱导气孔关闭更加敏感，表现出对ABA超敏的
表型。
[0123] (2)ABA抑制气孔开放
[0124] 实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
[0125] (1)将80‑100粒待测拟南芥种子播种在MS固体培养基上，4℃层积3天；之后移入土壤生长3周，得到待测拟南芥幼苗。
[0126] (2)摘取待测拟南芥幼苗的成熟莲座叶，之后黑暗放置3h，使气孔关闭，撕取叶片表皮，在显微镜下观察并记录气孔孔径。
[0127] (3)完成步骤(2)后，将叶片置于表皮条缓冲液或含25μM ABA的表皮条缓冲液，冷光源光照2.5h，撕取叶片表皮，在显微镜下观察并记录气孔孔径。
[0128] 每个样本记录60个气孔孔径。
[0129] 采用邓肯氏新复极差法分析差异显著性，不同字母代表不同基因型之间统计值差异显著(P<0.05)。
[0130] 检测结果见图4中(b)(Col‑0为野生型拟南芥，usb1‑1为usb1‑1突变体，usb1‑2为usb1‑2突变体)。黑暗处理3h后，usb1‑2突变体、usb1‑1突变体和野生型拟南芥的气孔孔径
无显著差异(气孔关闭的程度基本一致)。光照2.5h后，不含ABA组中usb1‑2突变体、usb1‑1
突变体和野生型拟南芥的气孔孔径无显著差异；含ABA组中，与野生型拟南芥相比，usb1‑2
突变体和usb1‑1突变体的气孔孔径显著缩小(气孔开放显著抑制)；即usb1‑2突变体和
usb1‑1突变体对ABA抑制气孔开放更加敏感，表现出对ABA超敏的表型。
无显著差异(气孔关闭的程度基本一致)。光照2.5h后，不含ABA组中usb1‑2突变体、usb1‑1
突变体和野生型拟南芥的气孔孔径无显著差异；含ABA组中，与野生型拟南芥相比，usb1‑2
突变体和usb1‑1突变体的气孔孔径显著缩小(气孔开放显著抑制)；即usb1‑2突变体和
usb1‑1突变体对ABA抑制气孔开放更加敏感，表现出对ABA超敏的表型。
[0131] 二、干旱实验
[0132] 实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
[0133] (1)将待测拟南芥种子播种在MS固体培养基上，4℃春化3天；之后22℃培养8天，得到待测拟南芥幼苗。
[0134] (2)完成步骤(1)后，将待测拟南芥幼苗移入土壤，正常培养2周。然后拍照记录干旱处理前待测拟南芥幼苗的生长情况。
[0135] (3)完成步骤(2)后，干旱处理2周，即停止浇水2周。然后拍照记录干旱处理后待测拟南芥幼苗的生长情况。
[0136] (4)完成步骤(3)后，复水；复水3天后，拍照记录复水后待测拟南芥幼苗的生长情况，统计复水后存活的幼苗数并计算存活率。
[0137] 每次实验中待测拟南芥幼苗的数量均为50株。
[0138] 采用邓肯氏新复极差法分析差异显著性，不同字母代表不同基因型之间统计值差异显著(P<0.05)。
[0139] 干旱处理前、干旱处理后和复水后待测拟南芥幼苗的生长情况见图5中(a)(Col‑0为野生型拟南芥，usb1‑1为usb1‑1突变体，usb1‑2为usb1‑2突变体)。结果表明，干旱处理
前，usb1‑2突变体、usb1‑1突变体和野生型拟南芥的生长状态无显著差异；干旱处理后和复
水后，usb1‑2突变体和usb1‑1突变体较野生型拟南芥生长相对正常。
前，usb1‑2突变体、usb1‑1突变体和野生型拟南芥的生长状态无显著差异；干旱处理后和复
水后，usb1‑2突变体和usb1‑1突变体较野生型拟南芥生长相对正常。
[0140] 存活率统计结果见图5中(b)(Col‑0为野生型拟南芥，usb1‑1为usb1‑1突变体，usb1‑2为usb1‑2突变体)。结果表明，与野生型拟南芥相比，usb1‑2突变体和usb1‑1突变体
的存活率显著提高。
的存活率显著提高。
[0141] 上述结果表明，在野生型拟南芥中降低USB1基因的表达量可以提高拟南芥的抗旱性；抗旱性提高表现为：干旱处理后存活率提高和对ABA胁迫的敏感性提高。