[2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-吡咯烷基二硫代氨基甲酸]酐及在制备抗癌药物中的应用

摘要

本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，具体涉及一种5‑氟尿嘧啶与二硫代氨基甲酸盐化合物P1的设计、合成及其在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其涉及一种[2‑（5´‑氟尿嘧啶）乙酸‑吡咯烷基二硫代氨基甲酸]酐及其在制备抗肿瘤药物中的应用。将5‑氟尿嘧啶进行适当的衍生之后，与吡咯烷基二硫代氨基甲酸铵通过化学键结合，设计并合成了一个潜在的多靶点抗肿瘤新药。细胞毒性实验验证了其抗肿瘤活性，并且联合铜离子使用，其对应的肿瘤细胞生长的抑制能力显著增强。肿瘤细胞克隆形成实验进一步表明其抑制细胞增殖活性的能力，细胞转移实验也显示出其对肿瘤细胞转移能力的抑制作用。

权利要求

1.化合物[2‑(5′‑氟尿嘧啶)乙酸‑吡咯烷基二硫代氨基甲酸]酐，其结构式为：

2.权利要求1所述的化合物[2‑(5′‑氟尿嘧啶)乙酸‑吡咯烷基二硫代氨基甲酸]酐在制备抗肿瘤药物中的应用。

3.权利要求1所述的化合物[2‑(5′‑氟尿嘧啶)乙酸‑吡咯烷基二硫代氨基甲酸]酐在制备抑制肿瘤细胞U87MG、HepG2、A549或Hela生长的药物中的应用。

4.权利要求1所述的化合物[2‑(5′‑氟尿嘧啶)乙酸‑吡咯烷基二硫代氨基甲酸]酐联合铜离子在制备抑制肿瘤细胞U87MG、HepG2、A549或Hela生长的药物中的应用。

5.权利要求1所述的化合物[2‑(5′‑氟尿嘧啶)乙酸‑吡咯烷基二硫代氨基甲酸]酐联合铜离子在制备抑制肿瘤细胞U87MG、HepG2、A549或Hela的增殖活性和转移能力的药物中的应用。

说明书

[2‑(5′‑氟尿嘧啶)乙酸‑吡咯烷基二硫代氨基甲酸]酐及在制

备抗癌药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，具体涉及一种5‑氟尿嘧啶与二硫代氨基甲酸盐拼合物的设计、合成及其在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其涉及一种[2‑ (5′‑氟尿嘧
啶)乙酸‑吡咯烷基二硫代氨基甲酸]酐及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

[0002] 5‑FU主要被用于治疗多种恶性肿瘤，如泌尿系统、胃肠道以及头颈部的上皮细胞肿瘤。局部使用时，它对于表层基底细胞癌也有疗效。与单一药物化疗相比，5‑FU与放射结
合的治疗方法更能提高头颈、胰腺、胆囊、宫颈、食道及胃部癌症患者的生存率。然而，自身
毒性、较弱的扩散能力和抗药性限制了5‑FU 的使用。5‑FU对肿瘤细胞的毒性是非特异性
的，接受其治疗的患者容易产生骨髓中毒症状。连续的注入可能导致手足症状、口腔炎和神
经、心脏毒性。为了克服以上缺陷，研究者们对5‑FU的结构进行了多种修饰，致力于研发出
具有广谱抗癌活性和较弱毒副作用的5‑FU衍生物。

[0003] 吡咯烷基二硫代氨基甲酸盐(PDTC)是一种抗氧化剂和金属离子螯合剂，可以与As、Bi、Cd、Co、Cu、Fe、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Zn等重金属形成稳定的络合物。此外，PDTC还是一种
可以通透细胞膜的NF‑κB抑制剂，可以在多种细胞中抑制NF‑κB的激活。PDTC能引起多种细
胞的凋亡，如可以诱导大鼠平滑肌细胞(SMC)、小鼠B细胞发生凋亡，也可以抑制如白血病细
胞HL‑60、结肠癌细胞26及淋巴瘤细胞U937等肿瘤细胞发生凋亡。

[0004] 药物拼合原理是药物化学中的一种常用的药物结构改造手段。其不足之处在于：由于拼合后药物分子结构比较大，往往会与设想的目标产生较大的出入。如：有时拼合药物
分子的立体选择性会发生改变；有时药效基团会受到邻位较大基团的掩蔽，构成较大的空
间位阻；并且断键的难易也与所连基团结构有关。药物结构改变后，药物在体内的吸收、转
运、代谢等方面也随之发生变化，会导致药效学的复杂情况。如：拼合后的分子一般相对分
子质量较大，所以它的细胞通透性较差；而且分子结构大，相对来说性质不太稳定，易分解，
从而导致没有实际药用价值；另外有些分子在体内过于稳定，对水解酶不敏感，不能迅速定
量地释放出目标药物，所以也没有临床意义。

发明内容

[0005] 针对现有技术中存在的不足和为了填补本领域的技术空白，本发明的第一个目的在于提供了一种化合物P1：[2‑(5′‑氟尿嘧啶)乙酸‑吡咯烷基二硫代氨基甲酸]酐，其结构
式如下：

[0006] 分子式：C11H12FN3O3S2

[0007] 分子量：317.03041

[0008] 该化合物是将5‑氟尿嘧啶进行适当衍生后，通过酸酐键使其与吡咯烷基二硫代氨基甲酸酯连接在一起，从而制成溶解性较好的新衍生物作为前药。该产物在人体内酯酶的
作用下进行分解，从而发挥疗效，而且这两种药物在药理活性上又可以相互促进，达到增强
疗效、减轻毒副作用、提高药物的生物利用度的目的。而且成酯后的药物要通过酯酶水解才
可以释放出来，有延长作用时间的可能，所以值得研究开发。

[0009] 本发明的第二个目的在于提供了一种所述化合物P1在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0010] 本发明对其进行了初步的生物活性评价，结果显示，该化合物具有明显的抑制肿瘤细胞U87MG、HepG2、A549、Hela生长的作用。

[0011] 本发明的实验证明：吡咯烷基二硫代氨基甲酸酯基团的引入增加了5‑氟尿嘧啶衍生物的活性，说明吡咯烷基二硫代氨基甲酸酯基团对5‑氟尿嘧啶的抗癌活性有协同作用。
化合物P1在联合铜离子使用时，其抗肿瘤活性明显增强，说明化合物P1在肿瘤细胞内酶的
作用下代谢出吡咯烷基二硫代氨基甲酸盐，并与铜离子形成螯合物，进而增强活性。此拼合
物与铜离子联合使用(优选将化合物 P1与铜离子按照摩尔比1:1联合使用)时，可抑制肿瘤
细胞的增殖活性和转移能力。

[0012] 所述化合物P1可以采取以下合成工艺路线来制备：

[0013]

[0014] 与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

[0015] 1、提供了一种新的、优势突出的药用化合物；

[0016] 2、制备本发明新化合物的操作步骤简单、副反应少、原料易得、溶剂绿色环保。

附图说明

[0017] 图1为实施例二合成的5‑氟尿嘧啶‑1乙酸的1H NMR图谱；

[0018] 图2为实施例三合成的5‑氟尿嘧啶‑1‑乙酰氯的1H NMR图谱；

[0019] 图3为实施例四合成的[2‑(5′‑氟尿嘧啶)乙酸‑吡咯烷基二硫代氨基甲酸] 酐的1
H NMR图谱；

[0020] 图4为实施例四合成的[2‑(5′‑氟尿嘧啶)乙酸‑吡咯烷基二硫代氨基甲酸] 酐的13
C NMR图谱；

[0021] 图5为实施例五中U87MG细胞毒性实验结果图；

[0022] 图6为实施例五中HepG2细胞毒性实验结果图；

[0023] 图7为实施例五中A549细胞毒性实验结果图；

[0024] 图8为实施例五中Hela细胞毒性实验结果图；图9为实施例六中U87MG 细胞克隆形成实验结果图，其中，*:p<0.05,**:p<0.01；

[0025] 图10为实施例六中HepG2细胞克隆形成实验结果图，其中，*:p<0.05,**: p<0.01；

[0026] 图11为实施例七中U87MG细胞Transwell实验结果图，其中，*:p<0.05, **:p<0.01；

[0027] 图12为实施例七中HepG2细胞Transwell实验结果图，其中，*:p<0.05,**: p<0.01。

具体实施方式

[0028] 下面申请人将结合具体的实施例对本发明化合物P1的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但应该理解，以下实施例不应以任何方式
被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。

[0029] 实施例一‑四是化合物P1的制备实施例，其中，所用试剂均为常见市售商品，纯度级别均为分析纯，盐酸浓度均为37wt％。

[0030] 实施例一、5‑氟尿嘧啶单钾盐的合成

[0031]

[0032] 在100ml三口烧瓶中，加入50ml甲醇和2.6g(20mmol)5‑氟尿嘧啶，再向烧瓶中加入1.12g(20mmol)氢氧化钾，室温下反应至终点(TLC跟踪)，减压蒸干反应液得到白色固体
2.4g(72％)。

[0033] 实施例二、5‑氟尿嘧啶‑1‑乙酸的合成

[0034]

[0035] 在100ml烧瓶中，加入25mlDMF和3.3g(20mmol)5‑氟尿嘧啶单钾盐，再向烧瓶中缓慢滴加溴乙酸乙酯5.5g(40mmol)的10mlDMF溶液，升温至100℃反应9h，过滤，将溶剂减压蒸
干，残留物加入4mL盐酸，100℃下继续反应4h，减压蒸除其中过量的水，得到的浓缩液用冰
1
水冷却，静置后析出固体，过滤，烘干，得到白色晶体2.3g(61％).H NMR(400MHz,dmso)δ
13.22(s,1H),11.91(d, J＝5.0Hz,1H),8.05(d,J＝6.8Hz,1H),4.34(s,2H).m.p.280.3～
280.9℃.

[0036] 实施例三、5‑氟尿嘧啶‑1‑乙酰氯的合成

[0037]

[0038] 将5‑氟尿嘧啶‑1乙酸3.76g(0.02mol)溶于20ml二氯甲烷，冷却到0℃，缓慢滴加15ml二氯亚砜，滴完升至室温继续反应终点(TLC跟踪)，旋干之后得到淡黄色固体3.15g
1
(76％)。H NMR(400MHz,dmso)δ11.87(d,J＝5.0Hz, 1H),8.07(dd,J＝6.8,1.8Hz,1H),
4.34(s,2H).m.p.270.0～272.0℃.

[0039] 实施例四、[2‑(5′‑氟尿嘧啶)乙酸‑吡咯烷基二硫代氨基甲酸]酐(化合物P1) 的合成

[0040]

[0041] 向烧瓶中加入10mlTHF和0.82g(5mmol)吡咯烷二硫代氨基甲酸铵，搅拌，将5‑氟尿嘧啶‑1‑乙酰氯1g(5mmol)溶于THF之后，缓慢滴入到烧瓶中，升温至60℃反应至终点(TLC跟
1
踪)，过滤，滤饼用水洗涤，再用氯仿洗涤，得到白色固体粉末0.94g(59％)。H NMR(400MHz,
dmso)δ11.81(s,1H),7.92(d,J ＝6.8Hz,1H),4.43(s,2H),3.38(d,J＝6.8Hz,2H),3.28(d,
13
J＝6.9Hz,2H),1.81 (dd,J＝45.7,6.7Hz,4H). C NMR(101MHz,dmso)δ164.81(s),158.06
(s), 157.80(s),150.18(s),140.73(s),138.46(s),131.62(s),131.28(s),49.43(s),
46.18 (s),45.37(s),26.02(s),24.09(s).m.p.274.6～279.8℃.

[0042] 实施例五、细胞毒性实验

[0043] 人胶质瘤细胞U87MG、肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549和宫颈癌细胞Hela 均来为本申请发明人实验室的冻存材料(湖北工业大学特聘教授刘滨磊课题组赠送)。依据计数结果
取适量的各肿瘤细胞悬液分别加入空白高糖培养基(含有 10％胎牛血清和1％双抗溶液的
DMEM高糖培养基(所述双抗溶液配制方法如下：用分析天平称取1.5g青霉素和3.75g链霉
素，加入到250mlPBS溶液(PBS 浓度为10mM，pH为7.4，下同，不赘述)中，超声至完全溶解，在
超净工作台中过滤，分装于10ml的EP管中，保存在‑20℃冰箱中，备用。后续的双抗溶液与此
相同，均不赘述)中，然后平均分配到96孔板中的每个孔中(100μl/孔)。在板上标记上细胞
名称和铺板日期即可将96孔板放入培养箱培养(37℃， 5％CO2)。24小时后，待细胞贴壁恢
复形态进入对数生长期。将化合物P1(储存浓度为10mM，溶剂为DMSO)用完全培养基(含有
10％胎牛血清和1％双抗溶液的DMEM高糖培养基)倍减稀释配成不同浓度，弃去96孔板中上
层培养基，换为含不同浓度5‑FU、P1、P1/Cu(等摩尔的P1和葡萄糖酸铜混合后溶解，配制成
不同浓度的溶液，该浓度指P1或葡萄糖酸铜的摩尔浓度。下同，不赘述) 的培养基(含有
10％胎牛血清和1％双抗溶液的DMEM高糖培养基，100μl/孔) 100μl/孔)培养24h。取MTT储
存液(0.5g MTT，完全溶解于100ml1×PBS中，分装后于‑20℃冰箱中冷冻备用)解冻，在96孔
板中加入MTT(20μl/孔)，在 37℃中孵育4个小时。从培养箱中拿出96孔板，弃去上清，加入
DMSO(分析纯)150μl放在摇床上10分钟溶解。在酶标仪上测其在490nm处的吸光度值。计算
不同化合物处理后细胞的存活率。对照组存活率为100％，化合物P1处理过的细胞存活率＝
(实验组吸光度‑空白组吸光度)/(对照组吸光度‑空白组吸光度)×100％，空白组只加培养
液、噻唑蓝、二甲基亚砜，对照组药物浓度为零。重复噻唑蓝分析实验六次，结果见图5‑8，对
应的数据见表1‑表4。

[0044] 表1 U87MG细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)

[0045]

[0046]

[0047] 表2 HepG2细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)

[0048]

[0049] 表3 A549细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)

[0050]

[0051] 表4 Hela细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)

[0052]

[0053]

[0054] 从图中可以看出，在没有铜离子时，P1和阳性对照组5‑FU的细胞毒性相近，而有铜离子时，P1/Cu的细胞毒性明显增强，显著强于对照组5‑FU，说明P1在细胞内代谢产生5‑FU
和吡咯烷二硫代氨基甲酸盐，共同发挥抗肿瘤作用，吡咯烷基二硫代氨基甲酸盐与铜离子
形成螯合物使其抗肿瘤活性显著增强。

[0055] 实施例六 克隆形成实验

[0056] 各细胞传代之后于六孔板中铺肿瘤细胞(5000/孔)。24小时后待细胞贴壁恢复形态置换为等量的空白培养基或者含有不同浓度的P1/Cu的培养基孵育7 天。弃去上清，用1
×PBS洗2次洗去多余的培养基。用甲醇37℃固定30分钟，1×PBS洗去多余甲醇。1×结晶紫
染液(1mM)染30分钟，1×PBS洗去多余染液，拍照，结果见图9‑10，对应的数据见表5。

[0057] 本实施例中所用培养基和实施例五相同。

[0058] 表5 不同细胞在不同浓度下的克隆形成率(％)

[0059]

[0060] 从图中可以看出，随着浓度的增加，细胞克隆数逐渐减少，当浓度为62.5μM 时，细胞克隆数已接近为零，说明P1/Cu可通过抑制细胞增殖来发挥抗肿瘤作用。

[0061] 实施例七、Transwell实验

[0062] 各细胞传代之后用无血清培养基混悬肿瘤细胞并进行计数。在EP管中取无血清培养基配制成含0、15.625、31.25、62.5、125、250μM的P1/Cu的溶液，并加入适量细胞悬液，保
4
证每管细胞密度为1×10 /100μl，在Transwell板上室加入用无血清培养基配制成的细胞
悬液200μl，下室加入600μl含2％胎牛血清的培养基。放在培养箱培养(37℃，5％CO2)48小
时后，吸走上室的液体后将上室放在Calcein‑AM染料中染色30分钟。染色结束后用超纯水
洗去多余染液，并用棉签擦去上室上表面的细胞。将Transwell小室置于载玻片上用倒置荧
光显微镜拍照，结果见图11‑12。

[0063] 本实施例中所用培养基和实施例五相比，不含胎牛血清或含2％胎牛血清，其余均相同。即，本实施例加到Transwell板上室的为培养基+1％双抗溶液，不含胎牛血清；加到下
室的为培养基+1％双抗溶液+2％胎牛血清。

[0064] 从图中可以看出，随着浓度的增加，转移到transwell板上室下表面的细胞逐渐减少，这说明P1/Cu可通过降低肿瘤细胞的转移能力来发挥抗肿瘤作用。